肺寧顆粒對(duì)COPD急性期大鼠的肺組織病理和血清中TNF-α、MIP-2水平的影響

祁海燕　封繼宏　李美鳳　 鄭兆曄　劉　偉 　蘇景深

關(guān)　鵬▲　李云輝　天津中醫(yī)藥大學(xué)(天津300073)

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肺寧顆粒對(duì)COPD急性期大鼠的肺組織病理和血清中TNF-α、MIP-2水平的影響

祁海燕△封繼宏▲李美鳳▲鄭兆曄▲劉偉▲蘇景深▲

關(guān)鵬▲李云輝天津中醫(yī)藥大學(xué)(天津300073)

摘要目的：觀察肺寧顆粒對(duì)慢性阻塞性肺疾病(COPD)急性期模型、大鼠肺組織病理及血清TNF-α、MIP-2水平的影響。方法：將60只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為6組，分別為空白組、模型組、肺寧顆粒高、中、低劑量干預(yù)組、抗生素干預(yù)組。成功建立AECOPD大鼠模型，各干預(yù)組對(duì)應(yīng)給予藥物治療，共計(jì)1周。治療第8天觀察肺組織病理，治療第4天和第8天采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA )檢測(cè)大鼠血清TNF-α、MIP-2含量。結(jié)果：AECOPD造模完成后，肺組織病理結(jié)果顯示符合COPD病理性改變；給予藥物治療后，肺寧顆粒各劑量組及抗生素干預(yù)組肺組織病變較前減輕，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，第4天和第8天，AECOPD模型組大鼠血清中TNF-α、MIP-2均較空白組升高，P<0.05；治療后第4天結(jié)果顯示除肺寧顆粒低劑量組外，余治療組測(cè)定水平較模型組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。治療后第8天結(jié)果顯示治療組測(cè)定水平較模型組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。結(jié)論：COPD急性期應(yīng)用肺寧顆粒控制炎癥細(xì)胞因子水平，減少COPD急性期大鼠模型炎癥細(xì)胞的聚集，降低炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步減緩COPD進(jìn)展程度，達(dá)到保護(hù)肺功能的作用。

主題詞肺疾病, 慢性阻塞性/中醫(yī)藥療法 @肺寧顆粒酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

慢性阻塞性肺疾病(Chronicobstructivepulmonarydisease,COPD)是一種以持續(xù)氣流受限為特征的可以預(yù)防和治療的疾病，其氣流受限多呈進(jìn)行性發(fā)展，與氣道和肺組織對(duì)煙草煙霧等有害氣體或有害顆粒的慢性炎癥反應(yīng)增強(qiáng)有關(guān)[1]。AECOPD可影響患者整體疾病的嚴(yán)重程度，還成為了COPD患者死亡的主要因素[2]。在AECOPD患者中應(yīng)用中藥，能減少急性發(fā)作次數(shù)，調(diào)節(jié)患者的整體機(jī)能，盡可能達(dá)到最大程度預(yù)防COPD急性加重的目的。

肺寧顆粒(國(guó)藥準(zhǔn)字號(hào)Z22020825)具有清熱祛痰，鎮(zhèn)咳平喘的功效，主要用于肺部感染、慢支，喘息性支氣管炎，急性呼吸道感染等。藥物成分返魂草主要含有氫醌、對(duì)羥基苯乙酸、熊果酸、黃酮類、倍半萜類、生物堿等成分，通過(guò)課題前期成果，設(shè)計(jì)本研究，旨在通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)初步探索肺寧顆粒在COPD急性期的作用機(jī)制。

1材料與方法1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物同批次60只SPF級(jí)雄性Wistar大鼠(北京華阜康生物科技股份有限公司提供，許可證號(hào):SCXK(京)2009-0004)，體重(180±20)g，隨機(jī)分為6組，每組10只，分別設(shè)為：空白組、模型組、肺寧顆粒高、中、低劑量干預(yù)組、抗生素干預(yù)組。實(shí)驗(yàn)大鼠喂養(yǎng)于天津?qū)嶒?yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)溫度控制在18～22℃，相對(duì)濕度50%～60%。常規(guī)飼料喂養(yǎng)，自由飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。

