鐵過(guò)載對(duì)斑馬魚(yú)成骨影響的機(jī)制

姜宇 閻一林 朱國(guó)興* 徐又佳

1. 南京醫(yī)科大學(xué)附屬無(wú)錫市第二人民醫(yī)院，骨科 214000 2. 美國(guó)俄勒岡州立大學(xué) 3. 蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院骨科

鐵過(guò)載可能是骨質(zhì)疏松癥的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[1]，高鐵環(huán)境對(duì)成骨細(xì)胞有抑制的作用[2]，而鐵過(guò)載對(duì)于成骨代謝影響的具體機(jī)制目前尚不明確。隨著第二代測(cè)序技術(shù)的迅猛發(fā)展，科學(xué)界也開(kāi)始越來(lái)越多地應(yīng)用第二代測(cè)序技術(shù)來(lái)解決基因和機(jī)制上的問(wèn)題[3]。主要原理是通過(guò)進(jìn)行全基因組的深度測(cè)序，在基因組水平上掃描并檢測(cè)不同位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)個(gè)體差異的分子基礎(chǔ)。我們利用枸櫞酸鐵銨(FAC)造成高鐵環(huán)境，將斑馬魚(yú)生活在高鐵環(huán)境造成其鐵過(guò)載的模型[4]。運(yùn)用高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)Bmp2(骨形態(tài)發(fā)生蛋白2)基因受到抑制，通過(guò)體內(nèi)以及離體的一系列實(shí)驗(yàn)證實(shí)鐵過(guò)載對(duì)Bmp2通道的抑制作用。

1 材料和方法

1.1材料

聚合鏈?zhǔn)椒磻?yīng)基因擴(kuò)增儀，MicroCL 17離心機(jī)；Step One Plus熒光定量PCR儀；GL212pro凝膠成像系統(tǒng)；SZ61體視顯微鏡。

1.2斑馬魚(yú)胚胎的收集

野生型斑馬魚(yú)(TUB ABC)取自蘇州大學(xué)生物鐘研究中心。按照Z(yǔ)ebrafish Book的描述進(jìn)行飼養(yǎng)和產(chǎn)卵。下午喂食半小時(shí)后設(shè)置斑馬魚(yú)交配盒，每盒中放入一雌一雄兩條魚(yú)，中間用透明擋板隔開(kāi)。次日上午9:00抽去隔板，30～35min后用濾網(wǎng)收集魚(yú)卵并洗去雜物。

1.3枸櫞酸鐵銨干預(yù)試驗(yàn)

挑選受精后第二天已破膜孵出的斑馬魚(yú)幼魚(yú)，至于合適的濃度[4]的枸櫞酸鐵銨(FAC)的培養(yǎng)皿中，每盤(pán)隨機(jī)放魚(yú)20尾，采用靜水式換水補(bǔ)藥法，每隔12小時(shí)換試液。

1.4高通量測(cè)序

RNA-seq序列是由信使核糖核酸樣品由Illumina公司HiSeq 2000測(cè)序(Illumina公司)、樣品的總RNA樣本磁吸附產(chǎn)生的碎片,并作為模板合成第一鏈cDNA使用隨機(jī)hexamersand逆轉(zhuǎn)錄酶，再使用DNA聚合酶I和RNaseH互補(bǔ)脫氧核糖核酸合成,再純化用QiaQuick PCR提取工具包(試劑盒、希爾登,德國(guó)),與EB緩沖液結(jié)束。

1.5實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(FQ-PCR)檢測(cè)目的基因表達(dá)量的反應(yīng)體系與程序:SYBR Premix Ex Taq 10μL，正向引物(P1)0.8μL，反向引物 (P2)0.8μL，cDNA2.0μL，雙蒸水6.4μL，總體積20μL，反應(yīng)程序: 95℃，3min,1 cycles; 95℃，10s,58℃(退火溫度) 30S,40cycles:65℃- 95℃融解曲線。相關(guān)序列用軟件Primer5設(shè)計(jì)，并通過(guò)Blast(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)檢驗(yàn)其保守性引物序列。見(jiàn)表1。

表1 runx2a,runx2b,sp7,β-actin基因的引物序列 Table 1 Prima sequences of runx2a, runx2b, sp7, and β-actin gene

1.6轉(zhuǎn)基因魚(yú)獲取

Runx2a轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)來(lái)自美國(guó)俄勒岡州立大學(xué)神經(jīng)所饋贈(zèng)。

1.7構(gòu)建runx2a的啟動(dòng)子和bmp2a的cDNA

根據(jù)Ensembl軟件設(shè)計(jì)runx2a的啟動(dòng)子和bmp2a的cDNA并將其設(shè)計(jì)引物，將其PCR的產(chǎn)物通過(guò)連接和酶切連接到PCDNA3.1載體上，構(gòu)建質(zhì)粒。引物序列見(jiàn)表2。

