尋常型銀屑病患者皮損miR-146a的表達(dá)及意義

鄧蕙妍，林玲，周欣，劉煒鈺，羅權(quán)（廣州市皮膚病防治所，廣州 510095）

尋常型銀屑病患者皮損miR-146a的表達(dá)及意義

鄧蕙妍，林玲，周欣，劉煒鈺，羅權(quán)
（廣州市皮膚病防治所，廣州 510095）

目的檢測尋常型銀屑病患者皮損中miR-146a的表達(dá)情況，并探討其與尋常型銀屑病發(fā)病的相關(guān)性。方法應(yīng)用實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）比較30例尋常型銀屑病患者皮損及正常對照組相同部位皮膚中miR-146a的相對表達(dá)量。并探討其與尋常型銀屑病患者病情活動指標(biāo)之間的關(guān)系。結(jié)果 尋常型銀屑病患者皮損中的miR-146a的拷貝數(shù)顯著高于正常對照組（P＜0.05），并發(fā)現(xiàn)miR-146a表達(dá)量與尋常型銀屑病的皮損面積和嚴(yán)重程度有一定關(guān)系。結(jié)論尋常型銀屑病患者皮損中的miR-146a異常高表達(dá)，并與尋常型銀屑病的嚴(yán)重程度相關(guān)，提示miR-146a在尋常型銀屑病的發(fā)病中起重要作用。

銀屑??；尋常型；miR-146a

微小RNA（microRNA，miRNA）是一類進(jìn)化高度保守的微小非編碼RNA，其通過影響翻譯后水平而調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)。MicroRNA是20 nt左右的調(diào)控非編碼小分子RNA，由具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的單鏈miR剪切加工而成，并在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮調(diào)節(jié)基因表達(dá)功能，其通過與mRNA 3段非編碼區(qū)（UTR）結(jié)合，抑制mRNA翻譯［1］。MicroRNAs參與細(xì)胞內(nèi)多種生命過程［2］，已有很多報(bào)道m(xù)iR-146a在多種疾病中異常表達(dá)，比如，參與腫瘤轉(zhuǎn)移、抗病毒作用、肌無力等［3-4］，但miR-146a在尋常型銀屑病皮損中的表達(dá)研究報(bào)道甚少。我們應(yīng)用實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）檢測miR-146a在尋常型銀屑病皮損的表達(dá)，探討其與尋常型銀屑病的關(guān)系。

1　材料與方法

1.1研究對象2012年10月—2013年10月在我所門診就治的尋常型銀屑病患者共30例，根據(jù)《中國臨床皮膚病學(xué)》［4］的診斷標(biāo)準(zhǔn)確診。男21例，女9例，年齡24～73歲，平均40歲。進(jìn)行期18例，靜止期12例，病程6個(gè)月～17年。銀屑病患者的皮損面積和嚴(yán)重程度按銀屑病面積與嚴(yán)重程度指數(shù)（PASI）評分為7.9～28.5分，平均（17.22±6.34）分。所有銀屑病患者近2個(gè)月內(nèi)未系統(tǒng)服用維A酸、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等藥物，無并發(fā)癥及各種系統(tǒng)性疾病。另取30例正常人作為對照，男17例，女13例，年齡20～44歲，平均29歲，無免疫性疾病及系統(tǒng)性疾病，無銀屑病家族史。正常人對照組與銀屑病患者組在性別及年齡上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本試驗(yàn)得到患者本人同意和醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審查通過。

1.2總RNA的提取和純化一般選取患者背部皮損，若背部無皮損，選取患者四肢典型皮損，由組織活檢獲得標(biāo)本，根據(jù)說明書采用Trizol（Invitrogen，USA）提取細(xì)胞系總RNA，RecoverAllTM總核酸提取試劑盒（Ambion，USA）提取組織總RNA，SmartSpec Plus分光光度計(jì)（Bio-Rad，USA）對總RNA進(jìn)行定量分析。

1.3cDNA合成與qRT-PCR取100 ng總RNA按操作說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄cDNA，反應(yīng)程序：16℃30 min，42℃30 min，85℃5 min。按Taqman MicroRNA Assays（Applied Biosystems，USA）說明檢測成熟的miR，以miR-146a和U6作模板，miR-146a和U6熒光探針作引物擴(kuò)增，反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃45 s，95℃15 s，60℃15 s，45個(gè)循環(huán)，所有試驗(yàn)重復(fù)3次，相對定量分析2-△△Ct法測定miR變化。

2　結(jié)果

2.1總RNA質(zhì)量及PCR擴(kuò)增效率所有組織標(biāo)本抽提之總 RNA A260/A280值在 1.79～1.98，A260/A230值在1.95～2.11。miR-146a及內(nèi)參PCR擴(kuò)增效率為91.5%～96.0%。

2.22組研究對象miR-146a表達(dá)的比較我們用qRT-PCR檢測了30份尋常型銀屑病患者皮損樣本及30份正常對照同一部位皮膚中miR-146a的表達(dá)量，尋常型銀屑病患者皮損miR-146a表達(dá)量比正常皮膚表達(dá)量高，其中18份進(jìn)行期尋常型銀屑病患者皮損平均上調(diào)3.75倍，12份靜止期尋常型銀屑病患者皮損平均上調(diào)2.0倍，平均上調(diào)2.63倍，見圖1。

