散堆聚乙二醇開(kāi)管毛細(xì)管液相色譜柱的原位制備與評(píng)價(jià)

張維冰,　彭　麗,　張凌怡,　高　羽,　陳雅靜,　劉海燕

(華東理工大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院,上海 200237)

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散堆聚乙二醇開(kāi)管毛細(xì)管液相色譜柱的原位制備與評(píng)價(jià)

張維冰,彭麗,張凌怡,高羽,陳雅靜,劉海燕

(華東理工大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院,上海 200237)

采用表面引發(fā)原子轉(zhuǎn)移自由基聚合反應(yīng)，原位制備了聚乙二醇開(kāi)管毛細(xì)管液相色譜柱，色譜固定相床超長(zhǎng)的聚乙二醇分子在毛細(xì)管內(nèi)壁形成散堆結(jié)構(gòu),極大地提高相比及樣品容量,掃描電鏡可觀察到毛細(xì)管內(nèi)壁形成的床層表面粗糙。在毛細(xì)管液相色譜模式下,4-羥基苯甲酸、苯甲酸、2,4-二羥基苯甲酸和苯的混合樣品被用于評(píng)價(jià)其分離性能,結(jié)果表明,所制備的新型開(kāi)管柱不僅保留了開(kāi)管柱分析速度快的特征,也因其散堆結(jié)構(gòu)較通常的開(kāi)管柱提供更多的作用位點(diǎn),還能有效改善分離性能。連續(xù)5次進(jìn)樣,4種小分子的混合物保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于2.5%,說(shuō)明該柱的重復(fù)性較好。進(jìn)一步將色譜柱用于混合蛋白質(zhì)的分離,也取得了良好的效果。

開(kāi)管毛細(xì)管柱; 表面引發(fā)原子轉(zhuǎn)移自由基聚合反應(yīng); 毛細(xì)管液相色譜

毛細(xì)管液相色譜具有柱效高,樣品用量少,流動(dòng)相和固定相消耗低,靈敏度高等優(yōu)點(diǎn),可方便與其他檢測(cè)器在線聯(lián)用[1-4],在食品[5-6]、蛋白質(zhì)[7-8]、多肽[8-9]、醫(yī)藥[10-11]等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。毛細(xì)管開(kāi)管柱具有通透性好,柱效高,反壓小等特征,適于快速分析,但由于其柱容量和相比相對(duì)較低,極大地限制了其應(yīng)用范圍的拓展。

傳統(tǒng)的開(kāi)管毛細(xì)管柱中固定相床層的制備包括物理涂覆[12-13]和化學(xué)鍵合[14-15]2種方法,這些方法盡管可能產(chǎn)生足夠的床層厚度,但仍難于保證足夠的裸露固定相表面和活性位點(diǎn)數(shù)?，F(xiàn)有多種方法被用于改善開(kāi)管毛細(xì)管柱性能,David等[16]采用動(dòng)態(tài)原子轉(zhuǎn)移自由基聚合方法成功制備了聚甲基丙烯酸丁酯和聚苯乙烯開(kāi)管柱,通過(guò)改變溫度、通入聚合溶液的線速度和反應(yīng)時(shí)間來(lái)改變固定相的鍵合量。Nesterenko等[17]采用光引發(fā)原子轉(zhuǎn)移自由基聚合反應(yīng)制備聚甲基丙烯酸開(kāi)管柱,并將其成功應(yīng)用于8種蛋白質(zhì)的分離。Rogeberg等[18]通過(guò)熱引發(fā)原子轉(zhuǎn)移自由基聚合方法制備了聚苯乙烯開(kāi)管柱,并與生物質(zhì)譜聯(lián)用,實(shí)現(xiàn)了牛奶中蛋白質(zhì)的分離。采用光引發(fā)或熱引發(fā)的原位自由基聚合反應(yīng)制備的開(kāi)管柱受毛細(xì)管內(nèi)徑影響很大,內(nèi)徑越細(xì),聚合物越容易貼壁生長(zhǎng),所以很少被應(yīng)用于制備內(nèi)徑大于30 μm的開(kāi)管柱[19]。表面引發(fā)原子轉(zhuǎn)移自由基聚合反應(yīng)(SI-ATRP)是將引發(fā)劑預(yù)先固定在毛細(xì)管內(nèi)壁,通過(guò)可控聚合反應(yīng)在毛細(xì)管內(nèi)壁原位生長(zhǎng)聚合物。Qin等[20]采用此方法在石英毛細(xì)管內(nèi)壁修飾成三維波浪狀聚合物涂層,然后將Zr4+固定在聚合物側(cè)鏈末端,再利用Zr4+與磷酸化肽段中磷酸基團(tuán)的螯合作用選擇性富集磷酸化肽段,柱負(fù)載量、富集效率、富集特異性等都比傳統(tǒng)的磷酸鋯開(kāi)管柱高。潘一廷等[21]采用SI-ATRP制備了葡萄糖聚合物修飾的開(kāi)管毛細(xì)管柱,并在毛細(xì)管電色譜模式下成功分離了小分子混合物和蛋白質(zhì)大分子。

