PM2.5對OVA所致大鼠變應(yīng)性鼻炎mTOR信號通路的影響

黃歆梅， 賀　鵬，黃連弟， 陳俊宇 ，許　多 ，陳鷺華 ，張　涵 ，張詠梅 ，滕　博* ，趙麗晶*

(1.吉林大學(xué)護(hù)理學(xué)院，吉林 長春130021；2.吉林大學(xué)第二醫(yī)院；3.吉林大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院)

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PM2.5對OVA所致大鼠變應(yīng)性鼻炎mTOR信號通路的影響

黃歆梅1， 賀鵬2，黃連弟3， 陳俊宇3，許多1，陳鷺華3，張涵1，張詠梅1，滕博2*，趙麗晶3*

(1.吉林大學(xué)護(hù)理學(xué)院，吉林 長春130021；2.吉林大學(xué)第二醫(yī)院；3.吉林大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院)

摘要：目的觀察可吸入顆粒物(PM2.5)對卵清蛋白(OVA)所致大鼠變應(yīng)性鼻炎(AR)的影響，并探討其作用機(jī)制。方法40只Wistar雌性大鼠隨機(jī)分為對照組、OVA對照組、PM2.5組和PM2.5+OVA組，以O(shè)VA基礎(chǔ)致敏及噴鼻激發(fā)制備大鼠變應(yīng)性鼻炎(AR)動物模型。血液分析儀檢測外周血中嗜酸性粒細(xì)胞百分比(Eos%)；ELISA方法檢測血清及鼻腔灌洗液中白三烯(LTB4)含量；免疫組織化學(xué)染色方法檢測mTOR信號通路相關(guān)蛋白。結(jié)果PM2.5顯著增加大鼠外周血中Eos% 以及血清和鼻腔灌洗液中LTB4含量，上調(diào)大鼠鼻黏膜上皮中mTOR、4EBP、EIF4E及HIF1α的表達(dá)。結(jié)論P(yáng)M2.5可通過激活大鼠鼻粘膜上皮細(xì)胞mTOR信號通路，參與調(diào)節(jié)AR的炎癥反應(yīng)。

關(guān)鍵詞：細(xì)顆粒物(PM2.5)；變應(yīng)性鼻炎；mTOR信號通路

(ChinJLabDiagn,2016,20:1055)

近年來，直徑小于2.5 μM的細(xì)顆粒物(PM2.5)所致的大氣污染日益嚴(yán)重，區(qū)域性霧霾已成為急需解決的問題[1]。長期暴露于大氣污染會導(dǎo)致免疫和炎癥反應(yīng)功能障礙，增加罹患變應(yīng)性鼻炎(allergic rhinitis，AR)和哮喘的風(fēng)險[2]。PM2.5對人類健康的影響已引起廣泛關(guān)注[3]，但有關(guān)PM2.5對AR影響的研究主要集中于流行病學(xué)，缺少動物實(shí)驗研究，且作用機(jī)制尚不明確。本研究制備大鼠AR模型，觀察PM2.5 對AR的影響，并探討PM2.5激活mTOR信號通路，破壞鼻粘膜固有免疫屏障的機(jī)制。

1材料與方法

1.1實(shí)驗動物40只雌性Wistar大鼠購于吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗動物中心，體重180-220 g，自由攝食飲水，自然晝夜光線照明，維持室溫20±2℃，濕度60%±2%。

1.2主要試劑卵清白蛋白(Ovalbumin，OVA)購自上海永葉生物科技有限公司；ELISA試劑盒購自eBioscience公司；單克隆抗體購于proteintech公司，免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3PM2.5的采集與處理PM2.5采集于中國科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所大氣環(huán)境與遙感綜合觀測場，采集時間為2014年秋至2015年春。石英濾膜分別在采樣前和采樣后于20℃恒溫干燥24 h并稱重，載有顆粒樣品的石英濾膜剪成小塊，于超純水中超聲震蕩15 min，真空冷凍干燥，加入PBS制成顆粒物懸液，高壓滅菌后4℃避光保存。

