TGF-β1受體以及Smad4/7在瘢痕癌組織表達(dá)的臨床病理學(xué)意義

劉進(jìn)輝,劉冬梅,叢　威,李明華*

(1.吉林省人民醫(yī)院 燒傷整形科,吉林 長(zhǎng)春130021;2.吉林油田總醫(yī)院 燒傷整形科,吉林 松原138001)

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TGF-β1受體以及Smad4/7在瘢痕癌組織表達(dá)的臨床病理學(xué)意義

劉進(jìn)輝1,劉冬梅1,叢威2,李明華1*

(1.吉林省人民醫(yī)院 燒傷整形科,吉林 長(zhǎng)春130021;2.吉林油田總醫(yī)院 燒傷整形科,吉林 松原138001)

法國(guó)外科醫(yī)師Marjolin于1928年首先提出由燒傷所致瘢痕形成潰瘍后發(fā)生癌變的報(bào)道[1]，因燒傷所致的攣縮瘢痕，常在關(guān)節(jié)的鄰近部位，因瘢痕組織脆弱，又不斷受到關(guān)節(jié)活動(dòng)的牽拉，反復(fù)破潰，經(jīng)年累月，終至癌變，瘢痕癌的發(fā)病率有逐年升高的趨勢(shì)。傷口愈合過(guò)程中，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β(transforming growth factor-β)是最重要作用的細(xì)胞因子，TGF-β參加了炎癥期、肉芽組織形成期、瘢痕形成期的全部過(guò)程。TGF-β亞型中TGF-β1 的含量最高，生物活力最強(qiáng)，在細(xì)胞基質(zhì)沉淀主要與成纖維化密切相關(guān)，如果通路被過(guò)度激活則導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)被過(guò)度沉淀，形成疤痕[2]。本研究通過(guò)檢測(cè)60份瘢痕癌組織標(biāo)本及58份癌旁組織標(biāo)本中TGF-β1受體以及Smad4/7的表達(dá)水平，進(jìn)一步探TGF-β1受體、Smad4/7與瘢痕癌的關(guān)系，有助于針對(duì)性指導(dǎo)患者的治療方案。

1資料和方法

1.1臨床資料

取我院病理科2010年1月-2014年2月標(biāo)本。其中瘢痕癌組織標(biāo)本60份，設(shè)為觀察組，男性35例，女性25例，年齡30-79歲，平均(42±5.99)歲，來(lái)源部位：頭面部21例，上肢19例，下肢20例，疤痕史5年以上。60份瘢痕癌標(biāo)本均經(jīng)過(guò)HE 染色，2位醫(yī)生在光鏡檢查明確診斷為瘢痕癌；58份癌旁組織設(shè)為對(duì)照組，其中男性31例，女性27例，年齡33-81歲，平均(43±7.34)歲，來(lái)源部位：頭面部18例，上肢18例，下肢22例。兩組標(biāo)本來(lái)源部位、年齡、性別等情況，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法

1.2.1試劑免疫組化SP試劑盒(Bio-Rad公司)；鼠抗人TGF-β1受體、單克隆抗體、Smad4、辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗鼠IgG 、Smad7(美國(guó)Cell Signaling公司)；dNTP、Pfu酶(上海生工生物工程有限公司)；PCR產(chǎn)物純化試劑盒及質(zhì)粒提取試劑盒(自上海生工生物工程公司)，基因組DNA提取試劑盒(Promega公司)。

1.2.2免疫組化染色(SP法)按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。TGF-β1受體、Smad4和Smad7蛋白陽(yáng)性以腫瘤細(xì)胞和癌旁組織上皮細(xì)胞胞質(zhì)或胞核內(nèi)有棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞。隨機(jī)選擇5個(gè)視野，計(jì)數(shù)每視野100個(gè)細(xì)胞中染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)[3]按陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和染色強(qiáng)度計(jì)分，分值為0-3分。不顯色或細(xì)胞數(shù)<10%為0分，為陰性；輕度顯色并且細(xì)胞數(shù)10%-25%或中重度顯色且細(xì)胞數(shù)<10%為1分，中重度顯色且細(xì)胞數(shù)為10%-25%或輕度顯色并且細(xì)胞數(shù)>25%為2分，中重度顯色且細(xì)胞數(shù)≥25%為3分?！?分為陽(yáng)性。