本文分別采用原子轉(zhuǎn)移自由基聚合法(ATRP)和SI-ATRP聚合法制備poly(GMA-co-PEGDA)開(kāi)管柱,并對(duì)其結(jié)構(gòu)和色譜分離性能加以研究。

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1試劑

聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA,Mn=250)、甲基丙烯酸縮水甘油酯 (GMA,純度97%),偶氮二異丁氰(AIBN),氯化亞銅(純度99%),γ-甲基丙烯酸氧丙基三甲氧基硅烷(γ-maps),肌紅蛋白(Myo),卵清蛋白(ova)購(gòu)自Sigma-Aldrich(美國(guó))公司;1,1,4,7,7-五甲基二亞乙基三胺(PMDETA,純度98%)購(gòu)自J&K Chemical Ltd.(美國(guó));氯化亞銅(CuCl),氯化銅(CuCl2),2-溴異丁酰溴,3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES),苯甲酸(BA),2,4-二羥基苯甲酸(2,4-DHB),對(duì)羥基苯甲酸(4-HB),牛血清白蛋白(BSA),細(xì)胞色素C(cyt-c)購(gòu)自阿拉丁有限公司;苯,三乙胺,環(huán)己醇,甲酸,氫氧化鈉,鹽酸,磷酸二氫鈉為分析純,購(gòu)自上海凌峰化學(xué)試劑有限公司;乙腈(ACN,色譜純),甲醇(色譜純)購(gòu)自山東禹王實(shí)業(yè)有限公司;乙醇(色譜純)為分析純,購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;熔融石英毛細(xì)管(50 μm× 375 μm；200 μm× 375 μm),購(gòu)自邯鄲市鑫諾光纖色譜有限公司(中國(guó))。

1.2儀器設(shè)備

P1201S 高壓恒流泵(大連依利特分析儀器有限公司),紫外檢測(cè)器(蘇州匯通色譜分離純化有限公司),Arium 611 超純水儀(賽多利斯集團(tuán),德國(guó)),超聲波清洗儀(Autoscience,天津奧特賽恩斯儀器有限公司)。高壓恒流泵的出口端與T型三通相連,三通的另外兩接口分別與分流毛細(xì)管(200 μm× 375 μm×35 cm) 和毛細(xì)管開(kāi)管柱相連,分流比控制在1/200左右。

1.3poly(GMA-co-PEGDA)開(kāi)管柱的制備

1.3.1石英毛細(xì)管的活化毛細(xì)管內(nèi)壁活化的方法采用酸堿處理法。0.1 mol/L HCl溶液沖洗毛細(xì)管1 h,超純水將柱內(nèi)環(huán)境沖洗至中性,0.1 mol/L NaOH溶液沖洗毛細(xì)管0.5 h,超純水和甲醇各沖洗0.5 h,最后N2吹干,密封保存,備用。

1.3.2ATRP反應(yīng)制備poly(GMA-co-PEGDA)開(kāi)管毛細(xì)管柱毛細(xì)管柱硅烷化:用注射器將φ=30%的γ-maps 丙酮溶液灌入毛細(xì)管內(nèi),用聚四氟乙烯管密封后,室溫靜置反應(yīng)24 h,再依次用甲醇、超純水、甲醇沖洗毛細(xì)管,除去管內(nèi)殘留物,最后N2吹干備用。

ATRP聚合反應(yīng):將PEGDA、GMA,AIBN溶于甲醇中,并超聲5 min,得無(wú)氣泡均相溶液。再將其充入經(jīng)γ-maps處理過(guò)的毛細(xì)管中,兩端封口后室溫下靜置1 h,用N2吹5 min,除去毛細(xì)管柱中間的聚合物溶液,管壁留下一層薄膜,密封,在65 ℃的水浴中反應(yīng)22 h。待反應(yīng)完全后,依次用甲醇、水沖洗10 min,最后水封保存。

