潰瘍性結(jié)腸炎模型鼠中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞亞群變化的研究

馬亞會， 張 杰， 邵淑琳， 肖魯瑤， 劉心娟

1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院消化內(nèi)科，北京 100029； 2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院消化內(nèi)科

潰瘍性結(jié)腸炎模型鼠中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞亞群變化的研究

馬亞會1， 張 杰1， 邵淑琳1， 肖魯瑤1， 劉心娟2

1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院消化內(nèi)科，北京 100029； 2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院消化內(nèi)科

目的 探討潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)模型鼠不同組織中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells，Treg)亞群的變化。方法 通過飲用2.5%葡聚糖硫酸鈉(Dextran sulfate sodium，DSS)溶液誘導(dǎo)UC模型鼠，應(yīng)用流式技術(shù)測定實驗鼠外周血、腸系膜淋巴結(jié)、脾臟、回腸固有層、結(jié)腸固有層黏膜中Treg細(xì)胞亞群、CD4+CD25+FoxP3+IL-17+數(shù)量；分選上述組織單個核細(xì)胞中Treg細(xì)胞中的FrⅢ亞群，檢測FoxP3、IL-17、RORC mRNA表達(dá)水平。結(jié)果 在UC模型鼠的脾臟、腸系膜淋巴結(jié)、回腸固有層、結(jié)腸固有層黏膜中，Treg細(xì)胞FrⅠ亞群水平均顯著高于正常對照組(P<0.05)。在外周血、腸系膜淋巴結(jié)、回腸固有層、結(jié)腸固有層中，UC模型鼠中Treg細(xì)胞中FrⅡ亞群水平均顯著低于正常對照組(P<0.05)，而Treg細(xì)胞FrⅢ亞群水平均顯著高于正常對照組(P<0.05)。在UC模型鼠的外周血、腸系膜淋巴結(jié)、回腸固有層、結(jié)腸固有層中，Treg細(xì)胞FrⅢ亞群相關(guān)基因表達(dá)如下：FoxP3 mRNA表達(dá)水平低于正常對照組(P<0.05)；IL-17A、RORC mRNA表達(dá)水平高于正常對照組(P<0.05)。在UC模型鼠的外周血、腸系膜淋巴結(jié)、回腸固有層、結(jié)腸固有層中，CD4+CD25+FoxP3+IL-17+細(xì)胞水平高于正常對照組(P<0.05)。結(jié)論 UC模型鼠中存在FrⅡ亞群減少、FrⅢ亞群增多和FrⅠ亞群轉(zhuǎn)化障礙，Treg細(xì)胞亞群間的這種變化可能是Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞失衡的內(nèi)在原因。

潰瘍性結(jié)腸炎；Th17細(xì)胞；調(diào)節(jié)性T細(xì)胞亞群

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)發(fā)病可能與腸道黏膜屏障功能缺陷、異常免疫反應(yīng)、感染、遺傳和腸道微生態(tài)失調(diào)等有關(guān)，其中在免疫反應(yīng)方面CD4+T細(xì)胞在UC中起重要作用[1-2]。文獻(xiàn)報道[3]在UC患者腸管黏膜中Treg細(xì)胞功能受損伴Th17細(xì)胞數(shù)量增多，證實UC中Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞免疫失衡，這種異常免疫可能參與了UC的發(fā)病。

