Th17細(xì)胞及IL-17在卵巢癌患者外周血中的表達(dá)及臨床意義

張　蓉,梅　紅,聶亞紅,馬艷輝*

(青島市中心醫(yī)院 1.檢驗(yàn)科;2.超聲科,山東 青島266042)

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Th17細(xì)胞及IL-17在卵巢癌患者外周血中的表達(dá)及臨床意義

張蓉1,梅紅2,聶亞紅1,馬艷輝1*

(青島市中心醫(yī)院 1.檢驗(yàn)科;2.超聲科,山東 青島266042)

卵巢癌(ovarian cancer，OC)是女性常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，死亡率占婦科腫瘤首位，已成為女性惡性腫瘤中威脅最大的疾病。目前，研究的熱點(diǎn)主要集中在腫瘤與機(jī)體免疫系統(tǒng)的關(guān)系，以及如何發(fā)揮機(jī)體免疫抗腫瘤功效等方面[1]。輔助性T細(xì)胞17(Th17)是獨(dú)立于Th1和Th2細(xì)胞的CD4+T細(xì)胞亞群，它特異性地分泌IL-17、IL-21和IL-22。Th17細(xì)胞及其細(xì)胞因子在胃癌、乳腺癌、前列腺癌中發(fā)生發(fā)展過(guò)程具有重要的調(diào)控作用[2,3]。臨床研究證實(shí)，Th17細(xì)胞及其細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-17(IL-17)在多種腫瘤患者的腫瘤組織及外周血中高表達(dá)，促進(jìn)腫瘤局部微血管的生成，進(jìn)而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[4,5]。

本研究采用流式細(xì)胞術(shù)和ELISA方法通過(guò)檢測(cè)卵巢癌患者外周血中Th17細(xì)胞含量及血清中IL-17表達(dá)變化，分析其與卵巢癌患者病理特征之間的關(guān)系，旨在探討Th17細(xì)胞及IL-17在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的免疫學(xué)作用。

1資料與方法

1.1一般資料

收集2013年1月-2015年1月青島市中心醫(yī)院收治的卵巢癌患者女性60例。以此為實(shí)驗(yàn)組。入組標(biāo)準(zhǔn)：所有患者手術(shù)前均未接受放療、化療及其他抗腫瘤治療，均獲得經(jīng)病理學(xué)和影像學(xué)確診。其中年齡范圍37-78歲，平均58±10.2歲；有吸煙史21例，無(wú)吸煙史39例；臨床分期(以美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)制定的TNM分期為標(biāo)準(zhǔn))：Ⅰ期9例，Ⅱ期18期，Ⅲ期20例，Ⅳ期13例；病發(fā)位置分為單側(cè)組、雙側(cè)組。單側(cè)組35例，雙側(cè)組25例。對(duì)照組選取同期來(lái)本院體檢的健康女性志愿者60例，年齡33-76歲，平均59.4±8.7歲，均排除各臟器病變，無(wú)感染性疾病或自身免疫性疾病等。所有患者及志愿者均知情同意。兩組年齡等一般資料無(wú)顯著差異，具有可比性。

1.2標(biāo)本采集

采集實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組受檢者手術(shù)前清晨空腹靜脈血3 ml兩管，其中一管血樣于室溫下自然凝集30 min，3 500×g離心15 min，收集血清，置于-20℃冰箱中保存待檢。

1.2.1細(xì)胞分析采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血中Th17的數(shù)量。具體地，每孔加入外周單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)1×105個(gè)(體積0.1 mL)，然后分別加入1 μg/mL Ionomycin和25 ng/mL PMA各20 μL，再加入10 μg/mL BFA 20 μL，放置于37℃、5%CO2孵箱中孵育4 h。加入FITC-Anti-Human CD3、APC-Anti-Human CD8室溫避光孵育30 min，固定破膜后加入PE-Anti-Human-IL-17，室溫避光孵育30 min，加入PBS使細(xì)胞重懸后上機(jī)檢測(cè)。

1.2.2細(xì)胞因子分析采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定IL-17含量：按照試劑說(shuō)明書(shū)操作，將標(biāo)準(zhǔn)品按濃度配置制成梯度標(biāo)準(zhǔn)品，依次加入反應(yīng)孔中，和樣品加入相應(yīng)板孔中，設(shè)置陰性對(duì)照。37℃孵育1 h，加入洗液清洗3次；加生物標(biāo)記素后孵育1 h，加入洗液清洗3次；加入HRP酶溶液孵育45 min后加入洗液清洗2次；加入顯色液、終止反應(yīng)，室溫孵育15 min，在10 min內(nèi)測(cè)定在波長(zhǎng)450 nm/620 nm吸光度值。