1.2細(xì)菌肺炎鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株提供來(lái)源：天津市臨床檢驗(yàn)中心；標(biāo)準(zhǔn)菌株編號(hào)：ATC49619。

1.3藥品肺寧顆粒(修正藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字號(hào)Z22020825)；規(guī)格：10g/袋。

鹽酸莫西沙星片(德國(guó)拜耳制藥公司， 國(guó)藥準(zhǔn)字號(hào)J20100158)；規(guī)格：400mg/片。

1.4主要試劑乙醚，天津市化學(xué)試劑廠，批號(hào):Q/12HG5531-2007；彈性蛋白酶，美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：Lot#SLBD0685v；水合氯醛，天津市密歐化學(xué)試劑有限責(zé)任公司，批號(hào):Q/12HB4218-2009，使用時(shí)配置成10%溶液。10%中性福爾馬林溶液，多聚甲醛，天津市化學(xué)試劑廠提供，批號(hào):Q/12HG4108-2009，使用時(shí)配制成所需濃度。

1.5COPD急性期大鼠模型構(gòu)建參考王東、劉又寧等人[3]構(gòu)建COPD動(dòng)物模型的方法，改進(jìn)后建立大鼠模型，具體過(guò)程如下。

1.5.1肺氣腫大鼠模型建立[4]：大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開(kāi)始造模。將大鼠放入直徑為26～30cm密封分層干燥瓶?jī)?nèi)，并將乙醚放入干燥瓶底層，觀察上層大鼠活動(dòng)狀態(tài)。待大鼠出現(xiàn)四肢緊張度降低，呼吸變慢，反應(yīng)遲鈍，則表示已進(jìn)入麻醉期，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中需隨時(shí)觀察動(dòng)物的活動(dòng)狀態(tài)變化。待麻醉完成后，迅速將大鼠固定于制作好的操作臺(tái)上，頭高尾低位 30°仰臥，予自制圈套固定大鼠上齒，打開(kāi)大鼠口腔，將自制喉鏡片深入至?xí)挷?上抬會(huì)厭,暴露聲門，待聲門裂暴露于視野中，在聲門開(kāi)放的瞬間，將自制彎曲鈍頭鋼針對(duì)準(zhǔn)聲門并迅速插入，鋼針頂端探至聲門下約 1～1.5cm處，除對(duì)照組外其余各組大鼠緩慢滴注0.15ml彈性蛋白酶溶液(7.7μ/mg，單次滴注約合6U)，對(duì)照組按照上述方法氣管內(nèi)滴注0.15ml生理鹽水。滴注完畢后迅速退出鋼針，將大鼠直立并并適度搖動(dòng)15～20s，此造操作可使藥物盡可能均勻分布于大鼠兩肺。每7d滴入1次，共3次，造模時(shí)間21d。

1.5.2AECOPD大鼠模型建立：肺氣腫大鼠模型階段完成后，第22天起使用肺炎鏈球菌攻擊肺氣腫大鼠構(gòu)建AECOPD模型，攻擊1次，滴注肺炎鏈球菌瓊脂懸液0.15ml(細(xì)菌濃度為1×1012CFU/ml)，其具體操作方法同上述肺氣腫大鼠模型構(gòu)建。手術(shù)后觀察1h，未死亡大鼠納入實(shí)驗(yàn)，并置于18～22℃恒溫動(dòng)物房繼續(xù)飼養(yǎng)。

1.6給藥方法給藥從AECOPD造模成功后開(kāi)始，參照《中藥藥理實(shí)驗(yàn)方法》中動(dòng)物體表面積比率換算等效劑量，計(jì)算出大鼠各組藥物的日服量?？瞻捉M：采用滅菌生理鹽水2ml灌胃，1d1次，連續(xù)1周。模型組：AECOPD造模成功后，采用滅菌生理鹽水2ml灌胃，1d1次，連續(xù)1周。肺寧顆粒干預(yù)組(低、中、高三個(gè)劑量組)：肺寧顆粒(修正藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z22020825；規(guī)格：10g/袋)，制成0.12g/(kg·d) 、0.36g/(kg·d)、1.08g/(kg·d)水溶液。AECOPD造模成功后開(kāi)始灌胃，1d1次，連續(xù)1周?？股馗深A(yù)組：鹽酸莫西沙星片(德國(guó)拜耳制藥公司，國(guó)藥準(zhǔn)字號(hào)J20100158；規(guī)格：400mg/片)，制成40mg/(kg·d)水溶液。AECOPD造模成功后開(kāi)始灌胃，1d1次，連續(xù)1周。