Treg細(xì)胞依據(jù)功能不同可分為3種亞群[4-5]，分別是CD45RA+Foxp3lowresting Treg細(xì)胞(rTreg，F(xiàn)rⅠ)、CD45RA-Foxp3highactived Treg細(xì)胞(aTreg，F(xiàn)rⅡ)和CD45RA-Foxp3low非抑制性T細(xì)胞(FrⅢ)；其中FrⅡ是主要發(fā)揮免疫抑制功能的一群細(xì)胞；FrⅡ型細(xì)胞的減少嚴(yán)重影響Treg細(xì)胞功能；FrⅠ是一群靜息狀態(tài)的Treg細(xì)胞；FrⅢ細(xì)胞則是沒有抑制功能的細(xì)胞，但可以分泌IL-17，存在轉(zhuǎn)化為Th17細(xì)胞的潛能。在自身免疫病中存在著Treg亞群的異常[6]。本研究通過對Treg細(xì)胞亞群的研究，進(jìn)一步剖析Treg/Th17 細(xì)胞失衡的內(nèi)在原因。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 實驗動物選用C57BL/6小鼠(購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司)，6～8周齡，18～20 g，均為雄性，共10只，為SPF級。每日標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)、自由飲水及日常光照。

1.2 試劑 葡聚糖硫酸鈉(DSS)(MP Biomedical)，CD4-PerCP(BD PharmingenTM)，CD25-APC(BD PharmingenTM)，CD45RA-PE(BD PharmingenTM)，IL-17-Alexa Fluor?488(BD PharmingenTM)，F(xiàn)oxP3-PE-Cyanine7(eBioscience)，CD3e-PE-CF594(BD HorizonTM)，CD8a-BV510(BD HorizonTM)，fixation and permeabilization(eBioscience)，RNeasy Micro Kit(Qiagen)FastQuant RT Kit(With gDNase)(TIANGEN)，SuperReal PreMix Plus (SYBR Green)(TIANGEN)；GAPDH Primer(PMM04，Shenggong)，F(xiàn)oxP3，IL-17 RORC mRNA引物(上海生工生物技術(shù)有限公司設(shè)計并合成)。引物序列見表1。

表1 小鼠Real-time PCR引物序列

Tab 1 The sequences of primers for Real-time PCR in mice

PrimersForward(5'-3') Reverse(5'-3') FoxP3mRNA CTGCCTTGGTACATTCGTGACAGATGTTGTGGGTGAGTGCIL-17mRNA CTGTGTCAATGCGGAGGGAACGACCCTGAAAGTGAAGGGGRORCmRNA ACGGCCAACTTACTCTTGGAAGAAACTGGGAATGCAGTGG

1.3 方法

1.3.1 實驗分組：C57BL/6雄性小鼠隨機分成正常對照組和潰瘍性結(jié)腸炎模型組(UC模型組)，每組小鼠各5只。正常對照組飲用蒸餾水14 d，UC組口服2.5% DSS溶液7 d，繼之改飲蒸餾水7 d；造模為期14 d，14 d后脫頸處死小鼠并取材進(jìn)行檢測。按照Murthy評分系統(tǒng)[7](見表2)評估小鼠UC活動度指數(shù)(disease activity index，DAI)，結(jié)腸組織病理學(xué)表現(xiàn)評估UC結(jié)腸的炎癥，證實造模成功。

表2 小鼠結(jié)腸炎疾病活動指數(shù)評估(DAI)

Tab 2 The assessment of disease activity index (DAI) in UC mice

分?jǐn)?shù)體質(zhì)量減輕率(%)糞便黏稠度隱形/肉眼血便0(-)正常(顆粒狀、成形)正常11～5 ——26～10松軟(糊狀不黏附肛門)潛血陽性311～15 ——4>15腹瀉(水樣、黏附肛門)血便

注：DAI=(體質(zhì)量減輕率+大便黏稠度+隱形/肉眼血便的總分?jǐn)?shù))/3。

1.3.2 Treg細(xì)胞亞群水平檢測：提取小鼠外周血、脾臟、腸系膜淋巴結(jié)、回腸固有層黏膜、結(jié)腸固有層黏膜單個核細(xì)胞，在24孔培養(yǎng)皿中加入2 μl白細(xì)胞混合刺激劑/106個細(xì)胞，放置恒溫箱(5%CO237 ℃)培養(yǎng)5 h，避光孵育CD4、CD25、CD45RA抗體15 min；按照操作手冊細(xì)胞破膜后避光孵育FoxP3、IL-17抗體20 min，應(yīng)用Beckman流式細(xì)胞儀分析Treg細(xì)胞亞群、CD4+CD25+FoxP3+IL-17+水平。

