DEPTOR蛋白的表達(dá)純化條件及與mTOR-TRD2亞結(jié)構(gòu)域的相互作用

王　男, 程小桁, 鄭積敏, 陳光巨, 賈宗超

(1. 北京師范大學(xué)化學(xué)學(xué)院, 2. 生命科學(xué)學(xué)院, 北京 100875;3. 加拿大皇后大學(xué)生物醫(yī)學(xué)與分子科學(xué)學(xué)院, 金士頓 K7L3N6)

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DEPTOR蛋白的表達(dá)純化條件及與mTOR-TRD2亞結(jié)構(gòu)域的相互作用

王男1, 程小桁2, 鄭積敏1, 陳光巨1, 賈宗超3

(1. 北京師范大學(xué)化學(xué)學(xué)院, 2. 生命科學(xué)學(xué)院, 北京 100875;3. 加拿大皇后大學(xué)生物醫(yī)學(xué)與分子科學(xué)學(xué)院, 金士頓K7L3N6)

摘要測(cè)試并優(yōu)化了哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的FAT結(jié)構(gòu)域及其亞結(jié)構(gòu)域TRD2和DEPTOR蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)條件, 獲得了TRD2和DEPTOR蛋白成功表達(dá)并大量純化的條件. 結(jié)果表明, 麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)融合mTOR的TRD2亞結(jié)構(gòu)域可以在菌株BL21(DE3)中大量表達(dá). DEPTOR-G270P突變比野生型DEPTOR在BL21(DE3)中的表達(dá)量提高約5倍, 且該突變并不影響DEPTOR自身的二級(jí)結(jié)構(gòu). 通過凝膠過濾實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn), mTOR的TRD2亞結(jié)構(gòu)域和DEPTOR之間可能存在相互作用.

關(guān)鍵詞mTOR蛋白; TRD2亞結(jié)構(gòu)域; DEPTOR蛋白; G270P突變; 大腸桿菌表達(dá)

癌癥是人類健康的第一大殺手, 醫(yī)學(xué)工作者長(zhǎng)期致力于癌癥的誘因及其治療方法的研究. 據(jù)預(yù)測(cè), 2015年在發(fā)展中國(guó)家中將有900萬例因癌癥致死的病例, 其中我國(guó)占有相當(dāng)?shù)臄?shù)量[1～4]. 然而, 在過去50年中, 從分子層面上對(duì)腫瘤和癌癥的各項(xiàng)研究數(shù)據(jù)尚十分缺乏. 有關(guān)分子機(jī)制層面的研究數(shù)據(jù)集中在蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用并形成信號(hào)通路方面, 包括mTOR蛋白通路、PI3K/Akt蛋白通路、 細(xì)胞外信號(hào)調(diào)控激酶通路和細(xì)胞核因子kB通路等. 其中,mTOR蛋白通路的研究成果表明其與腫瘤的成因密切相關(guān), 而逐漸成為抗癌研究的熱門蛋白.

哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(MammaliantargetofRapamycin,mTOR)是一種存在于細(xì)胞質(zhì)中的高度保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶, 對(duì)細(xì)胞代謝的調(diào)控、 細(xì)胞的生長(zhǎng)及其它與激酶相關(guān)的生化過程具有重要調(diào)節(jié)作用[5,6].mTOR蛋白的正調(diào)控與負(fù)調(diào)控過程及其相關(guān)信號(hào)通路的激活與抑制與多種疾病有密切關(guān)系[7,8]. 因此, 對(duì)mTOR蛋白及其相關(guān)信號(hào)通路的研究將有助于了解癌癥等相關(guān)疾病的分子機(jī)制. 目前研究發(fā)現(xiàn),mTOR蛋白的抑制有利于腫瘤的治療[9]. 對(duì)于天然的內(nèi)源mTOR抑制劑, 其代表蛋白DEPTOR是由Sabatini等[5]發(fā)現(xiàn)的在多發(fā)骨髓瘤細(xì)胞中存在, 并對(duì)腫瘤細(xì)胞存活起重要作用的一類內(nèi)源mTOR抑制蛋白.

