SOST和β-catenin在不同分期膝骨關(guān)節(jié)炎患者軟骨及軟骨下骨表達(dá)的研究

吳疆 吳龍 馬龍 金群華

寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院骨三科，銀川 750004

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是機(jī)械性和生物性因素相互作用，使關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)和軟骨下骨合成與降解的正常進(jìn)行失去平衡的結(jié)果。膝骨關(guān)節(jié)炎的病因較為復(fù)雜，盡管年齡因素與OA強(qiáng)烈相關(guān)，但是其他因素仍然會(huì)導(dǎo)致OA的發(fā)生[1,2]。骨關(guān)節(jié)炎最主要的特征是關(guān)節(jié)軟骨的漸進(jìn)性破壞，軟骨下骨變厚和邊緣骨贅形成，并且這種破壞在整個(gè)關(guān)節(jié)的軟組織中均有發(fā)生[3]。

在OA中，關(guān)節(jié)軟骨的丟失可能與軟骨下骨有關(guān)。軟骨下骨和軟骨解剖位置緊密相鄰，位于關(guān)節(jié)軟骨下方，包括皮質(zhì)終板及其下方的骨小梁結(jié)構(gòu)，與軟骨共同維持關(guān)節(jié)形態(tài)，承受應(yīng)力，而且軟骨下骨可以通過生物學(xué)信息交流，對(duì)軟骨，尤其是軟骨深部組織的營養(yǎng)起著重要作用[4]。下肢負(fù)重力線隨著OA疾病發(fā)展的改變直接或間接的影響了這兩部分鄰近組織間細(xì)胞信號(hào)的傳遞，從而可能會(huì)對(duì)軟骨及軟骨下骨產(chǎn)生破壞作用，加速疾病的發(fā)展[5]。

Wnt-β-catenin信號(hào)通路最初是在胚胎的形成及發(fā)育中被廣泛認(rèn)知的，在維持骨與軟骨穩(wěn)定性方面起到重要作用[6]。已有大量實(shí)驗(yàn)證明了Wnt信號(hào)通路在人類成骨中起到重要作用，并且β-catenin升高使成骨增加。而在人類軟骨中，激活的Wnt-β-catenin信號(hào)通路會(huì)破壞軟骨組織，加速OA疾病發(fā)展[7]。骨硬化蛋白, 又稱SOST，由骨細(xì)胞和肥大的軟骨細(xì)胞表達(dá)[8]，可以抑制骨形態(tài)蛋白(BMP)分泌的同時(shí)可以通過結(jié)合LRP5/6受體抑制Wnt信號(hào)通路[9]。因此，明確在OA疾病的發(fā)展過程中，β-catenin和SOST在骨關(guān)節(jié)炎患者軟骨及軟骨下骨中所可能產(chǎn)生的變化，對(duì)于探究OA疾病的發(fā)生發(fā)展以及治療具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 人膝關(guān)節(jié)標(biāo)本的獲取

OA標(biāo)本和正常標(biāo)本均取自2013年10月至2015年10月就診于寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院骨三科的患者所捐贈(zèng)的內(nèi)側(cè)脛骨平臺(tái)組織，經(jīng)過了寧夏醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)(倫理編號(hào)：2015-005)。OA膝關(guān)節(jié)標(biāo)本(OA組，39例，其中女性29名,男性10名,平均年齡為 61.6±6.8歲)。取自骨關(guān)節(jié)炎并內(nèi)翻屈曲畸形患者的新鮮內(nèi)側(cè)脛骨平臺(tái)組織，診斷標(biāo)準(zhǔn)采用美國風(fēng)濕學(xué)會(huì)制定的骨關(guān)節(jié)炎診斷標(biāo)準(zhǔn)[10]。排除因創(chuàng)傷、類風(fēng)濕等繼發(fā)性膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎。正常的膝關(guān)節(jié)標(biāo)本(正常組，6例，其中2名女性，4名男性,平均年齡 24.7±5.9歲)。均取自因下肢毀損傷行截肢術(shù)患者的新鮮內(nèi)側(cè)脛骨平臺(tái)組織，排除因糖尿病、腫瘤等原因行截肢術(shù)的患者。將術(shù)中截取的新鮮脛骨平臺(tái)立即置于超凈工作臺(tái)，在內(nèi)側(cè)脛骨平臺(tái)的中央負(fù)重區(qū)用咬骨鉗取2.0×2.0×1.0 cm3大小的組織塊，保留軟骨及軟骨下骨。置入10%中性福爾馬林浸泡24 h，沖洗后常溫下置于10%EDTA液中脫鈣，每4d更換脫鈣液，脫鈣8 w。常規(guī)石蠟包埋后做4 μm連續(xù)縱行切片。