1.4AR大鼠動物模型制備40只Wistar大鼠隨機(jī)分為對照組(CON)、OVA 組、PM2.5組和OVA+PM2.5組，以卵清蛋白基礎(chǔ)致敏及滴鼻激發(fā)制備大鼠AR模型。OVA組和OVA+PM2.5 組分別于第0和7天腹腔注射5% OVA混懸液，于第21天以5% OVA混懸液雙側(cè)滴鼻進(jìn)行激發(fā)。對照組和PM2.5組分別給予生理鹽水。PM2.5組和OVA+PM2.5組大鼠分別于第7、14和21天滴鼻給予PM2.5 懸液(5 g/L，1 ml/kg)，對照組和OVA 組分別滴鼻給予等體積PBS。

1.5標(biāo)本采集與處理激發(fā)后24 h麻醉狀態(tài)下腹主動脈采血處死大鼠，分離血清-20℃保存。將硬膜外麻醉導(dǎo)管分別插入大鼠兩側(cè)鼻腔2 cm并固定，倒置大鼠后每側(cè)鼻腔用1 ml PBS灌洗2遍，收集鼻腔灌洗液，離心取上清，-20℃保存。取大鼠鼻腔呼吸區(qū)粘膜，10%甲醛固定，石蠟包埋切片。

1.6外周血中Eos%檢測取外周血20 μL，滴入0.38 ml嗜酸性粒細(xì)胞染色液，混勻后室溫靜置10 min，以自動血液細(xì)胞分析儀進(jìn)行EOS計數(shù)。

1.7鼻腔灌洗液及血清中LTB4檢測采用雙抗體夾心ELISA 法測定，按照說明書進(jìn)行操作，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得所測樣品的濃度。

1.8mTOR信號通路相關(guān)蛋白檢測組織學(xué)切片脫蠟后水洗，以3% H2O2封閉內(nèi)源性酶，熱抗原修復(fù)后加正常血清封閉，先后加入特異性一抗和HRP標(biāo)記的二抗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，鹽酸乙醇分化，中性樹膠封固。

2結(jié)果

2.1鼻腔灌洗液及血清中LTB4含量與對照組相比，OVA+PM2.5組大鼠血清及鼻腔灌洗液中LTB4含量顯著增高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

2.2外周血中嗜酸性粒細(xì)胞比值與對照組相比，PM2.5與OVA聯(lián)合處理后，大鼠外周血中嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)目明顯增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1　PM2.5對Eos%和LTB4的影響

*vs CON，P<0.05

2.3鼻粘膜組織中mTOR、4EBP、eIf4E和H1F-1α的表達(dá)mTOR(圖1)、EIf4E(圖2)、4EBP(圖3)和H1F-1α(圖4)的陽性染色為棕黃色顆粒，表達(dá)于鼻粘膜上皮細(xì)胞、腺體細(xì)胞和血管周圍炎性細(xì)胞，胞漿與胞核均著色。對照組中少見蛋白陽性表達(dá)。與OVA 組相比，PM2.5與OVA 聯(lián)合處理后，大鼠鼻粘膜上皮細(xì)胞中mTOR、4EBP、EIF4E、HIF1α 表達(dá)明顯上調(diào)。

圖1PM2.5對大鼠鼻黏膜mTOR表達(dá)的影響 圖2PM2.5對大鼠鼻黏膜EIF4E表達(dá)的影響

3討論

變應(yīng)性鼻炎(AR)是以鼻腔粘膜Th2免疫反應(yīng)為主的慢性過敏性炎癥。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)鼻腔激發(fā)刺激后，OVA組、PM2.5組和OVA+PM2.5組LTB4和外周血Eos%均明顯增高，以O(shè)VA+PM2.5組最為明顯。Eos%及LTB4是指導(dǎo)變態(tài)反應(yīng)的標(biāo)志[4，5]，這一結(jié)果提示，PM2.5能加重大鼠的AR癥狀。PM2.5進(jìn)入鼻腔后，可由于其自身的物理刺激或表面所吸附的重金屬及有機(jī)物的毒性作用，損傷鼻黏膜上皮纖毛系統(tǒng)，破壞上皮屏障的完整性，降低黏膜的清除能力，使OVA更易在鼻腔蓄積，因此PM2.5與OVA聯(lián)合處理可加重炎癥反應(yīng)。