本文采用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)探索了mTOR蛋白的FAT結(jié)構(gòu)域及其各個(gè)片段的表達(dá)條件, 還探索了抑制劑DEPTOR蛋白的表達(dá)條件和純化條件; 嘗試借助基于DNA序列功能性突變的方法尋找二者能夠大量表達(dá)純化的最佳條件; 并以圓二色譜對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行了二級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)試表征, 初步探索了表達(dá)產(chǎn)物相互作用的能力, 為后續(xù)進(jìn)一步對(duì)mTOR及相關(guān)抑制劑的研究提供了幫助.

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1試劑與儀器

BL21(DE3)表達(dá)型菌株、TOP10克隆型菌株、ArcticExpress表達(dá)型菌株、pGEX系列質(zhì)粒及pET28a質(zhì)粒由加拿大皇后大學(xué)賈宗超教授課題組惠贈(zèng); 包含mTOR基因全長(zhǎng)的質(zhì)粒由加拿大皇后大學(xué)劉峰博士惠贈(zèng); 大腸桿菌TOP10和BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)于天根(TIANGEN)公司; 氨芐青霉素鈉(Amp)、 異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)、 二硫蘇糖醇(DTT)、 十二烷基硫酸鈉(SDS)、 三羥甲基氨基甲烷(Tris)、 甘氨酸、 乙二胺四乙酸(EDTA)和瓊脂糖粉劑購(gòu)于美國(guó)Amersco公司; 四甲基乙二胺(TEMED, 分析純)購(gòu)于香港FARCOChemical公司; 各類限制性內(nèi)切酶(BamHⅠ, XhoⅠ, NcoⅠ, EcoRⅠ和NotⅠ)購(gòu)于美國(guó)Fermentas公司;Ligation-High連接酶溶液購(gòu)于日本Toyobo公司; 丙烯酰胺(濃度0.3g/mL)/甲叉雙聚丙烯酰胺溶液(兩組分質(zhì)量比為29∶1)購(gòu)于美國(guó)Bio-Rad公司;Ni-NTA蛋白質(zhì)純化填料和谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(GST)蛋白質(zhì)純化填料購(gòu)于QIAGEN公司, 均由乙醇溶液(體積分?jǐn)?shù)20%)封裝保存.

SDS-PAGE及Western-Blot電泳系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司);AKTApurifier蛋白層析系統(tǒng)(配備Highloadsuperdex200蛋白層析柱, 美國(guó)GE公司);Chirascan圓二色譜儀(英國(guó)AppliedPhotophysics公司).

1.2實(shí)驗(yàn)過程

1.2.1mTOR蛋白的克隆構(gòu)建和表達(dá)篩選根據(jù)設(shè)計(jì)好的目標(biāo)DNA序列, 設(shè)計(jì)合適的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增反應(yīng)(PCR)引物(見表1, 不含酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基), 在PCR反應(yīng)管中加入mTORDNA模板1μL、 正、 反向引物各1.5μL(先用200μL超純水溶解引物)、Pfu酶預(yù)混液25μL和超純水21μL構(gòu)建PCR反應(yīng)體系. 將PCR管放入PCR儀中, 于94 ℃預(yù)變性5min;PCR循環(huán)為94 ℃保持1min, 55 ℃保持1min, 72 ℃保持xmin(x為目標(biāo)DNA序列堿基對(duì)數(shù)/1000, 如, 對(duì)于4000bp的DNA, x=4), 共循環(huán)25次; 之后于72 ℃保溫1min, 于4 ℃保存?zhèn)溆? 擴(kuò)增過程中引入BamHⅠ和EcoRⅠ/NotⅠ限制性內(nèi)切酶位點(diǎn), 以方便進(jìn)行限制性內(nèi)切酶的消化與連接等步驟.

Table 1　FAT domain and TRD2 subdomain PCR primer sequence

PCR反應(yīng)結(jié)束后, 用瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR反應(yīng)是否成功, 并用TIANGEN試劑盒回收PCR產(chǎn)物DNA(終體積50μL)備用. 在酶消化步驟中, 向PCR管中加入10μL回收后的PCR產(chǎn)物或6μL欲連接的質(zhì)粒, 根據(jù)引物中設(shè)計(jì)的內(nèi)切酶位點(diǎn)加入相應(yīng)的內(nèi)切酶各1μL, 加入超純水至體積為20μL, 放入37 ℃水浴中1h, 取出用TIANGEN試劑盒回收消化后的DNA與質(zhì)粒(終體積50μL)備用.DNA連接過程中, 取消化后的DNA產(chǎn)物10μL, 消化后的質(zhì)粒2μL和Ligation-High連接酶溶液6μL, 于16 ℃空氣浴中放置30min, 取出直接向TOP10感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)化(轉(zhuǎn)化方式見感受態(tài)細(xì)胞說明), 并涂布在相應(yīng)抗生素的平板上, 次日挑取單克隆菌并進(jìn)行DNA測(cè)序.

