低頻脈沖超聲聯(lián)合微泡對在體微小血管作用的實(shí)驗(yàn)研究

衛(wèi)荊璐　余美玲　韋英麗　肖妮娜　柳建華

廣州市第一人民醫(yī)院超聲醫(yī)學(xué)科(廣州 510180)

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低頻脈沖超聲聯(lián)合微泡對在體微小血管作用的實(shí)驗(yàn)研究

衛(wèi)荊璐余美玲韋英麗肖妮娜柳建華

廣州市第一人民醫(yī)院超聲醫(yī)學(xué)科(廣州 510180)

【摘要】目的探討低頻脈沖超聲聯(lián)合微泡對微血管的滲出作用。方法20只新西蘭大白兔分為4組：空白組、單純微泡組、單純超聲組、超聲微泡組，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)觀察。用頻率為1 MHz，聲壓2000 MPa的脈沖超聲輻照兔腸系膜及腸壁血管，在熒光顯微鏡下觀察輻照前后腸系膜及腸壁上微血管的損傷，并靜脈注入伊文思藍(lán)溶液，觀察超聲輻照后對伊文思藍(lán)溶液的滲出。結(jié)果空白組、單純微泡組、單純超聲組在超聲輻照后腸系膜及腸壁上微血管內(nèi)血流通暢，注入伊文思藍(lán)溶液后，微血管內(nèi)呈藍(lán)色染色，血管周圍未見滲出；超聲微泡組在超聲輻照后微血管周圍可見滲出，部分形成血腫。結(jié)論低頻脈沖超聲聯(lián)合微泡對微小血管管壁產(chǎn)生損傷作用，血管周圍可見滲出，部分形成血腫。

【關(guān)鍵詞】超聲治療微泡腸系膜微血管滲出

超聲聯(lián)合微泡誘發(fā)血管損傷可以產(chǎn)生多種生物效應(yīng)，低能量超聲誘導(dǎo)微泡會(huì)產(chǎn)生血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、內(nèi)皮細(xì)胞間隙增寬、血管壁通透性增高、細(xì)胞死亡，紅細(xì)胞溢出[1]，高能量超聲誘導(dǎo)微泡會(huì)產(chǎn)生血管變形甚至破裂[2-3]、血管周圍組織細(xì)胞水腫甚至變性、小血管內(nèi)血栓形成[4]。

超聲聯(lián)合微泡誘發(fā)血管損傷在過去幾年中被廣泛研究，但機(jī)制研究較缺乏，多數(shù)在于離體細(xì)胞水平或者模擬血管，以細(xì)胞水平的研究為主。這幾年隨著攝像技術(shù)的發(fā)展，使用高速攝像顯微鏡觀察單個(gè)微泡空化效應(yīng)對內(nèi)皮細(xì)胞膜的損傷，從而研究超聲激勵(lì)的微泡對細(xì)胞的作用機(jī)制，研究著重在穩(wěn)態(tài)空化的作用，對于血管的是輕微的可逆的損傷作用。本文主要研究超聲聯(lián)合微泡在體腸系膜及腸壁微血管的損傷作用，更直觀的觀察低頻高負(fù)值峰壓超聲誘導(dǎo)微泡對在體微血管壁的滲出作用。

1材料與方法

1.1超聲治療儀超聲治療儀是深圳市威爾德醫(yī)療電子有限公司提供，電源聲壓為AC100 V-240 V，波形具有連續(xù)和脈沖模式可選擇。治療超聲換能器的直徑約2.3 cm，由鋁殼以及聚酰胺膜材質(zhì)的接觸面組成，通過聲發(fā)生器與峰值電壓發(fā)射器來驅(qū)動(dòng)。本實(shí)驗(yàn)所選用的參數(shù)為非聚焦脈沖波，探頭頻率為1.0 MHz，聲壓2000 Kpa，脈沖重復(fù)頻率為50 Hz，占空比為0.5%，脈沖持續(xù)時(shí)間9 s，間歇時(shí)間為3 s，治療時(shí)間5 min。

