力竭運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠腎臟的影響①

陳麗娜，周剛，吳樂(lè)，梅雨

力竭運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠腎臟的影響①

陳麗娜，周剛，吳樂(lè)，梅雨

目的觀察力竭運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠腎臟的影響及其機(jī)制。方法雄性Sprague-Dawley大鼠14只分為對(duì)照組（C組，n=7）和力竭運(yùn)動(dòng)組（E組，n=7）。測(cè)量定運(yùn)動(dòng)后大鼠尿蛋白、尿酸、葡萄糖，血尿素氮；熒光探針?lè)z測(cè)腎臟活性氧物質(zhì)（ROS），Western blotting檢測(cè)腎臟誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）、硝基酪氨酸（3-NT）和nephrin蛋白含量；Harris染色觀察腎組織形態(tài)變化。結(jié)果E組大鼠尿蛋白、尿酸、葡萄糖，血尿素氮，及腎ROS、iNOS、3-NT和nephrin蛋白含量均與對(duì)照組有顯著性差異（P＜0.05），腎小球形態(tài)改變，毛細(xì)血管基底膜增厚變形。結(jié)論力竭運(yùn)動(dòng)可通過(guò)氧化應(yīng)激機(jī)制，導(dǎo)致腎組織結(jié)構(gòu)損傷。

力竭運(yùn)動(dòng)；腎；活性氧物質(zhì)；nephrin；大鼠

［本文著錄格式］陳麗娜，周剛，吳樂(lè)，等.力竭運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠腎臟的影響［J］.中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐，2016，22（7）:789-792.

CITED AS:Chen LN，Zhou G，Wu L，et al.Effect of exhaustive exercise on kidney in rats［J］.Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian，2016，22（7）:789-792.

足細(xì)胞（pedocyte）是維持腎小球?yàn)V過(guò)屏障結(jié)構(gòu)和功能正常的主要細(xì)胞之一。足細(xì)胞足突緊鄰腎小球基底膜的裂孔隔膜，裂孔隔膜是腎小球?yàn)V過(guò)屏障通透性的關(guān)鍵屏障，裂孔蛋白與蛋白尿的產(chǎn)生密切相關(guān)［1］。nephrin是維持足細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的主要裂孔隔膜蛋白，nephrin缺乏可導(dǎo)致裂孔膜喪失。

目前對(duì)于病理性nephrin異常導(dǎo)致蛋白尿增加已有很多研究。本研究觀察大鼠力竭運(yùn)動(dòng)后腎組織腎小球細(xì)胞變化及nephrin蛋白表達(dá)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

PSF級(jí)雄性Sprague-Dawley大鼠14只，體質(zhì)量240～260 g，購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（湘）2011-0003。分籠飼養(yǎng)，每籠3～4只，飼養(yǎng)溫度20～25℃，自由進(jìn)食、飲水，自然晝夜光照。

大鼠正常飼養(yǎng)3 d后，按隨機(jī)數(shù)字表法分為安靜對(duì)照組（C組）和力竭運(yùn)動(dòng)組（E組），每組7只。

1.2運(yùn)動(dòng)方案

E組采用中等強(qiáng)度力竭跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)［2］。采用ZH-PT跑臺(tái)（淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司），先進(jìn)行適應(yīng)性運(yùn)動(dòng)3 d，速度5 m/min，無(wú)坡度，每天1次。正式運(yùn)動(dòng)3 d，從20 m/min、坡度5%、5 min開(kāi)始，逐漸增加至24 m/min、坡度10%，直到力竭。運(yùn)動(dòng)過(guò)程用電刺激進(jìn)行強(qiáng)迫，刺激強(qiáng)度＜1 mA。觀察到大鼠汗毛豎起，四肢癱軟，眼神無(wú)光，翻轉(zhuǎn)后無(wú)法進(jìn)行翻正反射，電刺激無(wú)法繼續(xù)運(yùn)動(dòng)即為達(dá)到力竭狀態(tài)。運(yùn)動(dòng)時(shí)間多為120～150 min。

1.3樣本的采集與處理

正式運(yùn)動(dòng)前2 d，運(yùn)動(dòng)后將大鼠置于代謝籠6 h禁食，收集尿液，檢測(cè)尿蛋白、尿糖、尿酸。最后一次力竭運(yùn)動(dòng)后立刻取樣。