1.3.3 細(xì)胞分選：BD FACS Arial Ⅱ流式分選儀分選實驗鼠外周血、脾臟、腸系膜淋巴結(jié)、回腸固有層黏膜、結(jié)腸固有層黏膜的FrⅢ亞群細(xì)胞。

1.3.4 FoxP3、IL-17、RORC mRNA檢測：應(yīng)用RNeasy Micro Kit(Qiagen)提取FrⅢ亞群細(xì)胞總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。用Real-time PCR(SYBR Green方法)檢測FoxP3、IL-17 RORC mRNA水平。

2 結(jié)果

2.1 UC模型鼠不同組織中Treg細(xì)胞亞群的變化

2.1.1 UC模型組小鼠不同組織中FrⅠ亞群細(xì)胞水平變化及分布特點：UC模型鼠的脾臟、腸系膜淋巴結(jié)、回腸固有層黏膜、結(jié)腸固有層黏膜中FrⅠ亞群細(xì)胞水平顯著高于正常對照組(P<0.01)，而外周血中兩組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.3442，見表3)。

UC模型鼠中結(jié)腸固有層黏膜中FrⅠ亞群細(xì)胞水平顯著高于腸系膜淋巴結(jié)、脾臟、外周血、回腸固有層黏膜(P<0.01)，腸系膜淋巴結(jié)、脾臟、外周血、回腸固有層黏膜之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；正常對照組中結(jié)腸固有層黏膜FrⅠ亞群細(xì)胞水平顯著高于外周血、脾臟、回腸固有層黏膜、腸系膜淋巴結(jié)(P<0.01)，脾臟與回腸固有層黏膜間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.1.2 UC模型鼠不同組織中FrⅡ亞群細(xì)胞水平變化及分布特點：UC模型鼠外周血、腸系膜淋巴結(jié)、回腸固有層黏膜、結(jié)腸固有層黏膜中FrⅡ亞群細(xì)胞水平顯著低于正常對照組(P<0.05)，脾臟中兩組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，見表3)。

UC模型鼠的結(jié)腸固有層黏膜中FrⅡ亞群細(xì)胞水平顯著高于外周血、回腸固有層黏膜、腸系膜淋巴結(jié)、脾臟(P<0.01)，脾臟、回腸固有層黏膜之間和腸系膜淋巴結(jié)、外周血之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；正常對照組結(jié)腸黏膜固有層黏膜中FrⅡ亞群細(xì)胞水平顯著高于回腸固有層黏膜、脾臟、腸系膜淋巴結(jié)、外周血(P<0.05)，腸系膜淋巴結(jié)與外周血之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.1.3 UC模型鼠不同組織中FrⅢ亞群細(xì)胞水平變化及分布特點：UC模型鼠外周血、腸系膜淋巴結(jié)、回腸固有層黏膜、結(jié)腸固有層黏膜中FrⅢ亞群細(xì)胞水平顯著高于正常對照組(P<0.05)，脾臟中兩組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，見表3)。

組別只數(shù)FrⅠ型細(xì)胞FrⅡ型細(xì)胞FrⅢ型細(xì)胞CD4+CD25+FoxP3+IL-17+正常對照組 外周血50.345±0.0350.250±0.0442.628±0.4031.464±0.476 腸系膜淋巴結(jié)50.052±0.00960.250±0.0304.370±0.9701.450±0.400 回腸黏膜50.158±0.0180.880±0.0704.540±1.2202.530±0.990 結(jié)腸黏膜50.557±0.1201.310±0.2308.800±1.6503.180±0.640 脾臟50.120±0.00940.420±0.0906.750±1.3103.020±0.730UC模型組 外周血50.480±0.1260.160±0.033a5.526±0.707a2.280±0.592a 腸系膜淋巴結(jié)50.414±0.095a0.140±0.020a6.570±1.660a2.460±0.630a 回腸黏膜50.397±0.039a0.440±0.100a6.160±0.860a5.340±1.300a 結(jié)腸黏膜51.580±0.070a0.850±0.090a17.840±2.190a5.670±1.870a 脾臟50.452±0.074a0.370±0.0908.170±2.2003.300±0.930