圖3PM2.5對大鼠鼻黏膜4EBP表達(dá)的影響 圖4PM2.5對大鼠鼻黏膜H1F1α表達(dá)的影響

哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)與上皮細(xì)胞炎癥及功能紊亂密切相關(guān)，mTOR可通過調(diào)節(jié)T 細(xì)胞的代謝與功能[6]，參與過敏性氣道疾病[7，8]。TLR3可激活骨髓細(xì)胞的mTOR參與調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)[9]。Lorne E[10]等發(fā)現(xiàn)，mTORC1激活是TLR2誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞活化所必需的。Schmitz F[11]證明，TLR可通過PI3K-Akt途徑活化mTOR，進(jìn)而調(diào)節(jié)干擾素的轉(zhuǎn)錄。

為了進(jìn)一步探討PM2.5加重AR的機(jī)制，本研究檢測mTOR信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，與OVA組相比，PM2.5與OVA 聯(lián)合處理后，大鼠鼻粘膜上皮細(xì)胞中mTOR、4EBP、eIF4E和H1F-1α蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，提示PM2.5加重AR可能與mTOR信號通路有關(guān)。mTOR是一種保守的絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶[12]，與炎癥調(diào)控[13]、細(xì)胞增殖和生存[14]密切相關(guān)。AR是特應(yīng)性個體接觸致敏原后由IgE介導(dǎo)的多種免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子參與的鼻黏膜慢性炎癥反應(yīng)，中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞是參與AR的主要細(xì)胞。mTOR可調(diào)控中性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞功能，mTOR抑制劑可降低炎性介質(zhì)和細(xì)胞因子的產(chǎn)生[15]，并調(diào)節(jié)CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞及促炎細(xì)胞的平衡[16]。因此，由本研究結(jié)果推測，PM2.5加重AR的機(jī)制可能與mTOR信號通路激活相關(guān)，mTOR可能參與了鼻粘膜上皮細(xì)胞炎癥及功能紊亂。

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基金項目：國家自然科學(xué)基金(21407148、41205108)；中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項資金(JCKY-QKJC26)；吉林大學(xué)創(chuàng)新訓(xùn)練項目(2015741096)*通訊作者

文章編號：1007-4287(2016)07-1055-04

中圖分類號：R392.2

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

(收稿日期：2016-05-10)

Effect of PM2.5 on mTOR signaling pathway in OVA-induced allergic rhinitis of rats

HUANGXin-mei,HEPeng,HUANGLian-di,etal.

(NursingcollegeofJilinuniversity,Changchun130021 ,China)

Abstract:ObjectiveTo study the effect of inhalable particle (PM2.5) on ovalbumin induced allergic rhinitis (AR) of rats and discuss its mechanism.MethodsForty female Wistar rats were randomly divided into four groups:control group,OVA control group,PM2.5 group and PM2.5 plus OVA group.The animal model of AR were basically allergized and provoked through nasal cavity by OVA.The percentage of eosinophils (Eos%) in peripheral blood was measured by automatic blood analysis; the levels of leukotriene B4 (LTB4) in serum and urinarynasal lavage fluid were measured by ELISA; the expression of mTOR signaling related protein were detected by immunohistochemical staining.ResultsAfter treated by PM2.5,the Eos% and the levels of LTB4 were increased,the expression of mTOR,4EBP,EIF4E and HIF1ɑin rat nasal epithelial cells were up-regulated. ConclusionPM2.5 regulate the inflammation of allergic rhinitis by activating mTOR signal pathway in rat nasal epithelial cells.

Key words:particulate matter (PM2.5); allergic rhinitis; mTOR signaling pathway