使用質(zhì)粒小提試劑盒從測(cè)序結(jié)果正確的菌液中提取相應(yīng)的質(zhì)粒, 將其轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中. 從相應(yīng)抗性篩選平板上挑取過夜培養(yǎng)的白色單一菌落, 接種到3mL含相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)液中, 于37 ℃以150r/min轉(zhuǎn)速培養(yǎng)過夜. 取過夜培養(yǎng)的菌液1mL, 接種到100mL含有相應(yīng)抗生素的無菌LB培養(yǎng)液中, 于37 ℃以150r/min轉(zhuǎn)速培養(yǎng)12h. 取20mL過夜培養(yǎng)的菌液, 接種到含有Amp(終濃度100μg/mL)的無菌LB培養(yǎng)液中, 于37 ℃以150r/min轉(zhuǎn)速培養(yǎng). 監(jiān)測(cè)菌液OD600值至0.8時(shí), 加入IPTG(終濃度0.1mmol/L)進(jìn)行誘導(dǎo). 于25 ℃以110r/min轉(zhuǎn)速再培養(yǎng)12h后, 用離心機(jī)以8000r/min轉(zhuǎn)速收菌. 將菌泥保存于-40 ℃?zhèn)溆?

純化蛋白時(shí), 向保存的菌泥中加入10mL/g破菌緩沖液, 攪勻后置于冰上, 加入200μL苯甲基磺酰氟溶液(PMSF, 100mmol/L)攪勻. 將冰盒放入超聲破碎儀, 超聲探頭置于液面以下1cm, 以40%儀器總功率, 頻率為10s/50s進(jìn)行破菌, 破菌時(shí)間為3min, 總時(shí)間為18min, 菌液由黏稠變澄清. 使用高速冷凍離心機(jī)以18000r/min轉(zhuǎn)速對(duì)破碎的菌液離心15min2次, 每次均收集上層清液并棄去沉淀部分, 置于冰盒中保持低溫并轉(zhuǎn)移至4 ℃環(huán)境中. 取體積為1mL的Ni-NTA蛋白純化填料加入小層析柱中, 待填料中的乙醇流盡后, 用10mL超純水沖洗, 再用咪唑溶液(20mmol/L)沖洗5個(gè)柱體積進(jìn)行柱平衡. 將上層清液逐漸加入層析柱, 收集30μL流穿液作為SDS-PAGE電泳檢測(cè)樣品. 用100mL緩沖液進(jìn)行沖洗, 洗掉結(jié)合力弱的雜蛋白. 收集30μL沖洗液作為SDS-PAGE電泳檢測(cè)樣品. 用15mL咪唑溶液緩沖液(200mmol/L)進(jìn)行洗脫并全部收集, 取30μL洗脫液和30μL洗脫后的Ni-NTA填料作為SDS-PAGE電泳檢測(cè)樣品. 采用Bradford法檢測(cè)洗脫液蛋白濃度, 并以SDS-PAGE電泳對(duì)以上樣品進(jìn)行檢測(cè).

1.2.2DEPTOR蛋白的克隆構(gòu)建、 表達(dá)純化和產(chǎn)物的二級(jí)結(jié)構(gòu)鑒定大腸桿菌中DEPTOR蛋白的克隆構(gòu)建及表達(dá)純化過程與mTOR蛋白質(zhì)的克隆構(gòu)建表達(dá)純化過程基本一致, 所使用的引物序列見表2(不含酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基).