1.3.1血液

末次運(yùn)動(dòng)后，大鼠立即腹腔注射10%水合氯醛350 mg/kg，待大鼠出現(xiàn)四肢無(wú)力、昏迷、心跳緩慢，掐尾部無(wú)反應(yīng)時(shí)取出。固定大鼠四肢，迅速自腹部向上剪開(kāi)胸腔，暴露心臟，5 ml一次性無(wú)菌注射器左心室取血，立刻測(cè)定血尿素氮、血糖。

1.3.2尿樣

前2次正式運(yùn)動(dòng)后置于代謝籠中禁食6 h，收集尿液，檢測(cè)尿糖、尿酸。末次運(yùn)動(dòng)取血后用微量注射器抽取膀胱尿液，分裝于試管中，檢測(cè)尿蛋白。

1.3.3腎組織

迅速取出兩側(cè)腎臟，冰上去除脂肪及結(jié)締組織，生理鹽水沖洗余血，濾紙吸干。左腎置于1.5 ml離心管，-20℃保存，以備制作顯微鏡切片；右腎立即密封放入-158℃液氮中冷凍，取出后保存在-80℃超低溫冰箱中以備勻漿。

稱(chēng)取右腎組織1 g左右冰上剪碎。每mg組織加入PBS勻漿液（pH=7.4，含5 mmol/L磷酸、250 mmol/L蔗糖、0.1 mmol/L乙二胺四乙酸、1 mmol/L苯甲基磺酰氟和1 mmol/L二硫蘇糖醇）10 μl，勻漿后分裝兩個(gè)離心管，一管以3000 r/min離心10 min，取上清液分裝后-80℃保存，用于活性氧物質(zhì)（reactive oxygen species，ROS）、蛋白定量測(cè)定；另一管以12，000 r/min離心25 min，取上清液分裝-80℃保存，用于誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、硝基酪氨酸（nitrotyrosine，3-NT）、nephrin測(cè)定。

1.4測(cè)量

1.4.1血尿生化

尿蛋白、尿素氮、尿酸試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所，葡萄糖試劑盒購(gòu)于上海榮盛生物藥業(yè)有限公司。常規(guī)測(cè)定。

1.4.2ROS

采用DCFH-DA熒光探針檢測(cè)［3］。試劑購(gòu)于碧云天生物技術(shù)研究所。96孔板中測(cè)定孔每孔加入腎組織勻漿液200 μl和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate，NADPH）100 μm，對(duì)照孔加入等量超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）及DCFH-DA 10μm，混勻，37℃恒溫孵育30 min，多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)485 nm，發(fā)射波長(zhǎng)525 nm。

1.4.3iNOS、3-NT、nephrin

采用Western blotting法，以磷酸甘油醛脫氫酶（glyceradehyde-3-phosphate dehydrogenas，GAPDH）為內(nèi)參。GAPDH抗體購(gòu)于杭州賢至生物科技有限公司，iNOS、nephrin抗體購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司，3-NT抗體購(gòu)于美國(guó)SIGMA-ALDRICH公司。

腎組織蛋白定量采用BCA蛋白濃度測(cè)定法，試劑盒購(gòu)于碧云天生物技術(shù)研究所。

采用ImageJ 1.43b軟件計(jì)算灰度值。

1.4.4腎組織形態(tài)

剪取左腎組織2.5～3.5 mm，除去多余組織及脂肪，置于樣品托，OCT包埋，PE鍵迅速冷凍，CM1850冷凍切片機(jī)切片，厚0.5μm。常規(guī)Harris染色，甲醛固定2 min，二甲苯透明10 min，無(wú)水乙醇、95%乙醇、80%乙醇、70%乙醇逐級(jí)脫水1 min，Harris蘇木紫染色10 min，1%酸性酒精脫色15 s，10× 40光學(xué)顯微鏡下觀察，攝片。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2結(jié)果

