KLF4在宮頸癌生長及轉(zhuǎn)移表達(dá)的研究*

河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院(張家口 075000) 張玉虹　康燕華　孫喜斌

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KLF4在宮頸癌生長及轉(zhuǎn)移表達(dá)的研究*

河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院(張家口 075000) 張玉虹康燕華孫喜斌

摘要目的：探討Kruppel樣因子(KLF4)在宮頸癌生長情況及對宮頸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移表達(dá)能力的影響。方法：收集宮頸癌手術(shù)患者癌和癌旁組織樣本，采用免疫印跡實(shí)驗(yàn)(Western blot)、免疫組織化學(xué)、定量PCR法對宮頸癌組織、正常宮頸組織以及宮頸原位癌組織樣本中KLF4表達(dá)進(jìn)行檢查，并分析表達(dá)結(jié)果與病理特征的關(guān)系。結(jié)果：不同組織中KLF4陽性細(xì)胞率具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其中正常宮頸組織以及宮頸原位癌組織中陽性細(xì)胞率均為100%，宮頸癌組織中陽性細(xì)胞率為58.8%。與正常宮頸組織相比，宮頸癌以及宮頸原位癌組織強(qiáng)陽性細(xì)胞率明顯偏低，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。宮頸癌組織中KLF4的mRNA以及蛋白的表達(dá)明顯低于宮頸原位癌組織，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。KLF4隨著分化程度的下降，蛋白表達(dá)陽性率也隨之降低；而隨著臨床上分期的升高蛋白表達(dá)陽性率降低，但其間差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論：KLF4因子可能為一種抑癌因子，抑制肝癌細(xì)胞的侵襲和遷移，有望成為宮頸癌未來診斷以及治療的潛在靶標(biāo)。

主題詞宮頸腫瘤@Kruppel樣因子腫瘤轉(zhuǎn)移

宮頸癌為目前世界上女性惡性腫瘤之一，病死率在全球占68%～75%，位居女性惡性腫瘤病死率首位[1]。該類癌癥的發(fā)生與發(fā)展過程極為復(fù)雜，涉及多種抑癌基因以及原癌基因的抑制與激活情況。Kruppel樣因子4(KLF4)為近期發(fā)現(xiàn)的一種鋅指轉(zhuǎn)錄因子，主要參與細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡以及具有調(diào)節(jié)細(xì)胞周期等功能[2]。目前臨床上對于KLF4與癌癥發(fā)生發(fā)展之間的關(guān)系尚未明確。有學(xué)者認(rèn)為KLF4參與腫瘤遷徙，造成細(xì)胞增生以及發(fā)育異常，影響腫瘤的預(yù)后；但也有報(bào)道限制KLF4在癌細(xì)胞中有抑制癌癥擴(kuò)散的功能[3]。本研究檢測了不同宮頸癌組織中KLF4的表達(dá)，并對KLF4對宮頸癌的生長以及轉(zhuǎn)移的影響進(jìn)行探討，報(bào)道如下。

資料與方法

1一般資料收集2013年 11月至2015年 11月我院宮頸癌組織、正常宮頸組織以及宮頸原位癌組織樣本分別為34例、30例以及26例。所有組織均經(jīng)病理切片證實(shí)，其中34例宮頸癌組織均為鱗癌患者組織，患者年齡范圍為 29～66歲，平均年齡41.6±4.6歲。按照分化程度分類，39例宮頸癌患者中有9 例高分化、15 例中分化以及10 例低分化。按照國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟的臨床分期標(biāo)準(zhǔn)，39例宮頸癌患者中21 例I 期，7 例II期，5 例III期，1 例IV期。

2方法

2.1儀器與試劑：儀器：37℃恒溫培養(yǎng)箱(上海天呈科技有限公司)；酶標(biāo)儀(BMG， LABTECH POLARstar Omega)；自動(dòng)生化分析儀 LX-21(美國 BECKMAN 公司)；臺式高速度冷凍離心機(jī)(德國 ELRCRON 公司)；LightCycler?96 全自動(dòng)熒光定量PCR系統(tǒng)(Roche公司, 96 通量)。

試劑：SP 染色試劑盒(上?；鶢栴D生物科技有限公司)；兔抗人 KLF4 多克隆抗體(美國 DSL公司)。二氨基聯(lián)苯胺顯色劑(南京化學(xué)試劑有限公司)；多聚賴氨酸(Sigma公司)。