Table 2　DEPTOR PCR Primer and G270P Mutation Primer Sequence

凝膠過濾實(shí)驗(yàn)開始前, 用截留分子量為30000的超濾管對(duì)蛋白洗脫液進(jìn)行濃縮, 并緩慢加入凝膠過濾緩沖液, 繼續(xù)濃縮蛋白溶液至終體積為1mL. 在AKTApurifier上用凝膠過濾緩沖液對(duì)HighLoadSuperdex200層析柱進(jìn)行平衡, 平衡體積120mL, 報(bào)警壓0.5MPa, 流速1mL/min. 平衡完成后, 將1mL濃縮蛋白溶液用注射器打入上樣環(huán), 運(yùn)行AKTA系統(tǒng), 報(bào)警壓強(qiáng)為0.5MPa, 流速為1mL/min, 體積為120mL. 外水(40mL)后, 以2mL每管對(duì)流出液進(jìn)行收集. 收集出峰位置的流出液并進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)以確定表達(dá)產(chǎn)物的分子量.在產(chǎn)物的鑒定步驟中, 取200μL純化后的DEPTOR蛋白溶液, 用圓二色譜儀掃描180～260nm處的圓二色譜信號(hào), 并使用儀器附帶的分析軟件計(jì)算待測(cè)產(chǎn)物的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量的測(cè)定值, 同時(shí)將DEPTOR蛋白一級(jí)序列上傳至在線Jpred服務(wù)器(http://www.compbio.dundee.ac.uk/jpred/), 使用多種二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)算法來預(yù)測(cè)DEPTOR各個(gè)二級(jí)結(jié)構(gòu)的理論含量. 將理論值與實(shí)驗(yàn)測(cè)定值作對(duì)比, 即可得到表達(dá)產(chǎn)物的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量, 從而推知其折疊是否完好.

2結(jié)果與討論

2.1mTOR蛋白的TRD2亞結(jié)構(gòu)域與MBP的融合蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)

Fig.1　Sub-domains of mTOR FAT domain The 0—600 number suggests amino acids numbers in primary structure.

實(shí)驗(yàn)中對(duì)獲得的人源mTOR基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增后, 利用瓊脂糖電泳凝膠分離, 用以鑒定PCR實(shí)驗(yàn)是否成功并回收PCR產(chǎn)物. 由圖S1結(jié)果(見本文支持信息)可知, 在退火溫度為55 ℃時(shí), 產(chǎn)物均有明亮的條帶, 并且與標(biāo)準(zhǔn)Marker對(duì)照判讀出其堿基數(shù)約為2000, 符合FAT基因1860堿基對(duì)數(shù)的理論值, 這說明對(duì)目標(biāo)基因的PCR擴(kuò)增是成功的. 抽取少量菌液為模板做PCR驗(yàn)證,PCR體系構(gòu)建與實(shí)驗(yàn)步驟相同, 并用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)驗(yàn)證結(jié)果. 由圖S2結(jié)果(見本文支持信息)可知, 標(biāo)有GST的樣品均在目標(biāo)堿基對(duì)數(shù)的位置處出現(xiàn)了明顯條帶, 表明連接產(chǎn)物中已引入FAT的目標(biāo)DNA, 即FAT結(jié)構(gòu)域基因已經(jīng)與pGEX-6P-1組成重組質(zhì)粒. 用相同方法將FAT基因引入pET28b質(zhì)粒中構(gòu)建成所需的克隆, 同時(shí)根據(jù)文獻(xiàn)[10]方法將FAT結(jié)構(gòu)域按照TRD2,TRD3,HRD及其組合分割為各個(gè)功能性截?cái)? 總計(jì)分為TRD2,TRD3,HRD,TRD2-3,TRD3-HRD和TRD2-HRD5段(圖1), 構(gòu)建出這些片段與pET28b質(zhì)粒連接的克隆.

將重組質(zhì)粒抽提并轉(zhuǎn)化入BL21(DE3)等多種感受態(tài)細(xì)胞中, 設(shè)置對(duì)照組嘗試進(jìn)行FAT結(jié)構(gòu)域的小量表達(dá), 并以使用GST標(biāo)簽抗體的Western-Blot技術(shù)對(duì)表達(dá)結(jié)果進(jìn)行鑒定.結(jié)果[圖2(A)]顯示,FAT-GST在JM109菌株中能夠以較大量的包涵體的表達(dá)形式出現(xiàn), 且主要條帶位于正確分子量的位置(92000). 這可能是FAT-GST分子量過大(已超過90000), 超過了一般大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)對(duì)蛋白的正確折疊修飾所致. 因此, 對(duì)FAT結(jié)構(gòu)域進(jìn)行適當(dāng)截?cái)? 使表達(dá)產(chǎn)物能夠溶解, 并進(jìn)一步增加蛋白的表達(dá)量是一項(xiàng)重要工作. 上述5個(gè)FAT結(jié)構(gòu)域的片段經(jīng)過與pET28b連接構(gòu)成重組質(zhì)粒后, 同樣嘗試進(jìn)行了表達(dá), 但均未成功.

