硬化蛋白抗體和跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)老齡去勢(shì)大鼠骨重建的影響

繆律 蔣健

上海體育學(xué)院，上海 200438

隨著社會(huì)老齡化的到來，女性絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的防治已成為一個(gè)迫切的社會(huì)問題[1]。中老年女性由于卵巢功能衰減，體內(nèi)激素水平明顯下降，絕經(jīng)后女性骨質(zhì)疏松的發(fā)病率明顯高于同年齡段男性。因此，絕經(jīng)后女性骨質(zhì)疏松的防治引起臨床醫(yī)生和科研人員的關(guān)注。

硬化蛋白作為糖蛋白的分泌蛋白，是成骨細(xì)胞分化和骨形成的負(fù)向調(diào)節(jié)[2,3]。硬化蛋白是通過結(jié)合Wnt信號(hào)通路受體相關(guān)蛋白LRP5和LRP6，從而可以阻斷Wnt信號(hào)通路，減少骨形成[4]。所以硬化蛋白被看作一種抑制骨形成的生理制劑[5]，在臨床治療骨質(zhì)疏松中頗具優(yōu)勢(shì)。除了藥物治療，運(yùn)動(dòng)療法更方便、經(jīng)濟(jì)。體育活動(dòng)可以增加骨密度和骨強(qiáng)度，當(dāng)負(fù)重運(yùn)動(dòng)或其他機(jī)械負(fù)荷運(yùn)動(dòng)達(dá)到一定強(qiáng)度時(shí)，骨架會(huì)對(duì)其產(chǎn)生適應(yīng)性[6]，對(duì)骨代謝與重建有明顯的促進(jìn)作用。硬化蛋白抗體與運(yùn)動(dòng)療法之間是否存在協(xié)同或反作用，不得而知。所以本研究旨在對(duì)去勢(shì)大鼠進(jìn)行硬化蛋白抗體和跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)療法，分析在老齡去勢(shì)大鼠骨重建過程中骨代謝指標(biāo)的影響，證實(shí)并闡明骨細(xì)胞相關(guān)調(diào)控機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物分組及處理

8月齡雌性Wistar大鼠60只，購(gòu)于上海斯萊克動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，飼養(yǎng)期間，大鼠自由攝食、飲水，動(dòng)物房溫度控制在(22.0±1.0)℃，相對(duì)濕度(50%±10%)，明暗周期12∶12。飼養(yǎng)1 w后，按體重分層隨機(jī)分為以下5組：①Sham組：假手術(shù)組(n=12)；②OVX組：去勢(shì)組(n=12)；③OVX+E組：在OVX組基礎(chǔ)上實(shí)施運(yùn)動(dòng)干預(yù)組(n=12)；④OVX+S組：OVX組基礎(chǔ)上注射硬化蛋白組(n=12)；⑤OVX+E+S組：在OVX+S組基礎(chǔ)上實(shí)施運(yùn)動(dòng)干預(yù)(n=12)。

實(shí)驗(yàn)干預(yù)14 w后，實(shí)驗(yàn)期滿后用10 g/L戊巴比妥鈉3 mL/kg腹腔注射麻醉，打開胸腔，注射器穿刺右心室取血5.0～6.0 mL，離心處理。血液離心分離后儲(chǔ)存在-80℃超低溫冰箱保持待用。股骨和脛骨解剖游離結(jié)締組織及脂肪組織分別儲(chǔ)存在-20℃和-4℃條件下。