注：與正常對照組比較，aP<0.05。

UC模型鼠結(jié)腸固有層黏膜中FrⅢ亞群細(xì)胞顯著高于腸系膜淋巴結(jié)、脾臟、回腸固有層黏膜、外周血(P<0.01)，腸系膜淋巴結(jié)、脾臟、回腸固有層黏膜中比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；正常對照組結(jié)腸黏膜固有層黏膜中FrⅢ亞群細(xì)胞水平顯著高于脾臟、腸系膜淋巴結(jié)、回腸固有層黏膜、外周血(P<0.05)，腸系膜淋巴結(jié)與回腸固有層黏膜間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.1.4 UC模型鼠不同組織中CD4+CD25+FoxP3+IL-17A+細(xì)胞水平變化和分布特點：UC模型鼠外周血、腸系膜淋巴結(jié)、回腸固有層黏膜、結(jié)腸固有層黏膜中CD4+CD25+FoxP3+IL-17A+細(xì)胞水平顯著高于正常對照組(P<0.05)；脾臟中兩組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05,見表3)。

UC模型鼠結(jié)腸固有層黏膜中CD4+CD25+FoxP3+IL-17A+細(xì)胞水平顯著高于脾臟、腸系膜淋巴結(jié)、外周血(P<0.05)，結(jié)腸固有層與回腸固有層比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，腸系膜淋巴結(jié)與外周血差異比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；正常對照組中結(jié)腸固有層黏膜顯著高于回腸固有層黏膜、腸系膜淋巴結(jié)、外周血(P<0.05)，脾臟與結(jié)腸固有層黏膜間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，腸系膜淋巴結(jié)與外周血間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 UC模型鼠不同組織FrⅢ亞群細(xì)胞中相關(guān)基因表達(dá)

2.2.1 UC模型鼠不同組織中FrⅢ亞群細(xì)胞FoxP3 mRNA表達(dá)：UC模型鼠外周血、腸系膜淋巴結(jié)、回腸固有層黏膜、結(jié)腸固有層黏膜FrⅢ亞群細(xì)胞FoxP3 mRNA表達(dá)水平顯著低于正常對照組(P<0.05)，脾臟中兩組間比較FoxP3 mRNA表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，見表4)。

UC模型和正常對照小鼠不同組織中FrⅢ亞群細(xì)胞FoxP3 mRNA表達(dá)水平一致：脾臟和結(jié)腸固有層黏膜顯著高于外周血(P<0.05)，外周血、回腸黏膜固有層、腸系膜淋巴結(jié)之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，脾臟、結(jié)腸固有層黏膜、回腸固有層黏膜之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.2.2 UC模型鼠不同組織中FrⅢ亞群細(xì)胞IL-17A mRNA表達(dá)： UC小鼠外周血、腸系膜淋巴結(jié)、回腸固有層黏膜、結(jié)腸固有層黏膜FrⅢ亞群細(xì)胞IL-17A mRNA表達(dá)水平顯著高于正常對照組(P<0.05)，脾臟中兩組間比較IL-17A mRNA表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，見表4)。

