柚皮苷抑制黑色素瘤的生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移

郭冰玉, 張 宇, 回 薔, 常 鵬, 陶 凱

作者單位：110084 遼寧 沈陽(yáng),沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院 整形外科

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柚皮苷抑制黑色素瘤的生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移

郭冰玉, 張 宇, 回 薔, 常 鵬, 陶 凱

作者單位：110084 遼寧 沈陽(yáng),沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院 整形外科

目的 初步探索柚皮苷對(duì)黑色素瘤細(xì)胞生長(zhǎng)與遷移的抑制作用。方法 使用不同濃度的柚皮苷分別處理A375細(xì)胞，應(yīng)用MTT法檢測(cè)不同處理因素對(duì)A375細(xì)胞增殖的影響，利用TRANSWELL實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同處理因素對(duì)A375細(xì)胞遷移的作用。通過(guò)WESTERN BLOT及REAL-TIME PCR方法檢測(cè)不同因素作用下相關(guān)蛋白的變化。結(jié)果 不同濃度的柚皮苷對(duì)A375細(xì)胞增殖與遷移均有一定的抑制作用，其中10、20、40 μm/L柚皮苷作用24 h后，對(duì)A375細(xì)胞增殖的抑制率分別為(40.01±0.74)%、(48.69±3.66)%和(54.32±1.61)%。20、40 μm/L柚皮苷作用24 h后，對(duì)A375細(xì)胞遷移的抑制率分別為(18.44±3.89)%和(38.14±7.98)%。柚皮苷對(duì)A375細(xì)胞增殖與遷移功能的抑制作用隨著劑量增加。柚皮苷對(duì)調(diào)控細(xì)胞增殖、遷移的CDK4等蛋白均有抑制作用。結(jié)論 柚皮苷對(duì)黑色素瘤細(xì)胞A375細(xì)胞增殖與轉(zhuǎn)移均有抑制作用，可以作為臨床治療黑色素瘤的新的潛在藥物而進(jìn)一步研究。

黑色素瘤； 柚皮苷； 增殖； 遷移； A375

黑色素瘤的5年生存率不足10%，其致死率占皮膚腫瘤的首位[1]。近年來(lái)，黑色素瘤的發(fā)病率逐年升高，而不斷改進(jìn)的手術(shù)方案與化療措施并不能很好地提高患者的生存率[2]。很多報(bào)道指出，致癌基因的突變是黑色素瘤誘發(fā)的主要因素，因此，越來(lái)越多的靶向藥物研究進(jìn)入了人們的視線[3]。柚皮苷(naringin)是一種雙氫黃酮類(lèi)化合物，目前已被證明具有抗氧化、抗炎等多種生物學(xué)活性[4]。也有研究指出，柚皮苷是一種潛在的抗癌藥物，但作用機(jī)制并不明確[5]。柚皮苷已被證明可以抑制如乳腺癌、結(jié)腸癌、肝癌、肺癌、腸癌和卵巢癌等多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)與侵襲轉(zhuǎn)移[6]。自2015年6月至2016年1月，沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院整形外科以人黑色素瘤細(xì)胞A375作為研究對(duì)象，初步探索柚皮苷對(duì)于A375細(xì)胞增殖與遷移的影響，并且進(jìn)一步初探對(duì)其起作用的原因。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

人黑色素瘤A375細(xì)胞株(實(shí)驗(yàn)室凍存)；DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)INVITROGEN公司)；胎牛血清(天津?yàn)?；柚皮苷(美國(guó)SELLECK公司)；0.4 %臺(tái)盼藍(lán)，抗體： CDK4，CDK6，MMP2，MMP9和GAPDH(美國(guó)SANTA公司)；SYBR Green (美國(guó)PROMEGA公司)。

1.2 研究方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人黑色素瘤細(xì)胞A375使用含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2.2 藥物處理濃度 通過(guò)前期試驗(yàn)篩選，柚皮苷選取10、20、40 μm/L 3個(gè)濃度，使用生理鹽水配置；對(duì)照組使用生理鹽水處理。