1.3主要試劑和儀器

Ionomycin、PMA、BFA、FITC-Anti-Human CD3、APC-Anti-Human CD8和PE-Anti-Human-IL-17抗體均購(gòu)自美國(guó)BD公司。Anti-Human-IL-17 ELISA試劑盒購(gòu)自R&D公司。RP-MI1640、D-hank’s緩沖液均購(gòu)自Hyclone公司。淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自MP Biomedicals公司。流式細(xì)胞儀為BD Accuri C6(USA，BD)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2結(jié)果

2.1OC組與對(duì)照組外周血Th-17細(xì)胞含量及IL-17水平的比較

通過(guò)FCM檢測(cè)OC組與對(duì)照組外周血Th-17細(xì)胞含量，結(jié)果表明OC組外周血Th-17細(xì)胞比例顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，通過(guò)ELISA檢測(cè)得到，OC組外周血IL-17水平顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，見(jiàn)表1。

表1　　　　OC患者與正常對(duì)照組外周血Th17細(xì)胞及IL-17

注：與對(duì)照組比較，**P< 0.01。

2.2OC患者Th-17細(xì)胞及IL-17水平與臨床病理特征的關(guān)系

通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析得出，OC患者處于Ⅲ - Ⅳ期時(shí)，其血清Th17細(xì)胞和IL-17水平明顯高于Ⅰ-Ⅱ期患者，差異極顯著(P<0.01)?；颊吣挲g、 吸煙史、分化級(jí)別和病發(fā)位置等病理特征與外周血Th17細(xì)胞及IL-17水平無(wú)明顯相關(guān)性,見(jiàn)表2。

表2　OC患者外周血Th17細(xì)胞及IL-17水平與臨床病理特征關(guān)系

注：與Ⅰ-Ⅱ期患者相比，**P< 0.01。

3討論

近年來(lái)，探索腫瘤與微環(huán)境之間的相互作用，成為主要的研究熱點(diǎn)。腫瘤微環(huán)境中存在諸多的細(xì)胞因子，它們通過(guò)參與和調(diào)控局部效應(yīng)細(xì)胞功能障礙、促進(jìn)抑制性細(xì)胞因子功能以及淋巴細(xì)胞的免疫負(fù)調(diào)節(jié)等作用促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。研究表明，前列腺癌、胰腺癌患者的外周血中，Th17細(xì)胞百分比和IL-17水平明顯高于正常人[6]。在肝癌、結(jié)腸癌、NSCLC等患者的腫瘤組織取樣檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，其Th17細(xì)胞所占比例明顯高于其他自身正常組織[7-9]。

Th17細(xì)胞屬于CD4+T細(xì)胞亞型，由IL-6和TGF-β誘導(dǎo)分化[10]，通過(guò)釋放IL-17實(shí)現(xiàn)其生物學(xué)效應(yīng)。而IL-17通過(guò)上調(diào)成纖維細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，誘導(dǎo)血管生成，以此促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移[11]。本研究結(jié)果表明，與正常對(duì)照組相比，OC患者外周血中Th17細(xì)胞和IL-17水平明顯升高，隨著臨床分期的增加，Ⅲ-Ⅳ期OC患者外周血Th17細(xì)胞的含量明顯上升(P<0.01)，IL-17的水平越高(P<0.01)，與報(bào)道相一致。這表明，Th17細(xì)胞可能直接參與了OC的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和侵襲，在腫瘤的病理進(jìn)展中促進(jìn)其向中后期發(fā)展，其機(jī)制可能與IL-17介導(dǎo)的VEGF相關(guān)信號(hào)通路有關(guān)，如CXCL1、CXCL5等血源性因子可促進(jìn)腫瘤內(nèi)微血管的顯著增加，利于腫瘤的生長(zhǎng)和浸潤(rùn)[12]。

綜上，Th17作為新型的輔助型T細(xì)胞，通過(guò)分泌炎癥性細(xì)胞因子IL-17在OC的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮一定作用，Th17可能成為OC患者生存期和死亡率的重要指標(biāo)之一。進(jìn)一步探討Th17細(xì)胞和IL-17在OC患者免疫調(diào)節(jié)過(guò)程中的作用及機(jī)制，可為探索OC的免疫學(xué)診斷和干預(yù)靶點(diǎn)奠定理論基礎(chǔ)。

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*通訊作者

文章編號(hào)：1007-4287(2016)07-1103-03

作者簡(jiǎn)介：張蓉(1970-),女,山東青島人,青島市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科主管檢驗(yàn)師,研究方向：臨床檢驗(yàn)。

(收稿日期：2015-06-08)