表2 runx2a的啟動(dòng)子和bmp2a的cDNA的引物序列Table 2 Prima sequences of runx2a promoter and bmp2a cDNA

1.8Luciferase reporter實(shí)驗(yàn)

HEK293細(xì)胞培養(yǎng)在含10%血清的DMEM中，轉(zhuǎn)染根據(jù)LipofectAmine(英杰公司)制造商的指示。報(bào)告基因進(jìn)行dual-reporter分析系統(tǒng)(Promega);分別加入100 ng runx2a-luc,bmp2a，40ng銨鐵(III)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了重復(fù)三次。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用△△Ct法分析，基因的相對(duì)表達(dá)量=2-△△Ct?！鳌鰿t=△Ct(實(shí)驗(yàn)組)-△Ct (對(duì)照組)，△Ct=Ct (目的基因)- Ct (內(nèi)參基因)，每個(gè)樣本設(shè)3組生物學(xué)重復(fù)，每組生物學(xué)重復(fù)設(shè)3個(gè)技術(shù)重復(fù)。用Microsoft Excel分析工具t-test分析基因表達(dá)差異的顯著性，以**即P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1高通量測(cè)序結(jié)果

挑選受精后第二天已破膜孵出的斑馬魚(yú)幼魚(yú)，至于合適的濃度的枸櫞酸鐵銨(FAC)的培養(yǎng)皿中，4天后提取RNA，發(fā)現(xiàn)Bmp2通道受到抑制。見(jiàn)圖1。

圖1 高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)BMP2通道受到抑制Fig.1 BMP2 channel was inhibited shown by high throughput sequencing

2.2FQ-PCR

斑馬魚(yú)的WT和鐵過(guò)載的斑馬魚(yú)在96h提取其cDNA為模板進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)其高鐵環(huán)境下的斑馬魚(yú)的BMP2及其下游的相關(guān)的成骨基因相比WT的定量FQ-PCR后均明顯下降。表明在分子水平上鐵過(guò)載抑制BMP2相關(guān)的成骨基因。

圖2 FQ-PCR：斑馬魚(yú)的WT和鐵過(guò)載的斑馬魚(yú)的FQ-PCR結(jié)果比較，BMP2相關(guān)的成骨相關(guān)的基因都明顯下調(diào)。Fig.2 Comparison of FQ-PCR results between wild type and iron overloaded zebra fish. BMP2-related osteogenesis genes were significantly down-regulated

2.3在體實(shí)驗(yàn)中鐵過(guò)載對(duì)斑馬魚(yú)中的runx2a基因表達(dá)下調(diào)：在體實(shí)驗(yàn)中將轉(zhuǎn)基因runx2a標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)高鐵環(huán)境下與正常環(huán)境在第九天后進(jìn)行比較，基因runx2a表達(dá)下調(diào)。說(shuō)明在體實(shí)驗(yàn)中鐵過(guò)載抑制runx2a基因。

2.4Luciferase reporter實(shí)驗(yàn)：HEK293細(xì)胞在含10%血清的DMEM中培養(yǎng)，加入100ng的runx2a-luc和bmp2a cDNA，加入40ng鐵(III)干預(yù)后后runx2a收到抑制。說(shuō)明鐵過(guò)載對(duì)于成骨的bmp2a介導(dǎo)的runx2a的信號(hào)通道有影響。見(jiàn)圖4。

3 討論

圖3 鐵過(guò)載對(duì)斑馬魚(yú)中的Runx2a基因表達(dá)下調(diào)，A為WT的runx2a基因表達(dá)，B為高鐵環(huán)境下的runx2a基因表達(dá)(熒光顯色及放大倍數(shù)為5)。Fig.3 Effect of iron overloading on Runx2a gene expression in zebra fish. A, Runx2a gene expression in WT; B Runx2a gene expression in high-iron environment (fluorescent labeling, magnification ×5)

圖4 Luciferase reporter實(shí)驗(yàn)，加入100ng的runx2a-luc和bmp2a cDNA，runx2a在加入BMP2后得升高，加入40ng鐵(III)干預(yù)后runx2a表達(dá)受到抑制。Fig.4 Luciferase reporter experiment. 100 ng of runx2a-luc and bmp2a cDNA were added. Runx2a increased after addition of BMP2, but it decreased after addition of 40 ng iron (III).