1.3.3SI-ATRP反應(yīng)制備poly(GMA-co-PEGDA)開(kāi)管毛細(xì)管柱引發(fā)劑的合成:依次將1.875 mL APTES,1.4 mL 三乙胺,12.5 mL 四氫呋喃加入50 mL 三頸燒瓶中,通氮?dú)獬醪⒈?0 min。將1.25 mL 2-溴異丁酰溴緩慢滴加到反應(yīng)液中,于25 ℃下劇烈攪拌4 h,然后將反應(yīng)液離心取上清液,最后將上清液旋干,得黃色黏稠狀產(chǎn)物,2-溴-2甲基-N-(3-(三乙氧基甲硅烷基)丙基)丙酰胺(BIBAPTES),充N(xiāo)2,密封后4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

引發(fā)劑的固定:將BIBAPTES溶于乙醇溶液中,配置成10 mg/mL 的乙醇溶液,用注射器推入活化后的石英毛細(xì)管中,密封,37 ℃水浴中反應(yīng)16 h,最后用乙醇反復(fù)沖洗,氮?dú)獯蹈?密封保存。

SI-ATRP聚合反應(yīng):將337.5 mg PEGDA,497.5 mg GMA,7.8 mg PMDETA,0.5 mg氯化銅溶于2.1 mL環(huán)己醇中,超聲10 min后,加入3.0 mg氯化亞銅,超聲10 min,迅速通入上述石英毛細(xì)管,密封,25 ℃水浴中反應(yīng)36 h后,依次用甲醇、水沖洗10 min,最后水封保存。

2　結(jié)果與討論

2.1poly(GMA-co-PEGDA)開(kāi)管毛細(xì)管柱的制備與表征

2.1.1poly(GMA-co-PEGDA)開(kāi)管毛細(xì)管柱的制備本文設(shè)計(jì)了2條制備路線。第1條路線是采用ATRP聚合法(圖1(a)),此方法過(guò)程簡(jiǎn)單,操作方便,但是在制備較長(zhǎng)的毛細(xì)管柱時(shí),為防止柱堵塞,氮吹時(shí)間需加長(zhǎng),這樣就導(dǎo)致柱內(nèi)留下的聚合溶液較少,故此方法不適合制備較長(zhǎng)的開(kāi)管毛細(xì)管柱。

第2條路線(圖1(b))是采用SI-ATRP聚合法。首先,用APTES改性2-溴異丁酰溴,合成BIBAPTES,通過(guò)硅烷化反應(yīng)將BIBAPTES固定在毛細(xì)管內(nèi)壁,采用表面原子轉(zhuǎn)移自由基聚合法,在毛細(xì)管內(nèi)表面嫁接聚合物,得到Poly-GMA-co-PEGDA開(kāi)管柱。SI-ATRP是利用過(guò)渡金屬配合物實(shí)現(xiàn)活性自由基和非活性自由基的轉(zhuǎn)換,既避免了活性自由基的猝滅,也確保了活性自由基處于較低的濃度,這樣可以避免常規(guī)自由基聚合反應(yīng)中出現(xiàn)的堵塞毛細(xì)管現(xiàn)象,有效地增加了固定相的比表面積,提高了活性位點(diǎn)的覆蓋度。故最后確定此路線作為本文實(shí)驗(yàn)的制柱方案。

2.1.2poly(GMA-co-PEGDA)開(kāi)管柱的掃描電鏡表征為了確保開(kāi)管柱的通透性,圖1(a)路線中的氮吹時(shí)間必須足夠長(zhǎng),必將導(dǎo)致固定相鍵合量較少,掃描電鏡(圖2(a))也證明了這一點(diǎn)。采用圖1(b)的路線制備聚乙二醇開(kāi)管柱時(shí),聚合物最初以梳狀結(jié)構(gòu)向管中心生長(zhǎng),但隨著鏈的增長(zhǎng),梳狀結(jié)構(gòu)坍塌,通過(guò)空間位阻和側(cè)鏈的分子作用相互聚集,形成散堆結(jié)構(gòu)。溶劑的作用類(lèi)似于毛細(xì)管開(kāi)管柱制備過(guò)程中的致孔劑,但是在這里影響不大。圖2(b),2(c),2(d)示出了反應(yīng)12,36,48 h后的掃描電鏡圖,結(jié)果表明毛細(xì)管內(nèi)壁嫁接了表面高度粗糙的聚合物,固定相的鍵合量隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加,較圖2(a)比表面積有明顯改善。

圖1　Poly-GMA-co-PEGDA開(kāi)管柱的制備路線Fig.1　Preparation procedure of poly-GMA-co-PEGDA open tubular columns

圖2　Poly(GMA-co-PEGDA)開(kāi)管柱的掃描電鏡圖Fig.2　SEM images of poly(GMA-co-PEGDA) open tubular columns

2.2分離性能評(píng)價(jià)