1.2 番紅O-固綠染色及改良Mankin評(píng)分

將0.5 g番紅O溶于95%乙醇100 mL制成0.5%番紅O乙醇溶液。染液滴染2 min，鏡下觀察染色情況后蒸餾水沖洗掉染液，95%乙醇分化數(shù)秒，風(fēng)干，二甲苯透明，中性樹膠封固。置于顯微鏡下觀察，后采用改良Mankin評(píng)分(見表1)將標(biāo)本分為正常組(0～3分)，中度OA組(7～9分)和重度OA組(10～12分)。

表1 關(guān)節(jié)軟骨的改良Mankin評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Modified Mankin score of the joint cartilage

1.3 免疫組化染色

石蠟切片經(jīng)烤片、水化、抗原修復(fù)、消除內(nèi)源性過氧化物酶之后，用兔源抗SOST抗體，兔源抗β-catenin抗體在37℃下孵育90 min，兩步法孵育二抗后，DAB顯色數(shù)秒，鹽酸酒精分化，自來水沖洗反籃，梯度脫水。將切片置于顯微鏡下觀察顯色情況。每張切片在10倍光鏡下在軟骨區(qū)域分別隨機(jī)選取3個(gè)視野，以軟骨及骨細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核著黃褐色為β-catenin陽性細(xì)胞，以軟骨細(xì)胞、骨細(xì)胞及周圍的骨陷窩著黃褐色為SOST陽性骨細(xì)胞，分別計(jì)數(shù)軟骨下骨板及其下骨小梁區(qū)域β-catenin、SOST陽性骨細(xì)胞個(gè)數(shù)，以陽性細(xì)胞率(染色陽性的骨細(xì)胞個(gè)數(shù)/總的骨細(xì)胞個(gè)數(shù)×100%)表示蛋白的表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件，采用SNK-q檢驗(yàn)比較正常組、OA中期組、OA晚期組這3組軟骨及軟骨下骨中SOST和β-catenin的陽性細(xì)胞數(shù)是否存在組間差異。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 39例OA患者和6例截肢患者的內(nèi)側(cè)脛骨平臺(tái)組織改良Mankin評(píng)分結(jié)果

6例截肢患者均分到正常組，改良Mankin評(píng)分為(1.3±1.2)分，番紅O-固綠染色鏡下表現(xiàn)為：軟骨表層完整，軟骨細(xì)胞各層排列整齊，軟骨基質(zhì)紅染。14例中度OA組，評(píng)分為(7.7±0.9)分，鏡下表現(xiàn)為軟骨裂隙進(jìn)入輻射層或深達(dá)鈣化層，裂隙周圍軟骨細(xì)胞增殖、簇集，軟骨基質(zhì)淡染，局部軟骨下骨暴露，軟骨下骨板及骨小梁厚度增加。25例重度OA組，評(píng)分為(13.0±1.2)分，軟骨層纖維化嚴(yán)重或大面積缺失，軟骨基質(zhì)重度失染，廣泛軟骨下骨暴露、象牙化，軟骨下骨板及厚度明顯增加(圖1)。

圖1 內(nèi)側(cè)脛骨平臺(tái)標(biāo)本的番紅O-固綠染色，標(biāo)尺：500 μmFig.1 Safranin O staining of the medial tibial plateau, Bar, 500 μm

2.2 SOST免疫組化染色在內(nèi)側(cè)脛骨平臺(tái)軟骨及軟骨下骨的表達(dá)情況

正常組的樣本在軟骨表層中幾乎沒有SOST染色陽性的軟骨細(xì)胞，在深層鄰近鈣化軟骨區(qū)域可見少量陽性細(xì)胞，SOST染色陽性細(xì)胞百分比為11%。在中度OA組中，軟骨表層及深層均可見大量的陽性細(xì)胞，SOST染色陽性細(xì)胞百分比為59%。而在重度OA組中，軟骨中陽性細(xì)胞數(shù)量明顯減少，在軟骨表層也幾乎沒有陽性細(xì)胞存在，SOST染色陽性細(xì)胞百分比為12%。統(tǒng)計(jì)陽性細(xì)胞百分比后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)在中度OA組中SOST染色陽性細(xì)胞百分比高于正常組和重度OA組(P<0.05)，而正常組和重度OA組兩組間沒有差異 (P>0.05)(圖2，6a)。在正常組軟骨下骨中可見大量SOST染色陽性軟骨細(xì)胞，SOST染色陽性細(xì)胞百分比為58%，中度OA組中可見鈣化軟骨區(qū)域及軟骨下骨區(qū)域有SOST染色陽性細(xì)胞，SOST染色陽性細(xì)胞百分比為38%，在重度OA組的軟骨下骨中可減少量染色陽性的SOST骨細(xì)胞，其染色陽性百分比為16%。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析后發(fā)現(xiàn)SOST染色陽性細(xì)胞數(shù)在正常組軟骨下骨組織中最高，中度OA組和重度OA組中均有所減少，且重度OA組少于中度OA組(P<0.05)(圖3,6b)。