2.1血尿生化

與C組比較，E組尿糖、尿液尿酸升高（P＜0.05），尿蛋白、血尿素氮明顯升高（P＜0.01），血糖顯著降低（P＜0.001）。見(jiàn)表1。

2.2ROS

E組大鼠腎ROS較C組升高近5倍（P＜0.01）。見(jiàn)表1。

表1　　各組生化及蛋白表達(dá)比較

2.3iNOS、3-NT、nephrin

E組iNOS明顯升高（P＜0.01），3-NT含量明顯增加（P＜0.01），nephrin表達(dá)降低（P＜0.05）。

2.4形態(tài)學(xué)觀察

C組腎小球形態(tài)正常均勻，排列規(guī)則。E組腎小球球體肥大，分布減少；毛細(xì)血管基底膜增厚，系膜基質(zhì)增生。見(jiàn)圖1。

圖1　各組大鼠腎組織形態(tài)變化（Harris染色，400×）

3討論

腎小球?yàn)V過(guò)屏障主要由三層結(jié)構(gòu)組成，由內(nèi)向外分別為毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、腎小球基底膜以及足細(xì)胞。腎小球?yàn)V過(guò)膜中限制血漿蛋白通過(guò)的部位主要為腎小球基底膜和臟層上皮細(xì)胞，其中腎小球足細(xì)胞及其足突的裂孔隔膜是腎小球的最后一道濾過(guò)屏障，并起關(guān)鍵作用。裂孔隔膜的完整性是決定腎小球?yàn)V過(guò)屏障通透性的關(guān)鍵屏障，而裂孔隔膜上的裂孔蛋白與蛋白尿的發(fā)生密切相關(guān)［4］。近年關(guān)于足細(xì)胞裂孔蛋白的研究越來(lái)越受到重視，先后發(fā)現(xiàn)了nephrin、podocin、CD2相關(guān)蛋白等蛋白分子。其中nephrin在維持足細(xì)胞形態(tài)和足突裂孔隔膜的結(jié)構(gòu)和功能中起重要作用；nephrin表達(dá)變化也是蛋白尿生成的一個(gè)重要因素［5］。

已有研究表明，劇烈運(yùn)動(dòng)時(shí)血液重新分配，骨骼肌血流量增加，腎臟血流量降低。腎血流量減少導(dǎo)致腎小球?yàn)V過(guò)膜和近曲小管出現(xiàn)缺血性改變。扈詩(shī)興等發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期有氧訓(xùn)練可致腎組織濾過(guò)屏障產(chǎn)生適應(yīng)性變化，適應(yīng)增強(qiáng)腎臟功能；而過(guò)度訓(xùn)練使有孔內(nèi)皮變薄，足細(xì)胞足突融合成片，濾過(guò)屏障面積減小，形態(tài)結(jié)構(gòu)受損［6］。在糖尿病腎病模型中，足細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)異常可導(dǎo)致足細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的變化，而nephrin是足細(xì)胞損傷的早期標(biāo)志。FoxO1表達(dá)上調(diào)可以提高PCX、nephrin和desmin表達(dá)，并減少糖尿病大鼠腎小球足細(xì)胞損傷［7］。

運(yùn)動(dòng)性蛋白尿是腎功能不全的早期表現(xiàn)。運(yùn)動(dòng)后尿蛋白量可以作為評(píng)定運(yùn)動(dòng)員身體狀態(tài)和運(yùn)動(dòng)負(fù)荷的指標(biāo)。力竭運(yùn)動(dòng)，體內(nèi)糖原迅速消耗，腎小管重吸收功能下降，葡萄糖隨尿排出，而血糖迅速降低。鄭偉華等認(rèn)為，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后尿蛋白、尿酸陽(yáng)性更容易阻塞腎小管，引起腎內(nèi)梗阻，而導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)性腎損害發(fā)生［8］。均與本研究結(jié)果一致。

NADPH氧化酶大量表達(dá)于腎血管、腎小球系膜、足細(xì)胞致密斑、后升支段、遠(yuǎn)端小管和集合管內(nèi)。生理狀態(tài)下，NADPH氧化酶活性很低；而在各種生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、高血糖和脂質(zhì)代謝障礙的刺激下，NADPH氧化酶活性升高，導(dǎo)致氧化應(yīng)激，產(chǎn)生ROS。ROS屬于活性高的自由基，極不穩(wěn)定，可通過(guò)脂質(zhì)過(guò)氧化作用造成嚴(yán)重?fù)p害［9］。