根據(jù)文獻(xiàn)[11～14]對(duì)mTOR蛋白的報(bào)道以及對(duì)同源蛋白ATM類激酶和ATR類激酶的類比研究[15～17], 推斷表達(dá)不成功可能是由于mTOR蛋白作為PKC(蛋白激酶C)類蛋白, 其FAT結(jié)構(gòu)域自身與其它部分以疏水表面結(jié)合[18,19], 直接表達(dá)FAT結(jié)構(gòu)域可能使疏水表面暴露而導(dǎo)致表達(dá)產(chǎn)物受到降解. 因此, 考慮使用麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)與FAT的這些截?cái)嘞嗷ト诤? 構(gòu)建融合蛋白以增加其溶解性. 將融合蛋白引入大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)篩選后, 在BL21(DE3)中,MBP-TRD2能夠產(chǎn)生大量的可溶性表達(dá)[圖2(B)], 并且能夠用Ni-NTA純化填料進(jìn)行純化.

Fig.2　FAT domain and subdomain expression assay in E.coli (A) FAT-GST fusion protein in JM109 expression assay by Western-Blot, lane 1: negative control (incubate without adding IPTG), lane 2: whole-cell-extract after induced by 1 mmol/L IPTG, lanes 3, 4: supernatant/pellet of whole-cell-extract lysate. (B) MBP fusion TRD2 protein in BL21(DE3) expression assay by SDS-PAGE(Ft: flow-through; W: wash; E: eluted protein).

2.2DEPTOR蛋白G270P突變體表達(dá)純化結(jié)果優(yōu)于野生型

實(shí)驗(yàn)中對(duì)購(gòu)得的人源DEPTOR基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增后, 利用瓊脂糖電泳凝膠分離, 用以鑒定PCR實(shí)驗(yàn)是否成功并回收PCR產(chǎn)物. 結(jié)果表明, 退火溫度在55～64 ℃任何梯度下, 產(chǎn)物均有明亮的條帶, 并且與標(biāo)準(zhǔn)Marker對(duì)照判讀出其堿基數(shù)約為1200, 符合DEPTOR基因1230堿基對(duì)數(shù)的理論值, 說明對(duì)目標(biāo)基因的PCR擴(kuò)增是成功的.抽取少量菌液為模板做PCR驗(yàn)證,PCR體系構(gòu)建與實(shí)驗(yàn)步驟相同, 并用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)驗(yàn)證結(jié)果. 由圖S3結(jié)果(見本文支持信息)可知, 2個(gè)樣品均在目標(biāo)堿基對(duì)數(shù)的位置處出現(xiàn)了明顯條帶, 表明連接產(chǎn)物中已引入DEPTOR的目標(biāo)DNA.即DEPTOR全長(zhǎng)已經(jīng)與pGEX-6P-1組成重組質(zhì)粒.

利用TIANGENDNA少量提取試劑盒抽取重組質(zhì)粒, 并轉(zhuǎn)化入BL21(DE3)表達(dá)菌株中, 設(shè)置37 ℃(體溫)和25 ℃(室溫)2個(gè)表達(dá)溫度進(jìn)行蛋白質(zhì)的少量表達(dá). 由SDS-PAGE圖S4結(jié)果(見本文支持信息)可知, 在37和25 ℃ 2種表達(dá)條件下,DEPTOR-GST融合蛋白均有明顯的表達(dá), 并且能夠以可溶的形式出現(xiàn)在裂解液中(裂解液含有50mmol/LTris和300mmol/LNaCl,pH=8.0), 且分子量處于正確的位置(GST分子量為26000,DEPTOR理論分子量為44000, 相加約為70000,SDS-PAGE中條帶位置在72000處). 但是, 在這2個(gè)條件下對(duì)DEPTOR-GST融合蛋白大量表達(dá)并使用GST親和純化填料對(duì)其進(jìn)行純化后, 在上層清液中檢測(cè)到極少量的目標(biāo)蛋白, 而在流穿液中檢測(cè)到較大量的目標(biāo)蛋白, 表明DEPTOR-GST融合蛋白與純化填料的結(jié)合能力較差, 這可能是DEPTOR的某些蛋白序列或結(jié)構(gòu)干擾了GST的正常折疊所致.