1.2 硬化蛋白抗體注射方案

注射硬化蛋白抗體25 mg/(kg·d)，每周2次；假手術(shù)組沒有運(yùn)動(dòng)干預(yù)，注射生理鹽水。

1.3 運(yùn)動(dòng)方案

在OVX+E組和OVX+E+S組，每天運(yùn)動(dòng)1 h，每周5次，為期14 w。在第1周和第9周，大鼠進(jìn)行遞增負(fù)荷實(shí)驗(yàn)測(cè)試最大有氧速度(MAS)。實(shí)驗(yàn)時(shí)以5 m/min的速度熱身8 min，之后每2 min增加一個(gè)速度級(jí)別直至大鼠不能跟上跑臺(tái)速度或停止運(yùn)動(dòng)，此時(shí)的速度即為MAS。簡(jiǎn)單來說，1 h的訓(xùn)練計(jì)劃如下：以MAS的50%進(jìn)行10 min熱身練習(xí)。隨后進(jìn)行5組10 min的跑臺(tái)訓(xùn)練，其中前7 min大鼠以MAS的80%～85%進(jìn)行鍛煉，后3 min大鼠以MAS的50%進(jìn)行鍛煉。

1.4 測(cè)試指標(biāo)

1.4.1體重、脂肪量和BMD：體重、脂肪量、瘦體重使用美國(guó)GE公司產(chǎn)DPX-MD型雙能X線骨密度儀。用Lunar DPX-MD型骨密標(biāo)準(zhǔn)模型和分析軟件度儀及所附小動(dòng)物梯級(jí)在其腰椎體和右側(cè)股骨進(jìn)行掃描，得出大鼠的BMD。

1.4.2骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)：(1)骨小梁靜態(tài)參數(shù)：對(duì)左股骨遠(yuǎn)端干骺端骨骨小梁微結(jié)構(gòu)進(jìn)行μCT(Skyscan 1072，Skyscan，Belgium)掃描。設(shè)置X射線電壓為85 kV，電流110 μA，對(duì)骨組織進(jìn)行掃描，然后利用三維重建軟件進(jìn)行三維構(gòu)建。將興趣區(qū)截取下來，使用Skyscan μCT分析軟件對(duì)下列參數(shù)進(jìn)行測(cè)定：骨體積分?jǐn)?shù)(BV/TV)、骨小梁數(shù)目(Tb.N)、骨量厚度(Tb.Th)、骨小梁分離度(Tb.Sp)。(2)皮質(zhì)骨參數(shù)：對(duì)皮質(zhì)骨的研究，本實(shí)驗(yàn)通過Micro-CT對(duì)左股骨遠(yuǎn)端干骺端進(jìn)行二維重建。將皮質(zhì)骨和骨小梁分離，使用二位計(jì)算方法，轉(zhuǎn)化為二進(jìn)制圖片。對(duì)皮質(zhì)骨的研究我們采用了和骨小梁相同的采集特性。重建后，利用掃描分析儀軟件繪制骨皮質(zhì)輪廓。在閾值反轉(zhuǎn)前，采用簡(jiǎn)單的全閾值法，并開發(fā)了適用于骨小梁的分析算法，用來表現(xiàn)皮質(zhì)孔隙度網(wǎng)絡(luò)的特性。然后，通過Bouxsein等[7]的算法來計(jì)算骨皮質(zhì)形態(tài)參數(shù)?？偯娣e、骨髓區(qū)和皮層厚度評(píng)估使用ImageJ軟件完成。

1.4.3股骨的生物力學(xué)性能：通過施加三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)對(duì)左側(cè)股骨進(jìn)行力學(xué)性能的評(píng)估。每個(gè)股骨固定在計(jì)測(cè)儀兩個(gè)較低的支架上。調(diào)整兩支點(diǎn)間距離為20 mm，將股骨自由放置在支架上，曲面向下，使股骨中點(diǎn)，兩支點(diǎn)中心及加載點(diǎn)重合，以1 mm/min的速度加載至樣本斷裂，用Instron 3343軟件描述載荷-變形曲線。記錄數(shù)據(jù)：最大負(fù)荷(N)、剛度(N/mm)。然后轉(zhuǎn)化為力-位移曲線，得出以下骨生物力學(xué)參數(shù)：從最大負(fù)荷和橫截面積計(jì)算內(nèi)在的模量(彈性模量，MPa)和最大應(yīng)力(N/mm2)[8,9]。