1.2.3 MTT實(shí)驗(yàn) 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A375細(xì)胞以1×104每孔的密度接種于96孔板中，細(xì)胞培養(yǎng)12 h添加不同處理因素，每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)3個(gè)復(fù)孔。藥物處理后分別取0、12、24、36、48 h時(shí)間點(diǎn)添加5 mg/ml MTT 10 μl，孵育4 h后，小心吸去培養(yǎng)基，每孔中加入100 μl DMSO，溶解MTT-甲臜結(jié)晶，15 min后，在490 nm處記錄吸光值。

1.2.4 TRANSWELL實(shí)驗(yàn) 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞以1×105每孔的密度接種于TRANSWELL小室中，終體積200 μl，下室加入600 μl無(wú)血清培養(yǎng)基；12 h后更換培養(yǎng)基，使用不同藥物濃度處理細(xì)胞，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。藥物作用24 h后，棉簽擦去上層細(xì)胞，95%乙醇固定20 min，0.4%臺(tái)盼藍(lán)染色20 min。200倍顯微鏡下觀察。

1.2.5 WESTERN BLOT檢測(cè)蛋白表達(dá)水平 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞于6孔板中，貼壁培養(yǎng)12 h后，添加不同濃度的藥物進(jìn)行處理，藥物作用24 h后收集細(xì)胞，提取總蛋白；電泳、轉(zhuǎn)膜后，室溫封閉1 h；一抗4℃過(guò)夜。二抗室溫1 h。

1.2.6 REALTIME PCR檢測(cè)蛋白R(shí)NA表達(dá)水平 通過(guò)TRIZOL法提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行REALTIME PCR反應(yīng)。所用引物為CDK4,F(5′-3′):CTGGTGACAAGTGGTGGAAC;R(5′-3′):GGTCGGCTTCAGAGTTTCC;CDK6,F(5′-3′):GTCTGATTACCTGCTCCGC;R(5′-3′):CCTCGAAGCGAAGTCCTC;MMP2,F(5′-3′):CGCATCTGGGGCTTTAAAC;R(5′-3′):CAGCACAAACAGGTTGCAG;MMP9,F(5′-3′):CGACGTCTTCCAGTACCGAG;R(5′-3′):GTATCCGGCAAACTGGCT;GAPDH,F(5′-3′):CATCCCTTCTCCCCACACAC;R(5′-3′):AGTCCCAGGGCTTTGATTTG。

1.2.7 劃痕實(shí)驗(yàn) 在6孔板加入約5×105個(gè)細(xì)胞。第2天用槍頭比對(duì)著直尺劃痕，槍頭要垂直，不能傾斜。用PBS洗細(xì)胞3次，去除漂浮的細(xì)胞，加入無(wú)血清培養(yǎng)基。放入37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24 h時(shí)取樣，拍照。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度的藥物對(duì)A375細(xì)胞增殖的影響

對(duì)不同濃度的柚皮苷處理后，在不同的時(shí)間點(diǎn)下，通過(guò)MTT檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況(圖1)。結(jié)果顯示，柚皮苷可以抑制A375細(xì)胞的增殖。柚皮苷對(duì)A375細(xì)胞增殖的抑制作用隨著濃度的增加而增加(圖2)。

2.2 不同濃度的柚皮苷對(duì)A375細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白的影響

不同濃度的柚皮苷對(duì)CDK4和CDK6均有一定程度的抑制作用，隨著藥物濃度的升高抑制作用增強(qiáng)(圖3)。

2.3 不同濃度的柚皮苷對(duì)A375細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響

不同濃度的柚皮苷作用24 h后，對(duì)A375細(xì)胞的轉(zhuǎn)移功能均有一定程度的抑制，其抑制率隨著藥物濃度的增加而增加。通過(guò)transwell實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不同濃度的柚皮苷具有抑制A375細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用，隨著濃度的增高，抑制作用有所增強(qiáng)(圖4)。劃痕實(shí)驗(yàn)證實(shí)，柚皮苷處理后細(xì)胞遷移能力減慢。