ONOO-是酪氨酸硝基化形成的終末產(chǎn)物，是蛋白質(zhì)硝基化的特異性標(biāo)志物，是氧化應(yīng)激損傷的重要性環(huán)節(jié)［10］。由于ONOO-在體內(nèi)的半衰期極短，研究中通常采用其反應(yīng)物3-NT來(lái)替代。

本實(shí)驗(yàn)室前期研究已發(fā)現(xiàn)，力竭運(yùn)動(dòng)可致ROS生成增加，NADPH氧化酶抑制劑可明顯減少ROS的生成，從而減少ONOO-的生成。本研究同樣檢測(cè)到力竭運(yùn)動(dòng)后大鼠ROS明顯增加；同時(shí)大鼠腎組織iNOS、3-NT生成明顯增加。提示力竭運(yùn)動(dòng)可增加腎組織NADPH氧化酶活性，產(chǎn)生O2-，并與iNOS催化生成的NO反應(yīng)，產(chǎn)生大量的ONOO-。

有研究認(rèn)為，NADPH氧化酶4（NOX4）衍生的ROS增加在足細(xì)胞中起至關(guān)重要的作用，并在糖尿病患者的蛋白尿變化中至關(guān)重要。糖尿病誘導(dǎo)nephrin表達(dá)減少，足細(xì)胞損傷，與糖尿病型蛋白尿相關(guān)［11］。ROS通過(guò)增強(qiáng)NADPH氧化酶依賴(lài)的超氧陰離子生成，增加細(xì)胞色素P450 4A家族（CYP4A）和NADPH氧化酶表達(dá)，在糖尿病型足細(xì)胞損傷和蛋白尿的生成中發(fā)揮重要作用［12］。Whaley-Connell認(rèn)為，NADPH氧化酶活性增加，導(dǎo)致ONOO-生成增加，ONOO-形成穩(wěn)定的3-NT共軛分子，伴隨腎小球纖維化過(guò)程［13］。林喜秀等電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，急性力竭運(yùn)動(dòng)后，腎小球內(nèi)皮細(xì)胞腫脹、成對(duì)，胞質(zhì)連拱狀，基膜扭曲塌陷，足細(xì)胞胞體脫落，足突融合并出現(xiàn)變異，分布減少，濾過(guò)屏障結(jié)構(gòu)破壞明顯［14］?？赡芘cNOS的缺乏或過(guò)多表達(dá)有關(guān)。

本研究顯示，力竭運(yùn)動(dòng)致nephrin蛋白表達(dá)減少，ROS、iNOS增加，導(dǎo)致ONOO-生成增加，造成腎濾過(guò)屏障破壞，與運(yùn)動(dòng)性蛋白尿的生成密切相關(guān)。

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Effect of Exhaustive Exercise on Kidney in Rats

CHEN Li-na，ZHOU Gang，WU Le，MEI Yu
College of Sport，Hunan University，Changsha，Hunan 410082，China
Correspondence to ZHOU Gang.E-mail:zg460@126.com

Objective To observe the effect of exhaustive exercise on the function of the kidney in rats and explore the mechanism. Methods Fourteen male Sprague-Dawley rats were divided into sedentary control group（group C）and exhaustive exercise group（group E）. They were measured the urine protein，uric acid，glucose，and blood urea nitrogen after exercise.The reactive oxygen species，inducible nitric oxide synthase，nitro tyrosine in kidney，and nephrin protein in the kidney were detected with fluorescent probe and Western blotting，respectively，and observed under Harris staining.Results There were significant differences between groups C and E in urine protein，uric acid，glucose，blood urea nitrogen，reactive oxygen species，inducible nitric oxide synthase，nitrotyrosine and nephrin protein（P＜0.05）.The glomerular morphology and the deformation of capillary basement membrane were found under the fluorescence microscope in group E. Conclusion Exhaustive exercise may damage the structure of kidney in rats，which may associate with oxidative stress.

exhaustive exercise；kidney；reactive oxygen species；nephrin；rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2016.07.010

R873

A

1006-9771（2016）07-0789-04

湖南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No.12JJ3093）。

湖南大學(xué)體育學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙市410082。作者簡(jiǎn)介：陳麗娜（1990-），女，漢族，河南商城縣人，碩士研究生，主要研究方向：運(yùn)動(dòng)氧應(yīng)激。通訊作者：周剛，男，博士，副教授。E-mail:zg460@126.com。

2016-01-29

2016-03-14）