鑒于DEPTOR-GST融合蛋白的大量表達(dá)存在溶解困難的問題, 嘗試使用His融合標(biāo)簽(多聚組氨酸)來表達(dá)DEPTOR蛋白. 通過使用連接酶將目標(biāo)基因與pET28b質(zhì)粒進(jìn)行連接, 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入TOP10感受態(tài)細(xì)胞中并挑取克隆進(jìn)行PCR驗(yàn)證. 由圖S5結(jié)果(見本文支持信息)可知, 全部樣品中均引入了DEPTOR外源基因, 表明DEPTOR與pET28b成功結(jié)合成重組質(zhì)粒.設(shè)置對(duì)照組嘗試進(jìn)行DEPTOR蛋白的小量表達(dá), 并以使用His標(biāo)簽抗體的Western-Blot技術(shù)對(duì)表達(dá)結(jié)果進(jìn)行鑒定.結(jié)果[圖3(A)]顯示,DEPTOR在BL21(DE3)中能夠?qū)崿F(xiàn)大量的可溶性表達(dá), 且主要條帶位于正確分子量的位置; 而由重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入ArcticExpress感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)嘗試的結(jié)果[圖3(B)]可知,DEPTOR在ArcticExpress菌種中能夠獲得比BL21(DE3)較少降解的可溶性表達(dá), 且主要條帶位于正確分子量的位置, 但是蛋白質(zhì)的表達(dá)量較低. 這可能是由于ArcticExpress在16 ℃時(shí)工作所致.使用BL21(DE3)菌株進(jìn)行DEPTOR蛋白的大量表達(dá), 并用Ni-NTA填料進(jìn)行蛋白純化, 同時(shí)以SDS-PAGE對(duì)表達(dá)結(jié)果進(jìn)行鑒定. 結(jié)果[圖3(C)]顯示, 使用BL21(DE3)表達(dá)菌在表達(dá)DEPTOR時(shí)出現(xiàn)了較大量的雜帶, 這可能是由于DEPTOR不適應(yīng)BL21(DE3)表達(dá)菌的環(huán)境而發(fā)生了降解所致.

Fig.3　DEPTOR expression assay in E.coli All the lanes are samples from each purification step, respectively. (A) DEPTOR-His wild-type expression assay by Western-Blot in BL21(DE3); (B) DEPTOR-His wild-type expression assay by Western-Blot in arctic express; (C) DEPTOR-His wild-type expression assay by SDS-PAGE in BL21(DE3); (D) DEPTOR-His G270P expression assay by SDS-PAGE; (E) DEPTOR-His G270P expression assay by SDS-PAGE with glycerol(10%, volume fraction) in purification buffer. P: pellet; S: supernatant; Cell: whole-cell-extract; Control: cell without induced by IPTG; Ft: flow-through; W1, W2: wash; E, E1 and E2: eluted protein; R: resin after elution.

通過比較, 選擇使用表達(dá)量相對(duì)較高的BL21(DE3)來實(shí)現(xiàn)DEPTOR蛋白的大量表達(dá).SDS-PAGE結(jié)果顯示的DEPTOR主要條帶(分子量45000處)下方的伴生雜帶主要位于分子量34000處, 并且一部分DEPTOR蛋白不能從純化填料上被洗脫下來, 表現(xiàn)出明顯的變性特征. 經(jīng)過生物質(zhì)譜鑒定, 這些分子量為34000的伴生雜帶也屬于DEPTOR蛋白, 表明這是DEPTOR蛋白的降解產(chǎn)物.部分蛋白質(zhì)在表達(dá)過程中的折疊存在問題, 使得蛋白質(zhì)發(fā)生部分降解, 并且出現(xiàn)許多與純化填料的非正常相互作用. 而由Western檢測(cè)結(jié)果可知, 分子量34000處的伴生雜帶并不含有His標(biāo)簽, 而分子量20000處的少量雜帶則表現(xiàn)出明顯的His標(biāo)簽反應(yīng)(見本文支持信息圖S6), 表明其含有His標(biāo)簽.SDS-PAGE與Western檢測(cè)結(jié)果結(jié)表明,DEPTOR可能在接近C端的位置發(fā)生了降解. 文獻(xiàn)[20]報(bào)道DEPTOR的Loop-rich區(qū)中含有能夠被降解的GSSG模體, 這可能是導(dǎo)致DEPTOR表達(dá)量不夠高且容易產(chǎn)生降解的原因.