1.7觀察指標(biāo)及方法1.7.1一般情況：觀察并記錄造模過(guò)程中各組大鼠如行為狀態(tài)、毛發(fā)光澤、進(jìn)食狀況等方面的變化，并定期稱重并記錄體重變化，造模完成后統(tǒng)計(jì)各組死亡率。

1.7.2肺組織病理：取材于大鼠右肺組織，10%福爾馬林固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋、切片、HE染色，鏡下觀察各組肺組織病理形態(tài)學(xué)的改變(圖1)。

1.7.3采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)法檢測(cè)血清中TNF、MIP-2的含量， 操作步驟參照試劑盒使用說(shuō)明書。

2結(jié)果2.1各組大鼠一般情況空白組大鼠活潑好動(dòng)，強(qiáng)壯肥碩，毛發(fā)光亮，呼吸平穩(wěn)，反應(yīng)靈敏，飲食水正常。造模組動(dòng)物活動(dòng)減少，蜷縮倦怠，拱背豎毛，毛發(fā)失去光澤，呼吸頻促，時(shí)有噴嚏，精神稍差。24h內(nèi)接種肺炎鏈球菌的大鼠中，除模型組有1只死亡，其余各組未見(jiàn)死亡。除空白組外，各組均可見(jiàn)不同程度進(jìn)食減少、活動(dòng)能力下降，術(shù)后3天內(nèi)大鼠普遍出現(xiàn)咳嗽癥狀，模型組大鼠同時(shí)伴有較明顯的喘息，手術(shù)取材日之前未再出現(xiàn)死亡。

2.2各組大鼠肺組織光鏡下病理改變見(jiàn)圖1。

空白對(duì)照組：支氣管黏膜上皮結(jié)構(gòu)完整，纖毛排列基本整齊，肺泡結(jié)構(gòu)完整，無(wú)明顯的破壞，肺泡壁無(wú)明顯增厚。未見(jiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)。

模型組：支氣管上皮細(xì)胞部分變形壞死、脫落，肺泡結(jié)構(gòu)被破壞明顯，肺泡腔明顯增大，部分可見(jiàn)肺泡大小不一，肺泡壁明顯變薄，可見(jiàn)不同程度的斷裂繼而融合成肺大泡，周圍可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺小動(dòng)脈可見(jiàn)管壁增厚，管壁周圍大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。

肺寧顆粒低、中、高劑量組：支氣管上皮細(xì)胞部分脫落，肺泡大小不等，結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡腔增大，肺大泡少見(jiàn)，周圍可見(jiàn)少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，三組上述情況較模型組均有所減輕。

抗生素干預(yù)組：支氣管上皮細(xì)胞部分壞死，脫落，肺泡腔增大，肺泡壁變薄，結(jié)構(gòu)紊亂，可見(jiàn)部分肺大泡，可見(jiàn)少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。

圖1　 AECOPD大鼠肺組織病理圖

2.3AECOPD大鼠血清ELISA測(cè)定TNF-α、MIP-2水平見(jiàn)表1，表2。

表1 　肺寧顆粒對(duì)AECOPD大鼠血清TNF-α表達(dá)水平的影響(ng/L)

注： 與空白組相比較，▲P<0.05；與模型組相比較，△P<0.05

表2　肺寧顆粒對(duì)AECOPD大鼠血清MIP-2表達(dá)水平的影響(ng/L)

注：與空白組相比較，▲P<0.05；與模型組相比較△ P<0.05

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，第4天和第8天，AECOPD模型組大鼠血清中TNF-α、MIP-2均較空白組升高，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；治療后第4天結(jié)果顯示除肺寧顆粒低劑量組外，余治療組測(cè)定水平較模型組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；治療后第8天結(jié)果顯示治療組測(cè)定水平較模型組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