圖2 各組軟骨中軟骨細(xì)胞SOST染色陽性情況，標(biāo)尺：200 μmFig.2 Immunostaining of SOST in joint cartilage of different groups, Bar, 200 μm

圖3 各組軟骨下骨中骨細(xì)胞SOST染色陽性情況，標(biāo)尺：200 μmFig.3 Immunostaining of SOST in subchondral bone of different groups, Bar, 200 μm

2.3 β-catenin免疫組化在內(nèi)側(cè)脛骨平臺(tái)軟骨及軟骨下骨的表達(dá)情況

在正常組的軟骨中β-catenin染色陽性細(xì)胞數(shù)量很少，β-catenin染色陽性細(xì)胞百分比為17%。在中度OA組可以發(fā)現(xiàn)染色陽性細(xì)胞多數(shù)聚集在軟骨表層，β-catenin染色陽性細(xì)胞百分比為49%，數(shù)量明顯多于正常組(P<0.05)。但是與中度OA組中SOST染色相比，β-catenin陽性細(xì)胞多聚集在軟骨表面而SOST陽性細(xì)胞多聚集在鈣化層及深層軟骨區(qū)域，這可能與Wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)機(jī)械應(yīng)力的感應(yīng)以及軟骨-軟骨下骨相互作用有關(guān)。在重度OA組中可以發(fā)現(xiàn)β-catenin染色陽性細(xì)胞已經(jīng)不僅僅局限于軟骨表層，在軟骨深層也可見大量染色陽性細(xì)胞，β-catenin染色陽性細(xì)胞百分比為62%，數(shù)量明顯多于中度OA組(P<0.05)(圖4，圖6c)。在正常組的軟骨下骨中可見少量的β-catenin染色陽性細(xì)胞，陽性細(xì)胞百分比為42%，中度OA組中陽性細(xì)胞(58%)明顯高于正常組(P<0.05)，重度OA組中陽性細(xì)胞(74%)明顯高于中度OA組(P<0.05)，表明β-catenin在軟骨下骨中的表達(dá)量隨著OA疾病的發(fā)展而逐步增高(圖5，圖6d)。

圖4 各組軟骨中軟骨細(xì)胞β-catenin染色陽性情況，標(biāo)尺：200 μmFig.4 Immunostaining of β-catenin in joint cartilage of different groups, Bar, 200 μm

圖5 各組軟骨下骨中骨細(xì)胞β-catenin染色陽性情況，標(biāo)尺200 μmFig.5 Immunostaining of β-catenin in subchondral bone of different groups, Bar, 200 μm

圖6 免疫組化染色陽性細(xì)胞百分比與正常組比較，*P<0.05；與中度OA組比較，#P<0.05Fig.6 Percentage of positive staining cells*P<0.05, versus control group;#P<0.05, versus mid-stage OA group

3 討論

OA疾病的發(fā)生與發(fā)展與很多因素相關(guān)，目前，Wnt信號(hào)通路在OA中的作用仍在探索， SOST對(duì)OA關(guān)節(jié)軟骨是否有保護(hù)作用尚存在爭論。Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活，在骨組織中表現(xiàn)為促進(jìn)成骨，而在軟骨中表現(xiàn)為加速軟骨的分解。SOST作為Wnt-β-catenin的膜受體拮抗劑，可以抑制Wnt-β-catenin信號(hào)通路，從而對(duì)軟骨產(chǎn)生保護(hù)作用。Chan等[11]證明了在軟骨中，升高的SOST可以通過抑制Wnt-β-catenin信號(hào)通路控制下游分解酶，MMP-13，ADAMTS-4，5的表達(dá)，從而對(duì)軟骨產(chǎn)生保護(hù)作用。SOST單克隆抗體可以拮抗SOST對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的抑制作用，從而促進(jìn)成骨，治療骨質(zhì)疏松[12]。因此探究SOST隨著OA疾病的發(fā)展在軟骨及軟骨下骨中所起到的作用及其作用機(jī)制就顯得尤為重要。