UC模型鼠和正常對照小鼠不同組織中FrⅢ亞群細(xì)胞IL-17mRNA表達(dá)分布水平一致：回腸固有層黏膜顯著高于結(jié)腸固有層黏膜、外周血、脾臟、腸系膜淋巴結(jié)(P<0.05)，結(jié)腸固有層黏膜、外周血間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.2.3 UC模型鼠不同組織中FrⅢ亞群細(xì)胞RORC mRNA表達(dá)： UC模型小鼠外周血、腸系膜淋巴結(jié)、回腸固有層黏膜、結(jié)腸固有層黏膜FrIII亞群細(xì)胞RORC mRNA表達(dá)水平顯著高于正常對照組(P<0.05)，脾臟兩組見比較IL-17A mRNA表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，見表4)。

UC模型鼠回腸固有層黏膜FrⅢ亞群細(xì)胞RORC mRNA表達(dá)水平顯著高于結(jié)腸固有層黏膜、外周血、脾臟、腸系膜淋巴結(jié)(P<0.05)；正常對照組中回腸固有層黏膜顯著高于結(jié)腸固有層黏膜、外周血、脾臟、腸系膜淋巴結(jié)(P<0.05)，外周血與結(jié)腸固有層黏膜比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

組別只數(shù)FoxP3mRNAIL-17mRNARORCmRNA正常對照組 外周血30.6296±0.06380.0432±0.00420.0458±0.0097 腸系膜淋巴結(jié)40.8999±0.10300.0044±0.00090.0043±0.0010 回腸黏膜30.8507±0.05060.2165±0.02380.2455±0.0708 結(jié)腸黏膜40.8613±0.01750.0458±0.01370.0697±0.0103 脾臟30.8427±0.02640.0118±0.00310.0135±0.0016UC模型組 外周血40.4180±0.0372a0.0944±0.0115a0.0926±0.0121a 腸系膜淋巴結(jié)30.5027±0.0548a0.0093±0.0011a0.0089±0.0002a 回腸黏膜30.4257±0.0832a0.4323±0.0567a0.5717±0.0046a 結(jié)腸黏膜30.6323±0.0103a0.1034±0.0142a0.1431±0.0101a 脾臟30.7501±0.08720.0191±0.00270.0162±0.0026

注：與正常對照組比較，aP<0.05。

3 討論

UC屬于炎癥性腸病的一種常見類型，病變累及結(jié)腸黏膜層。研究發(fā)現(xiàn)UC存在獲得性免疫異常，并且在UC的發(fā)病中起重要作用，尤其是Treg和Th17細(xì)胞[8]。Treg細(xì)胞通過細(xì)胞間的直接接觸或分泌IL-10和TGF-β等細(xì)胞因子作用于效應(yīng)T細(xì)胞，發(fā)揮免疫抑制作用，維持機體免疫平衡以及免疫耐受[9-10]。Th17細(xì)胞屬于炎癥反應(yīng)性細(xì)胞，特征性分泌IL-17A、IL-17F等促炎癥細(xì)胞因子對抗外來病原菌或異物[11]，此外，Th17細(xì)胞在IL-23促炎癥因子的協(xié)同下可以引起腸道黏膜和腸道益生菌群的破壞[12]。在正常機體中兩者處于動態(tài)平衡狀態(tài)，維持機體免疫平衡。研究[3]發(fā)現(xiàn)在UC腸道黏膜中，Treg細(xì)胞數(shù)量升高伴Treg細(xì)胞功能減退；而Th17細(xì)胞數(shù)量明顯升高，且Th17細(xì)胞浸潤水平與腸道炎癥反應(yīng)呈正相關(guān)[13-14]。也有研究[15]報道在UC外周血中Treg細(xì)胞數(shù)量是升高還是降低存在差異，但發(fā)現(xiàn)其功能減弱，同時文獻(xiàn)[16]報道UC外周血Th17細(xì)胞數(shù)量增多。由此可見，在免疫反應(yīng)方面UC患者中存在Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞之間的免疫失衡。