2.2免疫組織化學(xué):采用福爾馬林固定、石蠟包埋的方法將收集的癌及癌旁組織制備成石蠟切片，按照標(biāo)準(zhǔn)操作流程[4]，先將切片脫蠟水化。采用檸檬酸鈉(pH=6)溶液修復(fù)2min，雙氧水30ml/L常溫封閉10min，以破壞過氧化物酶的活性。采用PBS緩沖液洗滌三次后加入胚胎牛血清50mL/L封閉20min，隨后依次采用兔抗人KLF4多克隆抗體、羊抗兔IgG在 37℃條件下分別孵育2h及30min，每次孵育后采用PBS緩沖溶液沖洗3次。最后采用辣根過氧化酶標(biāo)記生物素染色，二氨基聯(lián)苯胺液顯色，蘇木精復(fù)染后，脫水，透明，封片，顯微鏡觀察各組織染色情況。根據(jù)最終細(xì)胞的染色強(qiáng)度以及顯色比例對KLF4進(jìn)行半定量分析。按照陽性細(xì)胞率以及顯色程度值進(jìn)行評價(jià)：陽性細(xì)胞數(shù)目>80%為4分，51%～80%為3分,11%～50%為2分；染色強(qiáng)為3分，染色中等為2分，染色弱為1分。當(dāng)陽性細(xì)胞率低于10%時(shí)，無論染色強(qiáng)度高低均認(rèn)為是陰性，用(-)表示；當(dāng)評分值在3～5分時(shí)，為弱陽性，用(+)表示；當(dāng)評分在6～7分時(shí)，為強(qiáng)陽性，用(++)表示。

2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測KLF4的mRNA的表達(dá):使用Trizol試劑(Invitrogen公司生產(chǎn))從宮頸癌組織以及宮頸原位癌組織中提取總RNA，隨后將提取的RNA在20μL反應(yīng)體系中逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用LightCycler?96 全自動(dòng)熒光定量PCR系統(tǒng)對各樣本進(jìn)行分析，每個(gè)樣本重復(fù)測定3次，測定具體條件為：94℃條件下反應(yīng)15min，60℃一集72℃各反應(yīng)30s，最終經(jīng)歷40個(gè)循環(huán)。測定循環(huán)閾值由儀器的熒光預(yù)設(shè)點(diǎn)為限。

2.4Western blot檢測KLF4蛋白的表達(dá)情況:將收集的宮頸癌組織以及宮頸原位癌組織中的組織蛋白采用蛋白裂解液法進(jìn)行提取，并通過Western blot法檢測其中的KLF4的表達(dá)情況。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用 SPSS19. 0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量數(shù)據(jù)采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間的比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)采用卡方檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1免疫組織化學(xué)檢測KLF4在宮頸癌中的表達(dá)情況由于檢測的KLF4存在于細(xì)胞核內(nèi)，因此本次研究中所顯示的檢測結(jié)果中組織細(xì)胞的細(xì)胞核為棕黃色，且分布模式多為彌漫性分布，少見點(diǎn)狀或灶狀分布。在正常宮頸組織以及原位癌組織中可見陰性細(xì)胞，且染色強(qiáng)度由下到上呈現(xiàn)增強(qiáng)趨勢。對比不同組織中KLF4陽性細(xì)胞率發(fā)現(xiàn)，正常宮頸組織以及宮頸原位癌組織中陽性細(xì)胞率均為100%，宮頸癌組織中陽性細(xì)胞率為58.8%，與正常宮頸組相比，陽性率顯著下降，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0 .05)。與正常宮頸組織相比，宮頸原位癌組織中呈現(xiàn)強(qiáng)陽性的數(shù)目明顯偏低，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0 .05)。具體結(jié)果見表1。

表1　免疫組織化學(xué)檢測KLF4在宮頸癌中的表達(dá)情況

注：與正常組織相比，*P<0 .05

2KLF4的mRNA及蛋白在宮頸癌以及宮頸原位癌組織中的表達(dá)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對宮頸癌組織以及宮頸原位癌組織中KLF4的mRNA表達(dá)情況進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示宮頸癌組織中KLF4的mRNA表達(dá)明顯低于宮頸原位癌組織，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。采用Western blot檢測宮頸癌組織以及宮頸原位癌組織中KLF4蛋白的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)在宮頸癌組織中KLF4蛋白的表達(dá)明顯低于宮頸原位癌組織，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3宮頸癌組織中 K LF4 蛋白表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)的關(guān)系KLF4 在不同臨床病理分級組織中表達(dá)不同，隨著分化程度的下降，蛋白表達(dá)陽性率也隨之降低；此外，該蛋白表達(dá)陽性率隨著臨床上分期的升高而降低，但其間差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具體結(jié)果見表2。