3討論COPD的持續(xù)氣流受限多呈進(jìn)行性發(fā)展，AECOPD可影響患者整體疾病的嚴(yán)重程度[2]。炎癥反應(yīng)為該疾病重要特征之一，探討其炎癥介質(zhì)在AECOPD發(fā)展過(guò)程中的作用及機(jī)制極為重要。參與炎癥反應(yīng)過(guò)程的肺泡巨噬細(xì)胞是人體抵抗病原微生物的一道重要防線[5]。肺泡巨噬細(xì)胞在COPD模型大鼠的氣道炎癥中作用極其重要，主要表現(xiàn)在：參與炎癥激活的肺泡巨噬細(xì)胞釋放多種介質(zhì)，進(jìn)一步引起巨噬細(xì)胞及其他炎癥細(xì)胞的募集并促進(jìn)免疫細(xì)胞成熟。

腫瘤壞死因子α(TNF-α)是一種來(lái)源于活化的巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞及活化的T淋巴細(xì)胞等炎癥細(xì)胞的細(xì)胞因子。它能激活巨噬細(xì)胞，釋放更多的其他細(xì)胞因子。巨噬細(xì)胞炎癥蛋白2(MIP-2)是肺泡巨噬細(xì)胞和氣道上皮細(xì)胞分泌的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，是中性粒細(xì)胞重要的趨化細(xì)胞因子。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在AECOPD模型大鼠血清中TNF-α、MIP-2 水平顯著高于對(duì)照組，各應(yīng)用藥物組的TNF-α、MIP-2 水平低于模型組。我們推測(cè)，通過(guò)COPD急性期大鼠模型氣道內(nèi)肺泡巨噬細(xì)胞中促炎細(xì)胞因子TNF-α、MIP-2等分泌增加，進(jìn)一步導(dǎo)致了氣道炎癥的加劇[6]，反作用于氣道則更易加重COPD病情，在COPD急性期應(yīng)用肺寧顆?？刂蒲装Y細(xì)胞因子水平，減少COPD急性期大鼠模型炎癥細(xì)胞的聚集，降低炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步減緩COPD進(jìn)展程度。

綜上所述，本課題組通過(guò)改良后的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)造模方法，能基本復(fù)制COPD大鼠模型，通過(guò)肺組織病理和血清TNF-α、MIP-2水平的測(cè)定，表明肺寧顆粒應(yīng)用于COPD急性期大鼠對(duì)降低機(jī)體炎癥反應(yīng)有效。

參考文獻(xiàn)

[1]中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)慢性阻塞性肺疾病學(xué)組.慢性阻塞性肺疾病診治指南(2013年修訂版)[J].中華結(jié)核和呼吸雜志, 2013, 36(4):255-264.

[2] 慢性阻塞性肺疾病急性加重(AECOPD) 診治專家組. 慢性阻塞性肺疾病急性加重(AECOPD)診治中國(guó)專家共識(shí)(草案) [J].中華哮喘雜志(電子版),2013，7(1):1-12.

[3]王東.流感嗜血桿菌形成生物被膜與慢性阻塞性肺疾患急性發(fā)作相關(guān)性的研究[D].中國(guó)人民解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院,2009.

[4] 封繼宏,祁海燕,鄭兆曄,等. 經(jīng)硬式鼻腔鏡氣管內(nèi)滴注化學(xué)制劑建立AECOPD動(dòng)物模型[J]. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2015, 17(11): 68-70.

[5]WasylnkaJA，MooreMM．UptakeofAspergillusfumigatusConidiabyphagocyticandnonphagocyticcellsinvitro:quantitationusingstrainsexpressinggreenfluorescentprotein[J]．InfectImmun，2010，78: 1214-1220．

[6]曾華東,徐虹,李理,等.慢性阻塞性肺疾病大鼠模型肺泡巨噬細(xì)胞炎癥及調(diào)控機(jī)制探討[J]. 中國(guó)呼吸與危重監(jiān)護(hù)雜志,2012,11(2):133-137.

(收稿2016-01-29；修回2016-02-27)

【中圖分類號(hào)】R563.9

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

doi:10.3969/j.issn.1000-7369.2016.08.073

△陜西省中醫(yī)醫(yī)院(西安710003)

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