GLP-1對2型糖尿病大鼠血清OPG、RANKL及骨密度的影響研究

趙燕 王艷 張燕 宋滇平 楊秋萍

昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院糖尿病科，云南 昆明 650032

骨質(zhì)疏松性骨折和糖尿病均是21 世紀重要的慢性病，糖尿病患者發(fā)生骨質(zhì)疏松的風(fēng)險明顯高于非糖尿病患者。骨保護素(osteoprotegerin, OPG)、細胞核因子κB受體活化因子配基(receptor activator of nuclear factor-kB ligand，RANKL)、細胞核因子κB受體活化因子(receptor activator of nuclear factor-kB，RANK)信號通路是調(diào)控破骨細胞的重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。OPG/RANKL比率可以決定破骨細胞分化，其比率的改變可直接影響破骨細胞的功能，影響骨代謝。胰高血糖素樣肽1(glucagon-like peptide-1 GLP-1)是由人體腸道分泌的激素，它能促進胰島素的釋放，調(diào)節(jié)血糖，目前越來越多的研究認為GLP-1還對骨代謝有著調(diào)節(jié)作用。利拉魯肽是近年來人工合成的GLP-1類似物，本文擬探討GLP-1類似物(利拉魯肽)對2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)大鼠血清OPG、RANKL及骨密度(bone mineral density，BMD)的影響。

1 材料和方法

1.1 2型糖尿病模型的建立及分組

昆明種健康雄性SD大鼠90只200～224 g(昆明醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心)，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w。隨機數(shù)字表法分為正常對照組(20只 普通飼料)及實驗組(70只高脂高糖飼料)。高脂高糖飼料：參照Guo[1]配方：10%豬油、20%蔗糖、2%膽固醇、1%膽酸鈉、67%基礎(chǔ)飼料，由昆明醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心專人加工。喂養(yǎng)5 w末禁食12 h，試驗組一次性左下腹腔注射STZ(calbiochem公司)35 mg/kg，誘導(dǎo)2型糖尿病大鼠模型。正常對照組(NC)予相同劑量的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液一次性左下腹腔注射。72 h后測隨機血糖≥16.7 mmol/L為造模成功。成模大鼠55只，按血糖進行區(qū)組隨機化分配分為利拉魯肽低劑量[400 μg/(kg·d)]干預(yù)組(LR-L)18只、利拉魯肽高劑量[800 μg/(kg·d)]干預(yù)組(LR-H)18只、糖尿病對照組(DM)19只。利拉魯肽(諾和諾德中國制藥有限公司)組按其劑量每日皮下注射1次，NC、DM組以等量生理鹽水皮下注射。實驗過程中所有大鼠自由飲水，普通飼料喂養(yǎng)。每周監(jiān)測各組大鼠的血糖、體重、飲食情況以及精神狀態(tài)并記錄。利拉魯肽干預(yù)4w后3%戊巴比妥鈉麻醉并處死大鼠：NC組13只，DM組7只，LR-L組8只，LR-H組11只。心房內(nèi)取血離心取血清-20℃冰箱保存。

1.2 檢測方法

采用OlympasAU2700全自動生化分析儀測血鈣(calcium，Ca)、磷(phosphonium，P)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三脂(triacylglyceride，TG)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate transaminase，AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)，酶聯(lián)免疫吸附劑測定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)法檢測OPG、RANKL、空腹胰島素(fasting insulin，F(xiàn)IS)。骨密度測定：造模成功4w末，用乙醚吸入式全麻大鼠，待大鼠處于昏睡狀態(tài)，四肢肌肉松弛，仰臥位置于雙能 X 線骨密度儀(美國GE公司Prodigy Advance型骨密度儀)探頭下，固定四肢，使椎體保持豎直，雙側(cè)股骨保持水平狀態(tài)，測定全身、腰椎、股骨、骨盆的骨密度(BMD)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 大鼠體重及血糖變化

藥物干預(yù)前(6w)DM、LR-H、LR-L組大鼠體重?zé)o明顯差異，隨著利拉魯肽的干預(yù)，至實驗結(jié)束時，DM組大鼠體重較NC組低(P<0.05)，LR-H及LR-L組的體重較DM組更低(P<0.05)，但LR-H組與LR-L組體重?zé)o明顯差異(表1)。

表1 藥物干預(yù)期間大鼠體重變化(g)Table 1 The weight change of rats during drug intervention (g)

注：與NC組比較，*P<0.05，與DM組比較，#P<0.05

2.2 大鼠空腹血糖變化

藥物干預(yù)前(6 w)DM、LR-H、LR-L組大鼠空腹血糖無明顯差異(P>0.05)，隨著藥物的干預(yù)，至實驗結(jié)束時，LR-H、LR-L組大鼠血糖較DM組有所下降(P<0.05)，但LR-H組與LR-L組空腹血糖無明顯差異(表2)。