2.2.1ACN體積分?jǐn)?shù)對(duì)分離的影響Wang等[22]研究表明,流動(dòng)相中有機(jī)相的比例是影響樣品在固定相中保留行為的主要因素。本文考察了乙腈體積分?jǐn)?shù)對(duì)poly(GMA-co-PEGDA)開(kāi)管柱的柱性能影響，實(shí)驗(yàn)條件為：流動(dòng)相為pH 3.0的25 mmol/L的PBS的乙腈水溶液(φ(ACN)=30%；c(PBS)=25 mmol/L);流速:0.25 μL/min,分離柱:1 m×50 μm;紫外檢測(cè)波長(zhǎng):214 nm。結(jié)果見(jiàn)圖3，由圖表明,乙腈體積分?jǐn)?shù)對(duì)分離效果和洗脫能力有很大影響。當(dāng)體積分?jǐn)?shù)為40%時(shí),洗脫能力較強(qiáng),但是樣品均未達(dá)到完全分離(其中，R1、R2、R3分別是4-HB與BA,BA與2,4-DHB,2,4-DHB與苯之間的分離度，其中，R1=0.846,R2=1.14,R3=0.807),而當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%時(shí),洗脫能力稍弱,但是分離度較好(R1=1.63,R2=1.91,R3=1.86),綜合考慮,選取流動(dòng)相中乙腈體積分?jǐn)?shù)為30%。

圖3　ACN體積分?jǐn)?shù)對(duì)保留因子的影響及poly(GMA-co-PEGDA)開(kāi)管柱的分離色譜圖Fig.3　Effects of ACN volume fraction on retention factor and separation on poly(GMA-co-PEGDA) open tubular column

圖3(a)顯示,隨著乙腈體積分?jǐn)?shù)的增加,幾種樣品的保留因子k均減小,證明了該柱的反相分離模式。另一方面,圖3(b)幾個(gè)樣品的出峰順序表明樣品分子與固定相之間還存在氫鍵作用。圖3(c)所示為采用ATRP聚合反應(yīng)制備的poly(GMA-co-PEGDA)開(kāi)管柱的分離色譜圖,4種化合物均未達(dá)到基線分離,表明采用SI-ATRP聚合法制備的poly(GMA-co-PEGDA)開(kāi)管柱具有更好的分離性能。

2.2.2pH對(duì)分離的影響不同的pH條件可以使離子型樣品發(fā)生不同程度的解離,所以流動(dòng)相的pH值直接決定了樣品在分離中的存在形式。表1示出了4-HB,BA,2,4-DHB 和苯在4種pH條件下的分離度。當(dāng)pH值增加時(shí),4-HB,BA,2,4-DHB這3種樣品的解離程度增加,氫鍵相互作用減弱,疏水相互作用對(duì)保留的貢獻(xiàn)增強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明pH為3.0時(shí)混合樣品可以得到最佳分離。

表1　pH對(duì)分離度的影響Table 1　Effects of pH to resolution

2.2.3緩沖液濃度對(duì)分離的影響分別考察了20,25,30,40,50,60 mmol/L的緩沖液對(duì)柱分離的影響。實(shí)驗(yàn)條件為：流動(dòng)相:含φ=30% ACN的PBS溶液，pH 3.0;流速:0.5 mL/min;分離柱:1 m×50 μm;紫外檢測(cè)波長(zhǎng):214 nm。結(jié)果表明,當(dāng)緩沖液濃度小于30 mmol/L時(shí),樣品的保留因子有微弱變化,主要是因?yàn)楣潭ㄏ啾砻婧懈凰畬?當(dāng)流動(dòng)相中的鹽進(jìn)入固定相的水化層會(huì)增大固定相的容積,改變樣品與固定相的作用面積,從而影響保留因子。但是當(dāng)固定相容積達(dá)到最大時(shí),再增加緩沖液濃度則不會(huì)構(gòu)成明顯變化,所以當(dāng)緩沖液濃度大于30 mmol/L時(shí),樣品的保留因子變化較小。結(jié)果表明,當(dāng)磷酸緩沖液濃度為25 mmol/L時(shí),樣品間分離度最大(R1=1.77,R2=1.94,R3=2.58)。