1.2脂氟顯微泡懸液脂氟顯微泡懸液，由第三軍醫(yī)大學(xué)附屬新橋醫(yī)學(xué)超聲科制作，為第二代造影劑。外觀為乳白色的凝乳狀，粒徑平均值為2.13 μm，濃度為4～9×109/mL。本實(shí)驗(yàn)治療所用的劑量為0.2 mL/kg，使用前需振動(dòng)45 s。

1.3動(dòng)物準(zhǔn)備健康新西蘭大白兔20只，質(zhì)量約2.0～2.5 kg，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。所有的實(shí)驗(yàn)過程均獲得廣州市第一人民醫(yī)院倫理委員會(huì)的許可。所有實(shí)驗(yàn)大白兔術(shù)前禁食12 h，可自由飲水。實(shí)驗(yàn)用新西蘭大白兔先使用速眠新Ⅱ注射液(由吉林省敦化市圣達(dá)動(dòng)物藥品有限公司生產(chǎn))0.2 mL/kg進(jìn)行肌肉注射，等待兔子初步麻醉后，使用21G針管插入實(shí)驗(yàn)兔左耳的耳緣靜脈建立靜脈通道，使用2.5%戊巴比妥鈉(1.0 mL/kg)麻醉。室溫保持在25 ℃左右，濕度在40%～60%之間，并且維持動(dòng)物在深度麻醉下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)兔仰臥位固定后，中下腹備皮，沿腹白線開腹，將部分小腸拉出體外，兔子側(cè)臥位擺放，選擇一段腸系膜血管進(jìn)入腸壁分支較多的腸管(大約5 cm)固定，腸管內(nèi)注入脫氣水，固定后為輻照區(qū)域(見圖1)。

圖1　腸管注水后水浴治療裝置

1.4實(shí)驗(yàn)分組超聲微泡組：抽取脂氟顯微泡懸液0.2 mL/kg，加入生理鹽水稀釋至4 mL，5 min內(nèi)經(jīng)靜脈通道緩慢勻速注入，同時(shí)用超聲治療儀輻照之前觀察并標(biāo)記的腸壁及腸系膜血管區(qū)域5 min。

單純微泡組：超聲治療儀不發(fā)射能量，余同上，假照5 min。

單純超聲組：抽取脂氟顯微泡懸液用4 mL生理鹽水代替，經(jīng)靜脈注入，同時(shí)用超聲治療儀輻照之前觀察并標(biāo)記的腸壁及腸系膜血管區(qū)域5 min。

空白組：注入生理鹽水，超聲治療儀不發(fā)射能量。

1.5觀察方法使用顯微鏡(Olympus IX71倒置熒光顯微鏡——日本Olympus公司)觀察治療前血管形態(tài)，記錄并將中心區(qū)域觀察血管做標(biāo)記；治療結(jié)束后，使用顯微鏡再次觀察標(biāo)記血管，并記錄。然后耳緣靜脈注入伊文思藍(lán)溶液(2%)5 mL，觀察伊文思藍(lán)在目標(biāo)血管內(nèi)的灌注情況，并記錄。

1.6實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，使用戊巴比妥鈉10 mL/kg靜脈推注進(jìn)行過量麻醉安樂死，立即切取治療中心的腸壁組織，置于10%福爾馬林溶液固定1 d，經(jīng)脫水、石蠟包埋及蘇木素伊蘭(HE)染色等程序后，連續(xù)切片制成病理切面，顯微鏡下進(jìn)行病理學(xué)觀察。

2結(jié)果

治療后顯微鏡上觀察可以看到空白組、單純微泡組、單純超聲組微血管形態(tài)正常未見損傷，微血管內(nèi)血流通暢，血管周圍未見滲出，見圖2。超聲微泡組在顯微鏡下觀察到治療前血流通暢，治療后血流流速減慢，微血管周圍可見滲出，部分滲出形成血腫，血腫形態(tài)可分為三種，一為沿著血管分布的血腫，呈條狀，邊界清晰，分布規(guī)則；二為大片血腫滲出，呈云絮狀，這種血腫在顯微鏡一個(gè)視野下通常看不到邊界，分布無規(guī)則，在血管旁或者覆蓋血管；三為血管末端以及分支處的小血腫，呈類圓形。