2.4 不同濃度的柚皮苷對(duì)A375細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白的影響

不同濃度的柚皮苷對(duì)MMP2與MMP9均有一定程度的抑制作用，隨著藥物濃度的升高抑制作用增強(qiáng)(圖5～7)。

圖1 不同濃度柚皮苷處理后A375細(xì)胞的增殖情況 圖2 不同劑量柚皮苷對(duì)A375細(xì)胞增殖的抑制率 圖3 不同濃度柚皮苷作用下A375細(xì)胞蛋白的變化 圖4 不同劑量的柚皮苷作用下A375細(xì)胞的轉(zhuǎn)移情況 a. Nacl. b. 20 μm/L. c. 40 μm/L. 圖5 不同濃度柚皮苷作用下A375細(xì)胞蛋白的變化 圖6 不同濃度柚皮苷處理后A375細(xì)胞MMP2, MMP9的影響 圖7 不同濃度柚皮苷處理后A375細(xì)胞蛋白R(shí)NA水平的影響
Fig 1 The proliferation of A375cells treated by Naringin with different concentrations. Fig 2 The inhibition on A375 cell proliferation treated by Naringin with different concentrations. Fig 3 The changes of A375 proteins treated by Naringin with different concentrations. Fig 4 The migration of A375 cells treated by Naringin with different concentrations. a. Nacl. b. 20 μm/L. c. 40 μm/L. Fig 5 The proteins of A375 cells treated by Naringin with different concentrations. Fig 6 The MMP2 and MMP9 levels of A375 cells treated by Naringin with different concentrations. Fig 7 The RNA levels of A375 cells treated by Naringin with different concentrations.

3 討論

黑色素瘤具有惡性程度高、增殖快、易發(fā)生淋巴結(jié)等部位的遠(yuǎn)隔轉(zhuǎn)移等特點(diǎn)[7]。雖然近年來(lái)手術(shù)及各種放化療方法不斷改進(jìn)[8]，但黑色素瘤患者的生存率仍然不高。因此，尋找新的靶向藥物，針對(duì)黑色素瘤進(jìn)行靶向治療對(duì)于提高患者生存率有很大意義。

目前多種研究發(fā)現(xiàn)，中藥不僅對(duì)腫瘤細(xì)胞具有直接殺傷作用，還可以對(duì)抗放化療所產(chǎn)生的并發(fā)癥與不良反應(yīng)，而且中藥不易產(chǎn)生耐受現(xiàn)象，對(duì)身體不良反應(yīng)較小，因此，中藥是目前腫瘤治療研究的熱點(diǎn)。有報(bào)道指出在腫瘤患者的化療過(guò)程中，中藥的配合使用可以有效地減輕化療藥物導(dǎo)致的如惡心、嘔吐、食欲不振等不良反應(yīng)，從而提高患者的生活質(zhì)量，改善預(yù)后，延長(zhǎng)患者生存時(shí)間。柚皮苷全稱(chēng)為柚皮素-7-O-新橙皮糖苷，主要存在于蕓香科植物中，作為重要的有效成分已經(jīng)被報(bào)道對(duì)多種腫瘤有抑制作用。在結(jié)腸癌細(xì)胞中，柚皮苷可以通過(guò)調(diào)節(jié)p21蛋白的表達(dá)，抑制細(xì)胞的增殖。乳腺癌細(xì)胞中柚皮苷可以調(diào)節(jié)wnt通路抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)[9]。也有報(bào)道指出，柚皮苷可以降低基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移[10]。與此同時(shí)，柚皮苷也可以通過(guò)抑制c-src通路來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞的代謝水平，進(jìn)而通過(guò)抑制細(xì)胞的糖代謝，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)與侵襲轉(zhuǎn)移起到抑制作用[11]。