表2 大鼠空腹血糖變化(mmol/L) Table 2 The change of fasting glucose in rats (mmol/L)

注：與NC組比較，*P<0.05，與DM組比較，#P<0.05

2.3 大鼠血生化指標及肝指數(shù)的變化

四組間組血清P、Ca均無明顯差異(P>0.05)；與NC組比較DM組ALP升高，與DM組比較LR-L組ALP下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與NC組比較DM、LR-L、LR-H組TG、TC 均升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，經(jīng)利拉魯肽干預(yù)后LR-L、LR-H組TG、TC較DM組均下降，但LR-L、LR-H組間無差異。與NC組比較DM、LR-L、LR-H組FIS均升高，但三組間無差異。DM組大鼠肝指數(shù)較NC組重(P<0.01)，與DM組比較LR-H與LR-L組肝指數(shù)均下降，且LR-H組較LR-L組下降更明顯(P<0.01)(表3)。

表3 4組間血生化指標、肝指數(shù)比較Table 3 Comparison of biochemical parameters and liver index among rats in 4 groups

注：與NC組比較，*P<0.05；與DM組比較，#P<0.05；與LR-L相比，○P<0.05

2.4 大鼠血清RANKL、OPG、OPG/RANKL的變化

與NC組比較DM、LR-H、LR-L組血清OPG、RANKL明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與DM組比較LR-L組、LR-H組血清OPG均升高，且LR-L組升高明顯差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與DM組比較LR-L組、LR-H組血清RANKL均下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。DM組血清OPG/RANKL比值明顯低于NC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，LR-L、LR-H組血清OPG/RANKL與NC組比較無明顯差異，但較DM組明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；LR-L、LR-H兩組間OPG、RANKL、OPG/RANKL均無明顯差異(表4)。

表4 4組大鼠血清OPG、RANKL的比較Table 4 Comparison of serum OPG and RANKL among rats in 4 groups

注： 與NC組比較，*P<0.05；與DM組比較，#P<0.05

2.5 大鼠骨密度的變化

與NC組比較，DM組、LR-L、LR-H組大鼠全身及各部位骨密度均降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，DM、LR-L、LR-H3組間無差異(表5)

表5 4組大鼠骨密度的比較(g/cm2)Table 5 Comparison of bone mineral density among rats in 4 groups(g/cm2)

注：與NC組比較，*P<0.05，與DM組比較，#P<0.05

3 討論

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP) 是一種以骨量低下，骨微結(jié)構(gòu)破壞，導(dǎo)致骨脆性增加，易于發(fā)生骨折的全身性代謝性疾病。雖然骨質(zhì)疏松癥和糖尿病通常被認為是兩個獨立的疾病，但目前有許多研究表明糖尿病患者發(fā)生骨質(zhì)疏松的風(fēng)險明顯高于非糖尿病患者，流行病學(xué)研究表明，與同年齡、同性別的人群比較，糖尿病患者骨質(zhì)減少和骨質(zhì)疏松的發(fā)生率高，糖尿病患者骨質(zhì)疏松的發(fā)病率為40%～60%[2]，其發(fā)病機制尚未完全闡明，目前認為長期高血糖、胰島素相對不足或缺乏、糖尿病多臟器病變、血管和神經(jīng)病變并發(fā)癥的發(fā)生[3]、降糖藥物的使用、飲食控制、雌激素、胰島素樣生長因子、瘦素、體重、性別、年齡等因素可能在糖尿病發(fā)生骨質(zhì)疏松的病理生理過程中起著重要作用[4]。

骨質(zhì)疏松的嚴重后果是發(fā)生骨質(zhì)疏松骨折(脆性骨折)，即在受到微創(chuàng)傷或日?；顒又屑纯砂l(fā)生骨折，使用雙能X 線檢測骨密度為診斷骨質(zhì)疏松的金標準。目前2型糖尿病對骨密度及骨代謝的特點存在著許多爭議。有研究表明2型糖尿病患者的骨密度與正常對照組比較下降[5]，也有研究表明2型糖尿病患者與正常對照組骨密度無明顯差異或高于正常對照組[6]。這可能與研究方法、骨密度測量差異、2型糖尿病病程、血糖控制情況、胰島素水平、雌激素水平及糖尿病慢性并發(fā)癥等影響因素有關(guān)。但無論是1型糖尿病還是2型糖尿病患者骨折風(fēng)險增加是肯定的。本研究對2型糖尿病大鼠進行BMD測定，發(fā)現(xiàn)2型糖尿病大鼠無論全身還是局部骨密度低于正常對照組，且差異具體統(tǒng)計學(xué)意義，提示2型糖尿病引起了骨量的減少，與王亮等[7]研究一致。