表2　宮頸癌組織中KLF4 蛋白表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

討論

KLF4基因據(jù)報(bào)道定位于染色體9q31上，是一種近期新發(fā)現(xiàn)的KLF家族轉(zhuǎn)錄因子，主要由470個(gè)氨基酸構(gòu)成的蛋白質(zhì)編碼形成。KLF4主要分布于人體皮膚、胃腸道、血管內(nèi)皮細(xì)胞等處，參與多種細(xì)胞生命活動(dòng)，包括細(xì)胞分化、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡等。目前KLF4與癌癥的關(guān)系尚未有明確解釋。有報(bào)道顯示， KLF4 通過下調(diào)細(xì)胞增生分化過程中基因表達(dá)、參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期以及細(xì)胞凋亡而發(fā)揮著抑制癌細(xì)胞擴(kuò)散與增長的作用[5]。

本研究采用免疫組織化學(xué)法、定量PCR法以及Western blot法對不同宮頸組織中KLF4的表達(dá)進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，宮頸癌組織中陽性細(xì)胞率為58.8%，明顯低于正常宮頸組織以及宮頸原位癌組織中陽性細(xì)胞率(100%)，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而KLF4在宮頸癌組織中的mRNA以及蛋白的表達(dá)也明顯低于宮頸原位癌組織，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明KLF4基因表達(dá)的下調(diào)可能伴隨著腫瘤的生長。有報(bào)道顯示，將MCF-1OA細(xì)胞中的KLF4基因進(jìn)行敲除后，乳腺永生化細(xì)胞株的上皮細(xì)胞形態(tài)有所改變，且細(xì)胞的遷移能力有所增加[6]；而過表達(dá)KLF4因子后，MDA-MB-231細(xì)胞中與細(xì)胞遷移以及細(xì)胞侵襲功能有關(guān)的E-cadherin因子表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞的遷移以及侵襲能力顯著下降。還有報(bào)道顯示， KLF4 的表達(dá)能夠抑制細(xì)胞生長以及細(xì)胞 DNA的合成，證實(shí)了KLF4 可能為一種抑癌基因[7]。

研究中還發(fā)現(xiàn)KLF4 在不同臨床病理分級組織中表達(dá)不同，隨著分化程度的下降，蛋白表達(dá)陽性率也隨之降低；此外，該蛋白表達(dá)陽性率隨著臨床上分期的升高而降低，但其間差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明KLF4可能影響腫瘤的轉(zhuǎn)移，當(dāng)KLF4水平較低時(shí)，宮頸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力較強(qiáng)，臨床上分期升高；經(jīng)過文獻(xiàn)查閱，認(rèn)為原因可能是KLF4 參與細(xì)胞增殖，影響并阻斷細(xì)胞周期 G1/S 期。有報(bào)道顯示， KLF4 在 P53 通路中具有活化 P21 的作用，進(jìn)而能夠保持細(xì)胞周期停止在G1/S 期而發(fā)揮抑制細(xì)胞增殖的作用[8]。此外，有研究證實(shí)，KLF4可以通過下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的表達(dá)，發(fā)揮抑制腫瘤遷移以及侵襲的作用。由于MMPs蛋白參與新生血管形成的某些金屬離子以及腫瘤的轉(zhuǎn)移、生長以及侵襲等過程，通過降解血管基底膜以及其他細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)，進(jìn)而降解腫瘤細(xì)胞中血管基底膜以及突破細(xì)胞外基質(zhì)中的蛋白，抑制腫瘤細(xì)胞的生長與遷移。高興強(qiáng)等[9]發(fā)現(xiàn)，采用高表達(dá)的KLF4胰腺癌細(xì)胞注射給予小鼠后，癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力受到明顯抑制，進(jìn)一步說明KLF4具有抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用。

綜上所述，KLF4與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切，其在人體內(nèi)的表達(dá)缺失或許是宮頸癌早期癌變的預(yù)兆，有望成為宮頸癌未來診斷以及治療的潛在靶標(biāo)。通過上調(diào)KLF4在宮頸癌組織中的表達(dá)可能可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖以及遷移，進(jìn)而降低腫瘤擴(kuò)散程度，有望為疾病的治療提供新思路。

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(收稿：2016-04-09)

【中圖分類號】R737.33

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1000-7377.2016.08.004

*河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)課題計(jì)劃(20160376)