為了降低DEPTOR蛋白在大腸桿菌中的降解, 增加表達(dá)量, 引入G270P突變以減少GSSG模體的降解效應(yīng), 同時(shí)通過脯氨酸自身對(duì)肽鏈二面角的限制, 穩(wěn)定Loop-rich結(jié)構(gòu)域. 結(jié)果[圖3(D)]表明,DEPTOR-G270P的表達(dá)量與野生型DEPTOR相比增加了3～5倍, 根據(jù)Bradford檢測(cè)結(jié)果可知, 該表達(dá)量達(dá)到了每升培養(yǎng)基15～20mg蛋白, 遠(yuǎn)高于野生型DEPTOR在相同條件下每升培養(yǎng)基3～5mg蛋白的表達(dá)量.

DEPTOR蛋白純化條件的改進(jìn)一直是研究熱點(diǎn). 經(jīng)過對(duì)純化條件的篩查發(fā)現(xiàn), 使用4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES, 工作濃度20mmol/L,pH=7.0),NaCl(150mmol/L)并混合入甘油(體積分?jǐn)?shù)10%)作為破菌緩沖液進(jìn)行DEPTOR-G270P蛋白的純化過程, 所得的蛋白質(zhì)雜質(zhì)相對(duì)含量最少[圖3(E)]. 這是由于甘油所含的羥基與DEPTOR蛋白的富絲氨酸結(jié)構(gòu)域側(cè)鏈含有的大量羥基[5]具有親和性, 能夠促進(jìn)DEPTOR蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性, 減少其變性或降解等問題.

使用Hiload-S200凝膠過濾柱對(duì)獲得的DEPTOR溶液進(jìn)行凝膠過濾對(duì)蛋白質(zhì)按照分子量進(jìn)行分離, 用以鑒定蛋白質(zhì)在溶液中以何種分散形式存在, 并去掉蛋白質(zhì)中的高聚體.由圖S7結(jié)果(見本文支持信息)可知, 高聚體位于6和7號(hào)管中, 根據(jù)SDS-PAGE的結(jié)果估算, 高聚體約占DEPTOR總量的20%; 13和14號(hào)管中的蛋白溶液為DEPTOR寡聚體, 約占20%; 而剩余的16～19號(hào)管中的蛋白溶液為DEPTOR二聚體或單體, 這部分約占蛋白質(zhì)總量的60%.

由DEPTOR野生型及G270P突變體的圓二色譜分析結(jié)果(表3和表4)可知, 無論野生型還是G270P突變體, 其圓二色譜結(jié)果均顯示表達(dá)產(chǎn)物含有約30%的α螺旋結(jié)構(gòu)及約15%的β片層結(jié)構(gòu), 剩余約55%的結(jié)構(gòu)為β轉(zhuǎn)角及無規(guī)卷曲部分. 這與Jpred服務(wù)器使用各種預(yù)測(cè)算法對(duì)DEPTOR蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果相吻合(預(yù)測(cè)該蛋白含有約25%～30% α螺旋結(jié)構(gòu), 含10%～15% β片層結(jié)構(gòu), 剩余為β轉(zhuǎn)角及無規(guī)卷曲). 由此可見, 使用大腸桿菌進(jìn)行DEPTOR的表達(dá), 其產(chǎn)物二級(jí)結(jié)構(gòu)折疊良好, 且G270P突變并未造成二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化.

Table 3　Percentage of secondary structure in DEPTOR-wt*

*ResultsarethepercentageofeachsecondarystructurecalculatedfromCDspectra.

Table 4　Percentage of secondary structure in DEPTOR-G270P*

*ResultsarethepercentageofeachsecondarystructurecalculatedfromCDspectra.

Fig.4　Location of TRD2 subdomain in mTOR-FAT domain(circle)

根據(jù)TRD-2在整個(gè)FAT結(jié)構(gòu)域中的位置(圖4)可知,TRD-2可能與DEPTOR的Loop-rich結(jié)構(gòu)域發(fā)生相互作用. 因此, 將MBP-TRD2與DEPTOR以相同的緩沖液純化后混合, 并使用AKTA系統(tǒng)進(jìn)行凝膠過濾, 觀察二者是否發(fā)生峰形重疊的現(xiàn)象, 即可知二者是否存在相互作用. 結(jié)果(圖5)表明, 二者峰形發(fā)生了不同程度的重疊, 并且對(duì)重疊峰形部分進(jìn)行SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn),MBP-TRD2與DEPTOR的用量比約為1∶1, 是典型的復(fù)合物形成標(biāo)志, 因此猜測(cè)TRD2與DEPTOR能夠形成1∶1的復(fù)合物.