本研究將Treg細(xì)胞亞群的概念引入UC的研究，研究顯示FrⅢ水平升高而FrⅡ水平降低，提示真正發(fā)揮免疫抑制功能的Treg細(xì)胞減少，取而代之的是FoxP3低表達(dá)且沒有免疫抑制功能的FrⅢ升高。后者不但沒有免疫抑制功能，且有向Th17分化的潛能，表達(dá)IL-17，呈現(xiàn)FoxP3和IL-17共表達(dá)的特性。已有文獻(xiàn)[15]證實在炎癥性腸病(IBD)患者中外周血存在共表達(dá)FoxP3和IL-17A CD4+T細(xì)胞(IL-17和FoxP3 DE CD4+T cell)，同時表達(dá)RORγt和FoxP3 mRNA。這種細(xì)胞處于一種中間狀態(tài)，在CD4+T細(xì)胞因子(比如IL-1β、IL-2、IL-21等)的影響下，可以轉(zhuǎn)變?yōu)門h17細(xì)胞，同時發(fā)現(xiàn)IL-17和FoxP3 DE CD4+T細(xì)胞免疫抑制功能減少60%[15]。在IBD患者中，F(xiàn)oxP3和 IL-17A DE CD4+T細(xì)胞的存在是導(dǎo)致Treg細(xì)胞功能減退以及Th17細(xì)胞升高的原因[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，UC模型鼠FrⅢ型細(xì)胞和CD4+CD25+FoxP3+IL-17+細(xì)胞較正常對照組升高，F(xiàn)rⅢ型細(xì)胞共表達(dá)RORC和FoxP3 mRNA基因，提示FrⅢ型細(xì)胞是FoxP3和IL-17A DE CD4+T提供者。在UC的病態(tài)微環(huán)境中Treg細(xì)胞獲得轉(zhuǎn)化為Th17細(xì)胞的潛能，真正發(fā)揮免疫抑制功能的FrⅡ細(xì)胞數(shù)量減少，導(dǎo)致Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞失衡伴Treg細(xì)胞功能減退。

最初人們認(rèn)為，初始T細(xì)胞(naive T)向Treg細(xì)胞分化過程中表達(dá)了FoxP3，并失去表達(dá)RORC的能力，但是近年來研究發(fā)現(xiàn)Treg細(xì)胞在某些因素的誘導(dǎo)下可重新獲得表達(dá)RORC的能力，從而向Th17細(xì)胞轉(zhuǎn)化，但是這種轉(zhuǎn)化主要發(fā)生在外周淋巴組織，而非中樞淋巴系統(tǒng)[18-19]。我們發(fā)現(xiàn)在UC模型樹中結(jié)腸固有層黏膜、回腸固有層黏膜單個核細(xì)胞中共表達(dá)RORC和FoxP3 mRNA的FrⅢ亞群細(xì)胞比例升高，同時CD4+CD25+FoxP3+IL-17+細(xì)胞主要存在于結(jié)腸固有層黏膜、回腸固有層黏膜，說明FrⅢ型細(xì)胞轉(zhuǎn)化為Th17細(xì)胞的這一現(xiàn)象主要出現(xiàn)在外周淋巴組織，極少出現(xiàn)在脾臟中。提示在UC中，Treg獲得向Th17分化的潛能并失去正常功能，僅發(fā)生在外周淋巴組織，不發(fā)生在中樞淋巴系統(tǒng)。

FrⅠ亞群細(xì)胞是靜息狀態(tài)的細(xì)胞，可轉(zhuǎn)化為FrⅡ亞群功能細(xì)胞，本研究發(fā)現(xiàn)在UC模型鼠中，結(jié)腸固有層黏膜、腸系膜淋巴結(jié)、回腸固有層黏膜單個核細(xì)胞中FrⅠ亞群數(shù)量增多，且在結(jié)腸固有層黏膜分布最多，提示UC模型鼠中FrⅠ的儲備是正常的，可能存在FrⅠ轉(zhuǎn)化障礙，其機制仍需進(jìn)一步研究[5-6]。