1.2.3Real-time PCR根據(jù)美國(guó)基因庫(kù)(GenBank)收錄的Smad基因序列，針對(duì)國(guó)內(nèi)TGF-β1受體、Smad4 、Smad7的基因片段保守區(qū)域(見(jiàn)表1)。進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。引物由廈門鷺隆生物技術(shù)有限公司合成并標(biāo)記，擴(kuò)增Ct值利用lightcycler熒光定量PCR儀配備軟件進(jìn)行分析。Real-Time PCR操作方法按照試劑盒說(shuō)明書(shū)，使用GAPDH作為內(nèi)部參照，將GAPDH的拷貝數(shù)作為校正基數(shù)，通過(guò)ABI7000軟件獲得檢測(cè)指標(biāo)Ct(cycle threshold)值，與同樣本中GAPDH的Ct值相減，即獲得該樣本中相應(yīng)指標(biāo)的ΔCt值。以假手術(shù)組ΔCt值作為校正，軟件根據(jù)2-ΔΔCT數(shù)值計(jì)算得出檢測(cè)指標(biāo)基因濃度水平。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序由廈門鷺隆生物技術(shù)有限公司完成。具體序列見(jiàn)表1。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS18.0對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料組間顯著性比較采用T檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以百分率表示。組間顯著性比較采用卡方檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1兩組組織中TGF-β1受體、Smad4和Smad7免疫組織化學(xué)染色結(jié)果見(jiàn)表2，圖1。

表1　Smad及GAPDH引物序列

注：反應(yīng)條件-預(yù)變性95℃ 15 min; 變性95℃ 40 s，退火62℃，延伸72℃ 60 s，共35個(gè)循環(huán)，PCR產(chǎn)物為800 bp

表2　瘢痕癌組織與癌旁組織TGF-β1受體、Smad4和Smad7的表達(dá)(%)

*表示與對(duì)照組比較，P<0.01

2.2Real-Time PCR結(jié)果

觀察組的TGF-β1受體、Smad4和Smad7基因顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，見(jiàn)表3。

表3　兩組標(biāo)本TGF-β1受體、Smad4和Smad7基因表達(dá)情況

注：*表示與對(duì)照組比較P<0.01，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3瘢痕癌患者癌組織TGF-β1、Smad4和Smad7表達(dá)與性別、年齡、病理類型和分化程度無(wú)關(guān)(P>0.05)，但是與燒傷史、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系密切(P<0.05)，見(jiàn)表4。

圖1　兩組TGF-β1受體、Smad4和Smad7蛋白表達(dá)情況

組別nTGF-β1陽(yáng)性PSmad4陽(yáng)性PSmad7陽(yáng)性P性別 男3518(51.4%)0.0913(37.1%)0.5219(54.0%)0.13 女2513(52.0%)9(36.0%)14(56.0%)分化程度 高、中分化3322(66.6%)0.0419(57.6%)0.0611(33.3%)0.04 低分化2711(40.7%)8(29.6%)15(55.6%)淋巴結(jié) 有轉(zhuǎn)移3724(64.9%)0.0318(48.6%)0.0419(27.9%)0.03 無(wú)轉(zhuǎn)移238(34.7%)7(30.4%)12(52.2%)

3討論

創(chuàng)傷愈合歷來(lái)就是外科學(xué)關(guān)注的重點(diǎn)項(xiàng)目，在此過(guò)程中，炎癥反應(yīng)等引起成纖維細(xì)胞(Fibroblast，F(xiàn)b)增殖失控和膠原蛋白等大量細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度產(chǎn)生和沉積，疤痕的形成是創(chuàng)傷愈合的必然結(jié)果，不同程度的瘢痕在累及一定深度的創(chuàng)面修復(fù)則導(dǎo)致創(chuàng)傷部位外觀出現(xiàn)異常[4]，如瘢痕面積較大或增生明顯則影響功能。瘢痕的形成與遺傳、免疫、激素、成纖維細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞因子[5]等諸多因素有關(guān)，屬于臨床的常見(jiàn)疾病。近年來(lái)，細(xì)胞因子在瘢痕形成過(guò)程中的作用越來(lái)越受到重視，故筆者認(rèn)為研究的發(fā)病機(jī)制具有重要的意義。諸多文獻(xiàn)資料對(duì)疤痕的形成機(jī)制進(jìn)行深入研究及闡述，但是其發(fā)生機(jī)制仍處于不斷探索中。