圖2　a圖為空白組血管治療后，未見明顯改變。

注入伊文思藍(lán)溶液后，空白組、單純微泡組、單純超聲組治療區(qū)域內(nèi)微血管迅速呈藍(lán)色染色，血管外未見藍(lán)色滲出；超聲治療組治療區(qū)域內(nèi)微血管藍(lán)色染色速度較慢，微血管周圍可見藍(lán)色滲出，滲出血腫呈藍(lán)色。

病理片顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)：空白組、單純微泡組、單純超聲組微血管管壁平整，血管周圍未見紅細(xì)胞滲出，部分血管內(nèi)可見少量紅細(xì)胞堆積，腸壁組織結(jié)構(gòu)規(guī)則，組織間隙未見紅細(xì)胞堆積。超聲微泡組血管中可見大片紅細(xì)胞出現(xiàn)在腸壁組織邊緣，以及血管周圍可見紅細(xì)胞滲出。

3討論

超聲聯(lián)合微泡作用于血管壁使其通透性增高，沖擊波和微射流產(chǎn)生的機(jī)械應(yīng)力可在細(xì)胞膜上穿孔甚至穿透血管[5]。這可能是造成了對血管的直接損傷作用，使血管壁滲透性增高，紅細(xì)胞滲出，在血管周圍成血腫。本研究由于腸系膜及腸壁血管內(nèi)動(dòng)靜脈血管相伴行，內(nèi)徑也較為接近，但是在治療后，血管的滲出多發(fā)生在微靜脈，這可能與其血管壁結(jié)構(gòu)有關(guān)，微靜脈血管管壁薄且無平滑肌或者彈性膜。

腸系膜及腸壁微小血管管壁損傷后滲出血腫對微血管無明顯阻斷作用，這可能是由于在腸壁組織較為疏松，血腫向外周擴(kuò)散，對血管的擠壓作用不強(qiáng)，而若在實(shí)質(zhì)性臟器中，如肝、脾，由于血管周圍組織致密，血腫形成會(huì)擠壓血管以及肝竇、脾竇結(jié)構(gòu)，對微小血管產(chǎn)生阻斷作用，對大、中血管則阻斷作用不明顯，隨著血腫的逐漸消退，血管可能會(huì)再通[6]。

從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以表明，超聲激勵(lì)微泡對微血管可以造成一定程度的損傷，血液滲出后形成血腫。部分大血腫在實(shí)質(zhì)性臟器中可能會(huì)對附近血管有一定的擠壓作用，同時(shí)聯(lián)合組織水腫以及血管內(nèi)血栓形成共同阻斷血管。有研究證明[7]，在30 min或60 min后，實(shí)質(zhì)性臟器會(huì)有部分再灌注現(xiàn)象，阻斷效應(yīng)隨時(shí)間的延長逐漸減輕、消失。這個(gè)血流的再灌注機(jī)制尚不明確，在本實(shí)驗(yàn)中我們得出大部分微血管在損傷后會(huì)出現(xiàn)血腫，由于腸壁組織松散，血腫的形成不容易對血管造成擠壓，但是在實(shí)質(zhì)性臟器中，組織結(jié)構(gòu)緊密，血管損傷后產(chǎn)生的血腫易對血管以及肝、脾血竇造成擠壓，但是血腫是新形成不穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，隨著時(shí)間的推移，血腫可能會(huì)消退，血腫對血管的擠壓效果消失，可能會(huì)有部分大、中血管再通。在本實(shí)驗(yàn)中，我們沒有觀察血流的再灌注，以及血腫的消退，希望在未來的實(shí)驗(yàn)中我們可以進(jìn)一步研究再灌注的機(jī)制，從而進(jìn)一步了解超聲激勵(lì)微泡對血管損傷及阻斷的機(jī)制，對超聲治療走向臨床奠定堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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基金項(xiàng)目：廣東省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(S2013010016277)；廣東省公益研究與能力建設(shè)專項(xiàng)資金項(xiàng)目(2014A020212014)

通信作者：柳建華，E-mai：liujianhua666666@163.com

DOI：10.3969/j.issn.1000-8535.2016.02.029

(收稿日期：2015-11-27)