綜上所述，UC存在Treg/Th17細(xì)胞失衡，在UC模型鼠中增多的FrⅢ亞群細(xì)胞共表達(dá)FoxP3、RORC mRNA，提示免疫抑制功能下降且存在轉(zhuǎn)化為Th17細(xì)胞的潛能。由此可見，F(xiàn)rⅢ亞群增多、FrⅡ亞群減少協(xié)同F(xiàn)rⅠ亞群轉(zhuǎn)化障礙可能是Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞失衡的原因，共同參與了UC的發(fā)病。

[1]Danese S, Fiocchi C. Ulcerative colitis [J]. N Engl J Med, 2011, 365(18): 1713-1725.

[2]Gómez-Gómez GJ, Masedo, Yela C, et, al. Current stage in inflammatory bowel disease: What is next? [J]. World J Gastroenterol, 2015, 21(40): 11282-11303.

[3]Maul J, Loddenkemper C, Mundt P, et al. Pripheral and intestinal regulatory CD4+CD25 (high) T cells in inflammatory bowel disease [J]. Gastroenterology, 2005, 128(7): 1868-1878.

[4]Zhang H, Kong H, Zeng X, et al. Subsets of regulatory T cells and their roles in allergy [J]. J Transl Med, 2014, 12: 125.

[5]Miyara M, Yoshioka Y, Kitoh A, et al. Functional delineation and differentiation dynamics of human CD4+T cells expressing the FoxP3 transcription factor [J]. Immunity, 2009, 30(6): 899-911.

[6]Liu X , Gao N, Li M, et al. Elevated levels of CD4+CD25+Foxp3+T cells in systemic sclerosis patients contribute to the secretion of IL-17 and immunosuppression dysfunction [J]. PLoS One, 2013, 8(6): e64531.

[7]Cooper HS, Murthy SN, Shah RS, et al. Clinicopathologic study of dextran sulfate sodium experimental murine colitis [J]. Lab Invest, 1993, 69(2): 238-249.

[8]Shale M, Schiering C, Powrie F. CD4+T-cell subsets in intestinal inflammation [J]. Immunol Rev, 2013, 252(1): 164-182.

[9]Guerin LR, Prins JR, Robertson SA. Regulatory T-cells and immune tolerance in pregnancy: a new targetfor infertility treatment? [J]. Human Reprod Update, 2009, 15(5): 517-535.

[10]Mayne CG, Williams CB. Induced and natural regulatory T cells in the development of inflammatory bowel disease [J]. Inflamm Bowel Dis, 2013, 19(8): 1772-1788.

[11]C?tan? CS, Berindan Neagoe I, Cozma V, et al. Contribution of the IL-17/IL-23 axis to the pathogenesis of inflammatorybowel disease [J]. Word J Gastroenterol, 2015, 21(19): 5823-5830.

[12]Xu XR, Liu CQ, Feng BS, et al. Dysregulation of mucosal immune response in pathogenesis of inflammatory bowel disease [J]. World J Gastroenterol, 2014, 20(12): 3255-3264.

[13]Ivanov II, Atarashi K, Manel N, et al. Induction of intestinal Th17 cells by segmented filamentous bacteria [J]. Cell, 2009, 139(3): 485-498.

[14]Niess JH, Leith?user F, Adler G, et al. Commensal gut flora drives the expansion of proinflammatory CD4 T cells in the colonic lamina propria under normal and inflammatory conditions [J]. J Immunol, 2007, 180(1): 559-568.

[15]Ueno A, Jijon H, Chan R, et al. Increased prevalence of circulating novel IL-17 secreting Foxp3 expressing CD4+T cells and defective suppressive function of circulating Foxp3+regulatory cells support plasticity between Th17 and regulatory T cells in inflammatory bowel disease patients [J]. Inflamm Bowel Dis, 2013, 19(12): 2522-2534.