CDK4與CDK6是一類(lèi)絲/蘇氨酸蛋白激酶，可以與細(xì)胞周期素D結(jié)合，調(diào)節(jié)細(xì)胞G1/S期的轉(zhuǎn)換。CDK4與CDK6的特異性激活與腫瘤的增殖密切相關(guān)，人類(lèi)大約80%的腫瘤都存在CDK4/CDK6異常表達(dá)的現(xiàn)象[12]。CDK4/CDK6的異常表達(dá)，可以加速G1期的進(jìn)程，加速腫瘤細(xì)胞增殖，使腫瘤細(xì)胞獲得生存優(yōu)勢(shì)。因此，CDK4/CDK6已成為抗腫瘤的藥物靶點(diǎn)而被廣泛研究[13]。研究表明，CDK4/CDK6的靶向抑制劑具有較小的細(xì)胞毒性及較高的藥物敏感性[14]。腫瘤轉(zhuǎn)移的基本過(guò)程大致為：形成早期原發(fā)灶，生成相關(guān)血管，細(xì)胞脫落而侵入基質(zhì)，細(xì)胞進(jìn)入脈管系統(tǒng)而形成癌栓，進(jìn)一步生長(zhǎng)成轉(zhuǎn)移灶[15]?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)可以降解細(xì)胞外基質(zhì)，這是導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵蛋白酶。其中，MMP2和MMP9均屬于明膠類(lèi)基質(zhì)金屬蛋白酶，可以水解細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[16]。與此同時(shí)，MMP2與MMP9也可以啟動(dòng)血管基底膜的蛋白降解，為內(nèi)皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)移開(kāi)辟通路，進(jìn)一步促進(jìn)血管生成[17]。也有研究證明，MMP2與MMP9具有一定的生長(zhǎng)因子釋放功能[18]。因此，許多靶向藥物是通過(guò)抑制MMPs來(lái)對(duì)腫瘤起到抑制作用[19]。

本研究表明，不同濃度的柚皮苷對(duì)人黑色素瘤細(xì)胞A375均有一定程度的抑制作用，它可以抑制細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，柚皮苷在很低的濃度(40 μm/L)時(shí)，對(duì)細(xì)胞的抑制率可以達(dá)到50%。柚皮苷可以通過(guò)抑制CDK4/CDK6、MMP2和MMP9來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞增殖與轉(zhuǎn)移的抑制作用。

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Inhibition of Naringin in the growth and migration of melanoma

GUOBing-yu,ZHANGYu,HUIQiang,CHANGPeng,TAOKai.

(DepartmentofPlasticSurgery,TheGeneralHospitalofShenyangMilitaryRegion,Shenyang110084,China)

TAOKai，Email:13309887570@163.com

Objective To explore the effect of Naringin on the growth and migration of melanoma cells.Methods A375 cells were treated with Naringin at different concentrations, MTT assay was used to detect the influence on the proliferation of A375 cells; Transwell assay was used to detect the effect on migration. The proteins which were associated with proliferation and migration were detected by western blot and real-time PCR. Results Different concentrations of Naringin had certain inhibition on A375 cell proliferation and migration. The inhibition rates on A375 cell proliferation at 24 hours after treatment of 10 μm/L, 20 μm/L and 40 μm/L Naringin were (40.01±0.74)%， (48.69±3.66)% and (54.32±1.61)%, the inhibition rates on A375 cell migration at 24 hours after treatment of 20 μm/L and 40 μm/L Naringin were (18.44±3.89)% and (38.14±7.98)%. Inhibitions on A375 cells proliferation and migration were enhanced as the dose increased. At the same time Naringin can significantly inhibit the expression of the proteins which were associated with the cells proliferation and migration. Conclusion Naringin can inhibit the proliferation and migration of A375 cells, which means that it may provide a new strategy for the treatment of melanoma cancer.

Melanoma; Naringin; Proliferation; Migration; A375

郭冰玉(1989-)，女，遼寧沈陽(yáng)人，技師，碩士研究生.

陶 凱,110084,沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院 整形外科,電子信箱：13309887570@163.com

10.3969/j.issn.1673-7040.2016.08.019

R739.5

A

1673-7040(2016)08-0503-04

2016-05-16)