圖1　miR-146a在尋常型銀屑病患者組皮損和正常對照組同一部位皮膚中的表達(dá)比較

2.3miR-146a表達(dá)量與尋常型銀屑病臨床病理特征之間的關(guān)系分析這些樣品與患者年齡、性別、病程和臨床分期等病理特征發(fā)現(xiàn)，miR-146a表達(dá)量與在不同年齡、性別和病程的尋常型銀屑病患者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），與患者臨床分期有關(guān)，進(jìn)行期患者皮損中的miR-146a表達(dá)水平更高，與靜止期患者的miR-146a表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=8.37，P＜0.05），見表1。

表1 miR-146a在尋常型銀屑病患者和正常人皮損中的表達(dá)與臨床特征的關(guān)系

2.4miR-146a表達(dá)量與PASI評分的相關(guān)性分析30例尋常型銀屑病患者的PASI評分為7.9～28.5分，平均（17.22±6.34）分。采用rs檢驗(yàn)分析尋常型銀屑病患者皮損中miR-146a表達(dá)量及其PASI評分的相關(guān)性，兩者呈顯著正相關(guān)（r=0.838，P＜0.05），見圖2。

圖2　miR-146a表達(dá)量與PASI評分的相關(guān)性分析

3　討論

微小RNA（miRNA）是內(nèi)源性非編碼小RNA，可以在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)。它們通過結(jié)合到目標(biāo)mRNA互補(bǔ)位點(diǎn)的3'非翻譯區(qū)（UTR），阻止或減少mRNA的翻譯，導(dǎo)致靶mRNA的降解［5］。作為重要的基因調(diào)節(jié)器，miRNA已被證實(shí)參與人類的各種生理過程，它們的異常表達(dá)也參與了許多疾病的發(fā)病機(jī)制［1］。此外，最近的證據(jù)表明，miRNA的單核苷酸多態(tài)性（SNP）可以影響它們的表達(dá)和功能［6-7］，從而影響多種疾病的表型和發(fā)展［8-9］。miR-146a基因定位于染色體5q34［10］，編碼的miR-146a已被發(fā)現(xiàn)影響各種疾病。miR-146a上一些多態(tài)位點(diǎn)如rs2910164［11］、rs291016［12］等被證明能影響成熟miR-146a的水平和增加各種癌癥和炎性疾病的風(fēng)險(xiǎn)。其中miR-146a內(nèi)的rs2910164有可能對細(xì)胞表面蛋白表皮生長因子受體（EGFR）中的miR-146a受體有潛在的影響，Kogo等［13］也報(bào)道了miR-146a可錨定EGFR的mRNA，從而下調(diào)基因的轉(zhuǎn)錄水平，影響角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖。

筆者的試驗(yàn)結(jié)果表明銀屑病患者皮損中的miR-146a水平比正常人同一部位皮膚要高（t= 11.8，P＜0.05），而且患者PASI評分越高，miR-146a的水平越高，提示miR-146a在尋常型銀屑病的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。筆者的前期研究發(fā)現(xiàn)，miR-146a在銀屑病皮損部位及T細(xì)胞等免疫細(xì)胞中表達(dá)增加，提示miR-146a參與了銀屑病炎癥的病理過程［14］。國內(nèi)外研究提示，異常的miR可調(diào)控銀屑病相關(guān)基因和相應(yīng)蛋白的表達(dá)，從而促發(fā)一系列發(fā)病相關(guān)細(xì)胞因子的異常表達(dá)［15］。同時(shí)，銀屑病的主要病理特征是表皮中角質(zhì)形成細(xì)胞的過度增殖，而結(jié)合于表皮生長因子的EGFR在銀屑病皮損中過度表達(dá)［16］。結(jié)合筆者的研究，推測EGFR有可能受miR-146a的調(diào)節(jié)，從而影響銀屑病的發(fā)生。

分析患者的臨床分期和PASI評分發(fā)現(xiàn)，皮損面積越大，嚴(yán)重程度越高，miR-146a表達(dá)水平相應(yīng)增高（P＜0.05）。同時(shí)進(jìn)行期患者皮損中的miR-146a表達(dá)水平更高，說明miR-146a在臨床上影響銀屑病的病理變化，而與患者性別、年齡沒有顯著相關(guān)性，提示miR-146a可望作為評估尋常型銀屑病嚴(yán)重程度的指標(biāo)，對患者病情判斷和治療有指導(dǎo)作用。

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Expression of MiR-146a in the Lesions of Patients with Psoriasis Vulgaris and Its Significance

Deng Huiyan，Lin Ling，Zhou Xin，Liu Weiyu，Luo Quan
Guangzhou Institute of Dermatology，Guangzhou 510095，China

ObjectiveIn order to investigate the expression of miR-146a in the lesions of patients with psoriasis vulgaris，and to discuss the relationship between it and psoriasis vulgaris.Methods The relative expression of miR-146a in the skin of 30 patients with psoriasis vulgaris and normal control group with qRT-PCR was compared.The relationship between miR-146a and the activity index of psoriasis vulgaris was also analyzed.ResultsCopy of miR-146a in the skin lesions of patients with psoriasis vulgaris was significantly higher than that of the normal control group（P＜0.05）.MiR-146a expression in psoriatic lesion area had a relationship with psoriasis vulgaris.ConclusionExpression of miR-146a in the skin lesions of patients with psoriasis vulgaris is significantly higher，and has a relationship with psoriasis vulgaris，which suggests that miR-146a plays an important role in the pathogenesis of psoriasis vulgaris.

Psoriasis；Vulgaris；miR-146a

R758.63

A

1672-0709（2016）03-0142-03

廣州市醫(yī)藥衛(wèi)生科技一般引導(dǎo)項(xiàng)目（20141A011070），廣東省醫(yī)學(xué)科研基金（A2015305）

羅權(quán)，E-mail：luoquan666@126.com

2016-01-28）