Fig.5　Interaction assay of MBP-TRD2 and DEPTOR (A) MBP-TRD2 and DEPTOR co-purification by gel-filtration (Hi-Load S200) in 20 mmol/L Tris, pH=8.0 and 150 mmol/L NaCl; (B) MBP and DEPTOR co-purification by gel-filtration in the same condition as a negative control. Samples of the putative complexes are picked and analyzed by SDS-PAGE. In each figure, x-axis indicates the elution volume which reflects molecular mass of the protein and y-axis indicates the absorption value which is in direct proportion to protein concentration.

3結(jié)論

研究表明,mTOR的TRD2亞結(jié)構(gòu)域可以通過與MBP蛋白的融合而依靠大腸桿菌表達(dá)體系實(shí)現(xiàn)大量的可溶性表達(dá).DEPTOR蛋白表達(dá)純化的優(yōu)化過程表明, 使用大腸桿菌體系對(duì)DEPTOR蛋白的足量表達(dá)可對(duì)降解模體進(jìn)行G270P點(diǎn)突變, 同時(shí)在純化過程中引入甘油(體積分?jǐn)?shù)10%), 在相同條件下可使DEPTOR蛋白的表達(dá)量提高3～5倍, 且純度也得以提高. 而DEPTOR與MBP-TRD2的柱上結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,FAT結(jié)構(gòu)域能夠直接與DEPTOR相互作用, 也說明了FAT結(jié)構(gòu)域中的TRD2亞結(jié)構(gòu)域在某種條件下能夠與DEPTOR相互作用, 這為mTOR和DEPTOR整體相互作用的研究和mTOR的內(nèi)源活性調(diào)控[21]以及癌癥信號(hào)通路的抑制[22,23]提供了實(shí)驗(yàn)方面的研究數(shù)據(jù).

支持信息見http://www.cjcu.jlu.edu.cn/CN/10.7503/cjcu20150817.

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(Ed.:P,H,V,K)

?SupportedbytheNationalNaturalScienceFoundationofChina(Nos.21131003, 21073015, 21273023).

doi:10.7503/cjcu20150817

收稿日期:2015-10-23. 網(wǎng)絡(luò)出版日期: 2016-04-18.

基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金(批準(zhǔn)號(hào): 21131003, 21073015, 21273023)資助.

中圖分類號(hào)O629; Q516

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

ExpressionandPurificationofDEPTORandItsInteractionwithmTOR-TRD2?

WANGNan1,CHENGXiaoheng2,ZHENGJimin1*,CHENGuangju1,JIAZongchao3

(1. School of Chemistry, 2. School of Life Science, Beijing Normal University, Beijing 100875, China;3. Department of Biomedical and Molecular Sciences, Queen’s University, KingstonK7L3N6, Canada)

AbstractThe inhibition of mammalian target of rapamycin(mTOR) is important to cancer treatment. DEPTOR is currently known as an endogenous mTOR inhibitor and could interact with mTOR FAT domain to suppress mTOR activity in vivo. It showed that MBP fusion mTOR TRD2 subdomain could be expressed in BL21(DE3) with conversional protocol and DEPTOR-G270P mutation could be expressed 5-fold more than wild-type DEPTOR in BL21(DE3). Adding glycerol(volume fraction 10%) in purification buffer would improve DEPTOR-G270P purity. CD spectra assay showed that this purification protocol could produce DEPTOR in large quantity without affecting its secondary structure. Gel-filtration assay indicated possible interactions between mTOR-TRD2 subdomain and DEPTOR, which may provide insights into mTOR-DEPTOR interaction and give new information about mTOR inhibition.

KeywordsMammalian target of rapamycin(mTOR); TRD2 subdomain; DEPTOR; G270P mutation; Escherichia coli expression

聯(lián)系人簡(jiǎn)介: 鄭積敏, 男, 博士, 教授, 博士生導(dǎo)師, 主要從事磷酸化蛋白質(zhì)及鈣調(diào)蛋白的結(jié)構(gòu)與功能研究.

E-mail:jimin_z@bnu.edu.cn