在受創(chuàng)傷皮膚的愈合過(guò)程中，許多血小板脫顆粒在皮膚創(chuàng)傷處沉積，而后許多單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和成纖維細(xì)胞都在TGF-β的作用下聚集在皮膚創(chuàng)傷處。TGF-β是一組具有多種生物學(xué)功能的蛋白多肽，主要包括五種亞型，其中TGF-β1 的含量最高，生物活力最強(qiáng)，能使造血功能及上皮的再生功能降低，使結(jié)締組織生長(zhǎng)的功能增強(qiáng)。作為體內(nèi)重要的具有多功能生物學(xué)活性的細(xì)胞因子，已被確認(rèn)在創(chuàng)傷修復(fù)過(guò)程中起重要作用。它的功能主要是調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞的增殖和結(jié)締組織、膠原蛋白的生成，可達(dá)到傷口愈合的目的[6-8]。TGF-β的過(guò)度產(chǎn)生與纖維化疾病有關(guān)，如肺纖維化，肺硬化，腎小球腎炎，增生性瘢痕硬化病等。

在TGF-β信號(hào)從細(xì)胞表面受體傳導(dǎo)至細(xì)胞核過(guò)程中Smads家族蛋白起關(guān)鍵作用，Smad是TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的標(biāo)志性蛋白，在這一過(guò)程中，不同亞型的Smad介導(dǎo)不同的TGF-β家族成員的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程。TGF-β形成的受體復(fù)合物能激活Smads入核，激活或抑制轉(zhuǎn)錄靶基因。TGF-β1/Smad3信號(hào)傳導(dǎo)通路與細(xì)胞外基質(zhì)沉積和纖維化形成有關(guān)。TGF-β1型受體磷酸化后活化下游的Smad2/ Smad3，與Smad4結(jié)合成復(fù)合體，從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，促進(jìn)靶基因的啟動(dòng)和轉(zhuǎn)錄。Smad7能降低TGF-β1的強(qiáng)度和活性時(shí)間，并抑制TGF-β/Smad信號(hào)通路的激活[9，10]，對(duì)TGF-β1起抑制作用。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，瘢痕癌標(biāo)本中TGF-β1受體及Smad4蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于癌旁組織；而Smad7在癌癥組織的陽(yáng)性表達(dá)率低于癌旁組織，說(shuō)明TGF-β1受體及Smad4蛋白與Smad7在抑制瘢痕癌方面作用相反。瘢痕癌有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的TGF-β1受體、Smad4陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于組無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，說(shuō)明瘢痕癌的發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)移有TGF-β1和Smad4參與。瘢痕癌有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的Smad7陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于組無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，說(shuō)明Smad7對(duì)瘢痕癌組織的發(fā)生、轉(zhuǎn)移起到抑制作用。隨著瘢痕癌腫瘤細(xì)胞分化程度的降低，Smad7在瘢痕癌組織中表達(dá)明顯增多，提示Smad7過(guò)表達(dá)可以通過(guò)阻斷TGF-β1/Smad細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)來(lái)調(diào)控TGF-β，使其抑制腫瘤作用減弱，腫瘤細(xì)胞進(jìn)一步發(fā)生轉(zhuǎn)移，故通過(guò)本實(shí)驗(yàn)研究TGF-β1受體、Smad4基因及Smad7基因的表達(dá)進(jìn)一步得出瘢痕癌的發(fā)生、發(fā)展、生物學(xué)行為規(guī)律，在臨床上可以通過(guò)早期檢測(cè)有可能癌變的瘢痕組織中三者含量預(yù)測(cè)瘢痕癌的發(fā)生。

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基金項(xiàng)目：吉林省自然科學(xué)基金(201215206)

*通訊作者

文章編號(hào)：1007-4287(2016)07-1140-03

(收稿日期：2016-02-08)