我們發(fā)現(xiàn)在OA疾病過程中，SOST在軟骨中和軟骨下骨中的變化是不一致的。它們?cè)谲浌侵械谋磉_(dá)隨著OA疾病的發(fā)展表現(xiàn)為先增多后減少，這與Bouaziz等[13]在OA造模小鼠軟骨中的報(bào)告相一致。而β-catenin卻持續(xù)增加，表明Wnt/β-catenin信號(hào)通路的表達(dá)隨著疾病的發(fā)展而不斷升高，其下游的分解代謝酶，如MMPs和ADAMTSs的表達(dá)量也會(huì)持續(xù)升高，造成軟骨細(xì)胞凋亡，軟骨基質(zhì)破壞。SOST在軟骨中的表達(dá)量升高后理論上會(huì)抑制Wnt信號(hào)通路從而減少β-catenin，然而在軟骨中我們并沒有發(fā)現(xiàn)這一現(xiàn)象。而在軟骨下骨中，SOST的表達(dá)量持續(xù)減少，與之相對(duì)應(yīng)的，β-catenin的表達(dá)量也與軟骨中一樣持續(xù)升高，不斷的刺激成骨，造成軟骨下骨硬化及骨贅形成。然而我們并不能證明在軟骨及軟骨下骨中觀察到的Wnt信號(hào)通路活動(dòng)的變化與SOST變化相關(guān)。Wnt信號(hào)通路在OA疾病的過程中所起到的作用是極其復(fù)雜的，我們即使通過用SOST在軟骨中抑制了信號(hào)通路的激活，但是在體內(nèi)，它們也不可避免的會(huì)作用到軟骨下骨及骨，抑制骨形成，在OA疾病的發(fā)展過程中造成更多地微骨折，使軟骨下骨喪失緩沖機(jī)械應(yīng)力的作用，這同樣也會(huì)加速疾病的發(fā)展。

OA病變包括了關(guān)節(jié)內(nèi)所有的結(jié)構(gòu)，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨的降解這一觀點(diǎn)已達(dá)成共識(shí)。軟骨下骨是關(guān)節(jié)的重要組成部分，其主要生物力學(xué)效應(yīng)是吸收應(yīng)力、緩沖震蕩和維持關(guān)節(jié)形狀。其彈性模量較關(guān)節(jié)軟骨低，但其數(shù)量較多，在緩沖震蕩中起主要的襯墊作用，避免關(guān)節(jié)軟骨受過度應(yīng)力損傷[14]。在軟骨中，Wnt/β-catenin信號(hào)通路過度激活被認(rèn)為是起到破壞軟骨的作用，而骨硬化蛋白同樣亦可以抑制Wnt-β-catenin信號(hào)通路保護(hù)軟骨。我們發(fā)現(xiàn)在軟骨中SOST隨著疾病的發(fā)展表現(xiàn)為先升高后降低，SOST作為Wnt-β-catenin信號(hào)通路的抑制劑，在軟骨中SOST表達(dá)量升高后，β-catenin應(yīng)該下降，而后SOST表達(dá)量下降后，β-catenin理應(yīng)升高。然而在實(shí)驗(yàn)中我們并沒有觀察到這一現(xiàn)象，β-catenin表達(dá)持續(xù)升高，并沒有受到SOST的影響。因此我們推測，不能單純的認(rèn)為軟骨中的SOST完全由軟骨細(xì)胞分泌，而軟骨下骨中的SOST完全由骨細(xì)胞分泌的。軟骨和軟骨下骨之間會(huì)有大量的物質(zhì)交換，那么SOST是否也會(huì)通過軟骨-軟骨下骨連接處，從而在對(duì)兩個(gè)部分的細(xì)胞產(chǎn)生不一樣的作用呢？在軟骨中SOST的升高是否會(huì)激活或者抑制其它信號(hào)通路，與Wnt-β-catenin信號(hào)通路產(chǎn)生協(xié)同或者拮抗作用，從而掩蓋了SOST對(duì)Wnt-β-catenin信號(hào)通路的抑制作用，從而解釋我們觀察到的β-catenin與SOST隨著OA疾病發(fā)展而產(chǎn)生的變化。同樣，軟骨下骨受應(yīng)力刺激，激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)成骨。SOST分泌增多抑制Wnt-β-catenin信號(hào)通路，減少了β-catenin的表達(dá)，延緩軟骨下骨硬化，從而可以維持軟骨下骨的正常結(jié)構(gòu)，使其發(fā)揮正常功能。然而考慮到軟骨中SOST與β-catenin的反常變化，軟骨下骨中這兩種因子是否只是單純的通過Wnt-β-catenin信號(hào)通路產(chǎn)生相互作用，仍然未知。我們的實(shí)驗(yàn)僅僅是觀察到了SOST和β-catenin這個(gè)OA疾病發(fā)展過程中的關(guān)鍵因子在軟骨、軟骨下骨中表達(dá)的變化情況，而探究SOST以及Wnt-β-catenin信號(hào)通路兩者在OA疾病發(fā)展中的作用機(jī)制，可能會(huì)為骨關(guān)節(jié)炎疾病的發(fā)生發(fā)展及治療提供新的思路。