OPG/RANKL/RANK信號通路是調(diào)控破骨細胞的重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。OPG[8]是由成骨細胞合成分泌的一種非膠原蛋白，為腫瘤壞死因子受體 (TNFR) 家族成員，主要功能是維持骨的正常礦化，主要通過與細胞核因子κB受體活化因子配基(RANKL)競爭性結(jié)合細胞核因子κB受體活化因子(RANK)，阻止RANKL與RANK之間的結(jié)合，抑制破骨細胞的分化，抑制成熟破骨細胞的骨吸收活性并誘導(dǎo)其凋亡, 從而減少骨吸收，OPG是機體成骨與破骨的重要偶聯(lián)因子。RANKL表達于成骨細胞及骨髓基質(zhì)細胞表面，與破骨細胞前體細胞或破骨細胞表面上的RANK結(jié)合后，促進破骨細胞的分化及骨吸收活性。正常的骨重建的穩(wěn)態(tài)依賴于OPG和RANKL的平衡，OPG/RANKL比率的改變直接影響破骨細胞的功能，影響骨代謝，其比值的升高可以抑制破骨細胞的分化，抑制骨吸收。國外研究發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠脛骨骨組織RANKL/OPG的表達比率明顯高于正常對照組，這可能是糖尿病大鼠骨折愈合延遲的原因[9]。臨床也有研究[10]發(fā)現(xiàn)2型糖尿病患者血清OPG明顯高于正常人。本研究檢測2型糖尿病大鼠血清OPG、RANKL含量，發(fā)現(xiàn)2型糖尿病大鼠血清OPG、RANKL明顯高于正常對照組，血清OPG/RANKL比值低于正常對照組，與劉國霞等[11]研究一致。提示糖尿病大鼠骨破壞、骨吸收可能比正常對照組增強。

GLP-1[12]是一種腸促胰島素，由胰高血糖素原前體翻譯加工而來，主要由小腸L細胞分泌，由30個氨基酸殘基構(gòu)成。既能促進胰島β細胞分泌的胰島素，又能抑制胰島α細胞分泌胰高血糖素。利拉魯肽是近年來人工合成的GLP-1類似物，丹麥學(xué)者[13]對比了常規(guī)降糖藥和GLP-1類似物對治療2型糖尿病的療效，發(fā)現(xiàn)GLP-1類似物降低血糖不僅很少會誘發(fā)低血糖，而且能減輕患者體重，成為一種有效治療糖尿病的新型藥物。許多動物實驗發(fā)現(xiàn)[14]GLP-1對骨代謝有正性調(diào)節(jié)作用，其機制可能是直接或間接作用于骨細胞、激活Wnt / β-catenin途徑、增加OPG/ RANKL比率，降低骨硬化蛋白的水平發(fā)揮作用的。本實驗中，利拉魯肽干預(yù)組(LR-H、LR-L)體重、血糖、血脂(TG、TC)明顯低于糖尿病對照組；還發(fā)現(xiàn)利拉魯肽還可降低糖尿病大鼠的肝指數(shù)，猜測利拉魯肽可能有改善肝臟脂肪變的作用。

最近有研究人員[15]通過meta分析發(fā)現(xiàn)利拉魯肽能顯著減少人發(fā)生骨折的風(fēng)險，而艾塞那肽卻不明顯，這可能說明利拉魯肽對骨代謝也有很好的調(diào)節(jié)作用。GLP-1對糖尿病骨密度的影響目前尚無定論。本研究使用GLP-1類似物利拉魯肽對糖尿病大鼠干預(yù)治療4w，糖尿病對照組與利拉魯肽干預(yù)組骨密度無明顯差異。這可能是由于利拉魯肽有明顯的減輕體重的作用，從而抵消了藥物對骨密度的正性調(diào)節(jié)作用，并且可能和實驗觀察時間短有關(guān)。本研究檢測血清OPG、RANKL的含量，發(fā)現(xiàn)LR-L、LR-L組血清OPG、RANKL介于NC與DM之間，且LR-H組OPG明顯高于DM組，LR-H與LR-L組RANKL明顯低于DM組，LR-L、LR-H組血清OPG/RANKL與NC組比較無明顯差異，但較DM組明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

綜合上述研究我們發(fā)現(xiàn)2型糖尿病大鼠骨密度下降，利拉魯肽治療4w后骨密度沒有明顯增高，但血清OPG/RANKL比值增高，因此我們認為利拉魯肽可能通過調(diào)控OPG、RANKL的表達，影響了循環(huán)的OPG與RANKL的水平，推測利拉魯肽可能通過0PG/RANKL/RANK信號通路，減少骨吸收，促進骨形成，但本實驗只進行了血清OPG、RANKL測定，需進一步行OPG、RANKL蛋白表達及基因檢測。