有文獻(xiàn)表明FAC干預(yù)斑馬魚(yú)4天后造成斑馬魚(yú)的鐵過(guò)載[4]，成功造模后我們觀察到FAC處理的斑馬魚(yú)的礦化面積明顯減少[4]。但導(dǎo)致鐵過(guò)載礦化障礙的具體機(jī)制目前不明確，因此我們利用高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，轉(zhuǎn)錄組廣義上指某一生理?xiàng)l件下細(xì)胞內(nèi)所有轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的集合，狹義上指所有mRNA的集合。蛋白質(zhì)是行使細(xì)胞功能的主要承擔(dān)者，但由于目前蛋白質(zhì)實(shí)驗(yàn)技術(shù)的限制，轉(zhuǎn)錄組成為研究基因表達(dá)的主要手段[5]。轉(zhuǎn)錄組是連接基因組遺傳信息與生物功能的蛋白質(zhì)組的必然紐帶，轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控是目前研究最多的，也是生物體最重要的調(diào)控方式。相對(duì)于傳統(tǒng)的芯片雜交平臺(tái)，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序無(wú)需預(yù)先針對(duì)已知序列設(shè)計(jì)探針，即可對(duì)任意物種的整體轉(zhuǎn)錄活動(dòng)進(jìn)行檢測(cè)，提供更精確的數(shù)字化信號(hào)，更高的檢測(cè)通量以及更廣泛的檢測(cè)范圍，是目前深入研究轉(zhuǎn)錄組復(fù)雜性的強(qiáng)大工具[6]。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，我們發(fā)現(xiàn)一系列的基因上調(diào)和下降，其中對(duì)于成骨代謝基因BMP2相關(guān)的通道基因尤為明顯，因此我們采用定量QPCR來(lái)驗(yàn)證并證實(shí)這一發(fā)現(xiàn)。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)提出[7]斑馬魚(yú)的破骨細(xì)胞在受精后20 d出現(xiàn)，本研究在10 d內(nèi)完成，因此我們推斷高鐵環(huán)境導(dǎo)致斑馬魚(yú)的骨礦化不全主要原因是抑制其成骨功能，而B(niǎo)MP2是其影響的重要通道之一。

在骨骼發(fā)育和骨折愈合中，骨形態(tài)發(fā)生蛋白是一個(gè)極其重要的調(diào)節(jié)蛋白家族。BMP2 是BMPs家族中非常重要的一個(gè)亞型，可以刺激間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，并促進(jìn)成骨細(xì)胞分化為骨細(xì)胞[8-10]。細(xì)胞外BMP2配體可以與Ⅱ型受體結(jié)合，進(jìn)而磷酸化Ⅰ型受體，Ⅰ型受體磷酸化下游的R-Smads(Smad1、Smad5和Smad8)[10]，轉(zhuǎn)位進(jìn)入核內(nèi)，復(fù)合物轉(zhuǎn)位進(jìn)入核內(nèi)上調(diào)Runx2相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子、Osterix(sp7)和同源盒基因等基因促進(jìn)成骨分化[11]。Park[12]在研究辛伐他汀與聯(lián)合作用成骨的研究中，證實(shí)用BMP2蛋白激活可以明顯增加ALP活性和Smad1/5/8蛋白的磷酸化水平從而促進(jìn)成骨分化。有文獻(xiàn)表明BMP是調(diào)控鐵調(diào)素的上游通道[13],通過(guò)調(diào)節(jié)鐵調(diào)素來(lái)調(diào)節(jié)鐵的代謝，但鐵的代謝是否對(duì)BMP有影響成為我們關(guān)注的問(wèn)題。

在研究中我們運(yùn)用深度測(cè)序和定量驗(yàn)證方法證實(shí)Runx2a, Runx2b, Osterix(sp7)等成骨基因均下調(diào)。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，我們觀察到轉(zhuǎn)基因Runx2a標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)高鐵環(huán)境下與正常環(huán)境在第九天后比較后基因表達(dá)的水平明顯下調(diào)。在體外實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)細(xì)胞熒光素酶報(bào)告基因Runx2a在Bmp2a轉(zhuǎn)染下大幅升高，鐵干預(yù)后runx2下降,細(xì)胞的蛋白實(shí)驗(yàn)也說(shuō)明證實(shí)了Runx2a的基因表達(dá)水平在高鐵環(huán)境下與正常組相比受到抑制。這些實(shí)驗(yàn)證明在高鐵對(duì)于BMP2通道有抑制作用，具體相關(guān)機(jī)制還需要進(jìn)一步探討中。

本研究第一次在使用高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序這一工具，在基因?qū)用嫔?，用分子生物學(xué)的技術(shù)手段尋找相關(guān)通道，從定量PCR和轉(zhuǎn)基因在體斑馬魚(yú)的結(jié)果上來(lái)看，高鐵下調(diào)了BMP影響的下游的Runx2基因，并運(yùn)用離體的一系列實(shí)驗(yàn)證實(shí)鐵過(guò)載對(duì)Bmp2有抑制影響從而導(dǎo)致骨代謝的異常，初步解釋了鐵過(guò)載對(duì)于成骨代謝影響的相關(guān)機(jī)制。