圖4　磷酸緩沖液濃度的影響Fig.4　Effects of the concentration of PBS

2.3poly(GMA-co-PEGDA)開(kāi)管毛細(xì)管柱在蛋白質(zhì)分離中的應(yīng)用

近年來(lái),隨著人們對(duì)蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的深入研究,蛋白質(zhì)組學(xué)的地位日益凸顯,為了進(jìn)一步推進(jìn)其研究,需發(fā)展快速、高效、高靈敏度和高選擇性的蛋白質(zhì)分離技術(shù)。小分子混合樣品的分離已經(jīng)證明該柱的分離模式是反相作用模式,同時(shí)還存在較強(qiáng)的氫鍵作用,對(duì)蛋白質(zhì)的分離具有較大的潛力。圖5示出了用該柱分離4種蛋白質(zhì)混合物(cyt-c,BSA,ova,Myo)譜圖,實(shí)驗(yàn)條件為：分離柱:1 m×50 μm;流動(dòng)相:ACN-H2O混合液(φ(ACN)=50%,含φ=0.1%甲酸);流速:0.4 μL/min,分離效果較好。

圖5　蛋白質(zhì)的分離Fig.5　Separation of proteins

2.4柱重復(fù)性的考察

在優(yōu)化的分離條件下,考察了色譜柱的重復(fù)性。poly(PEGDA-co-GMA)柱連續(xù)進(jìn)樣5次,4-HB,BA,2,4-DHB與苯的保留時(shí)間的相對(duì)平均偏差(n=5)均小于3%,具有較好的重復(fù)性。

3　結(jié)　論

柱容量低和比表面積小一直是開(kāi)管毛細(xì)管柱發(fā)展道路上的最大瓶頸,目前已有很多改善方法,如動(dòng)態(tài)反應(yīng),原子轉(zhuǎn)移聚合反應(yīng)等,其中SI-ATRP因具有反應(yīng)定向性和可控性,有望成為制備毛細(xì)管開(kāi)管柱最佳選擇。本文以GMA為功能單體,PEGDA為交聯(lián)劑,通過(guò)SI-ATRP聚合法原位制備了聚乙二醇開(kāi)管毛細(xì)管液相色譜柱，散堆的聚乙二醇固定相顯著增加了開(kāi)管柱的比表面積和作用位點(diǎn)數(shù)。用BA,4-HB,2,4-DHB和苯評(píng)價(jià)了該柱的分離性能,研究表明樣品分子與固定相之間是反相作用模式,同時(shí)還存在較強(qiáng)的氫鍵作用力,這對(duì)于蛋白質(zhì)的分離具有極大的優(yōu)勢(shì)。最后,考察了重復(fù)性,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明重復(fù)性較好。在今后的研究中,可以通過(guò)對(duì)該柱改性，或者增加柱長(zhǎng)和減小毛細(xì)管內(nèi)徑來(lái)增加其柱效,進(jìn)一步將其應(yīng)用于蛋白組學(xué)中的分離分析。

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Situ Preparation and Performance Evaluation of Open Tubular Columns Fabricated by Bulk Polyethylene Glycol for Capillary Liquid Chromatography

ZHANG Wei-bing,PENG Li,ZHANG Ling-yi,GAO Yu,CHEN Ya-jing,LIU Hai-yan

(School of Chemistry and Molecular Engineering,East China University of Science and Technology,Shanghai 200237,China)

An open tubular capillary liquid chromatography column (OTCLC) coated by poly[glycidyl methacrylate-co-poly(ethylene glycol) diacrylate] (GMA-co-PEGDA) was prepared by surface initiated atom transfer radical polymerization (SI-ATRP).The polyethylene glycol grafting resulted in the formation of bulk structure,obviously increasing the phase ratio and column capacity.Characterized by scanning electron microscopy (SEM),the monolithic layer was observed to be rough.Four small molecules including 4-hydroxy benzoic acid,benzoic acid,2,4-dihydroxy benzoic acid and benzene were used to evaluate the separation performance of the open-tubular capillary liquid chromatography column.The results showed that bulk structure of the poly(GMA-co-PEGDA) OTCC not only remained the characteristic of fast separation but also provided more active sites.The run-to-run (n=5) relative standard deviations (RSDs) for retention time for 5 consecutive injections of 4 molecules were less than 2.5%,indicating good repeatability.Finally,the OTCC was applied to the separation of protein mixtures,and also obtained good separation ability.

open tubular capillary column; surface initiated atom transfer radical polymerization; capillary liquid chromatography

A

1006-3080(2016)03-0357-06

10.14135/j.cnki.1006-3080.2016.03.010

2015-09-28

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(21475044);國(guó)家重大科學(xué)儀器設(shè)備開(kāi)發(fā)專(zhuān)項(xiàng)(2012YQ120044)

張維冰(1964-),男,安徽合肥人,教授,博士,研究方向?yàn)樯V理論及應(yīng)用等。E-mail:weibingzhang@ecust.edu.cn

通信聯(lián)系人：劉海燕,E-mail:hyliu@ecust.edu.cn

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