[16]Dong Z, Du L, Xu X, et, al. Aberrant expression of circulating Th17, Th1 and Tc1 cells in patients with active and inactive ulcerative colitis [J]. Int J Mol Med, 2013, 31(4): 989-997.

[17]Li L, Boussiotis VA. The role of IL-17-producing Foxp3+CD4+T cells in inflammatory bowel disease and colon cancer [J]. Clin Immunol, 2013, 148(2): 246-253.

[18]Voo KS, Wang YH, Santorib FR, et al. Identification of IL-17-producing Foxp3+regulatory T cells in humans [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2009, 106(12): 4793-4798.

[19]Schmidl C, Hansmann L, Andreesen R, et al. Epigenetic reprogramming of the RORC locusduringin vitro expansion is a distinctive feature of humanmemory but not naive Treg [J]. Eur J Immunol, 2011, 41(5): 1491-1498.

(責(zé)任編輯：陳香宇)

The changes of regulatory T cell subsets in DSS-induced ulcerative colitis mice

MA Yahui1, ZHANG Jie1, SHAO Shulin1, XIAO Luyao1, LIU Xinjuan2

1.Department of Gastroenterology, Beijing Anzhen Hospital, Capital Medical University, Beijing 100029; 2.Department of Gastroenterology, Beijing Chaoyang Hospital, Capital Medical University, China

Objective To investigate the changes of regulatory T cell (Treg) subsets in ulcerative colitis (UC) mice. Methods Mice were randomly divided into UC group and healthy control group. The UC group were induced by 2.5% Dextran sulfate sodium (DSS) solution. The pathological manifestations of colon tissue were observed by Hematoxylin-Eosin staining. The Treg cell subsets and CD4+CD25+FoxP3+IL-17+were evaluated by flow cytometry, after extracting the mononuclear cells from peripheral blood (PB), spleen (SP), mesenteric lymph node (MLN), lamina propria (LP) of jejunum and colon in DSS-induced UC mice. And FoxP3, IL-17A, RORC mRNA extracted from FrⅢ cells were evaluated by Real-time PCR from above samples. Results In UC mice, the levels of FrⅠ subset cells were decreased among samples including SP, MLN, LP of jejunum and LP of colon compared with healthy control mice (P<0.05); the levels of FrⅡ subset cells were decreased among samples including PB, MLN, LP of jejunum, LP of colon compared with healthy control mice (P<0.05). While the levels of FrⅢ cells were increased among above samples compared with healthy control mice， as to the FoxP3, IL-17, RORC mRNA expressions extracted from FrⅢ cells. In UC mice, the expressions of FoxP3 mRNA were decreased among PB, MLN, LP of jejunum and LP of colon compared with healthy control mice, while the IL-17A and RORC mRNA were increased among above samples compared with healthy control mice (P<0.05). The levels of CD4+CD25+FoxP3+IL-17A+cells were increased among samples including PB, MLN, LP of jejunum, LP of colon compared with healthy control mice (P<0.05). Conclusion The decrease in FrⅡ cells and increase in FrⅢ cells together with a defect in FrI cells in the Treg cells are the reasons of the imbalance between Treg and Th17 cells.

Ulcerative colitis; Th17 cells; Regulatory T cell subsets

10.3969/j.issn.1006-5709.2016.03.016

國家自然科學(xué)基金青年基金項目(81300294)

馬亞會，碩士，住院醫(yī)師，研究方向：TLR2介導(dǎo)的Treg細(xì)胞塑型在潰瘍性結(jié)腸炎腸黏膜Treg/Th17細(xì)胞間失衡中的作用機制研究。E-mail：18732854035@163.com

劉心娟，博士，副主任醫(yī)師，研究方向：TLR2介導(dǎo)的Treg細(xì)胞塑型在潰瘍性結(jié)腸炎腸黏膜Treg/Th17細(xì)胞間失衡中的作用機制研究。E-mail：lxjw2012@126.com

R574.62

A

1006-5709(2016)03-0294-05

2015-11-17