1.4.4骨形成和骨吸收的生化分析：14 w實(shí)驗(yàn)后，對(duì)骨轉(zhuǎn)換標(biāo)記進(jìn)行分析。骨鈣素測(cè)定分析骨形成，骨Ⅰ型膠原氨基端末端交聯(lián)肽(NTx)測(cè)定分析骨吸收。采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定NTx含量。NTx測(cè)定使用Ⅰ型膠原ELISA試劑盒。廣商的批內(nèi)和批間變異系數(shù)分別<8%和<10%。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 體重、脂肪量和BMD

表1 實(shí)驗(yàn)后各組大鼠身體體重變化情況一覽表Table 1 Changes of body weight in rats of different groups after the experiment

注：實(shí)驗(yàn)后與實(shí)驗(yàn)前比較，TP<0.05；與Sham組比較，aP<0.05；與OVX組比較，bP<0.05；與OVX+E組比較，cP<0.05

由表1可知，在實(shí)驗(yàn)前各組大鼠之間的體重、脂肪量不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后對(duì)各組的體重、脂肪量進(jìn)行測(cè)試發(fā)現(xiàn)，OVX組的體重、脂肪量要顯著高于Sham組(P<0.05)；OVX+E+S組的體重、脂肪量顯著低于OVX組(P<0.05)；OVX+E組的脂肪量顯著低于OVX組(P<0.05)。各組的瘦體重之間無(wú)顯著性差異。

表2 實(shí)驗(yàn)后各組大鼠骨密度變化情況一覽表Table 2 Changes of BMD of rats in different groups after the experiment

注：與Sham組比較，aP<0.05；與OVX組比較，bP<0.05；與OVX+E組比較，cP<0.05

由表2可知，OVX組的全身BMD、股骨BMD要顯著低于Sham組，單純性的跑臺(tái)療法未引起去勢(shì)大鼠BMD的顯著變化；單純性的硬化蛋白抗體療法使得趨勢(shì)大鼠全身BMD、股骨BMD顯著增加(P<0.05)；跑臺(tái)和硬化蛋白抗體交互作用，能使去勢(shì)大鼠的BMD發(fā)生顯著提高(P<0.05)。

2.2 骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)

2.2.1骨小梁靜態(tài)參數(shù)

表3 硬化蛋白抗體和跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠股骨遠(yuǎn)端骨小梁結(jié)構(gòu)的影響Table 3 Effect of Scl-Ab and treadmill exercise on the trabecular of the distal femur in rats

注：與Sham組比較，aP<0.05；與OVX組比較，bP<0.05；與OVX+E組比較，cP<0.05

由表3可知，OVX組的股骨遠(yuǎn)端干骺端的骨小梁體積顯著低于Sham組。單純性的硬化蛋白抗體療法，可以顯著提高去勢(shì)大鼠的BV/TV和Tb.Th指標(biāo)(P<0.05)；單純性的運(yùn)動(dòng)療法，能顯著提高去勢(shì)大鼠的骨小梁數(shù)目(P<0.05)；硬化蛋白抗體和運(yùn)動(dòng)交互作用，可以顯著提高趨勢(shì)大鼠股骨遠(yuǎn)端骨小梁結(jié)構(gòu)參數(shù)(P<0.05)。

2.2.2皮質(zhì)骨參數(shù)

表4 硬化蛋白抗體和跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)去勢(shì)大鼠股骨的影響Table 4 Effect of Scl-Ab and treadmill exercise on the femur of female rats

注：與Sham組比較，aP<0.05；與OVX組比較，bP<0.05；與OVX+E組比較，cP<0.05

由表4可知，單純性的硬化蛋白抗體療法能顯著提高去勢(shì)大鼠的皮質(zhì)孔隙率、皮質(zhì)骨體積和皮質(zhì)骨厚度；單純性的運(yùn)動(dòng)或切除卵巢手術(shù)不會(huì)引起雌性大鼠上述指標(biāo)的變化；運(yùn)動(dòng)和硬化蛋白抗體交互作用能顯著提高去勢(shì)大鼠的皮質(zhì)骨參數(shù)(P<0.05)。

2.3 股骨的生物力學(xué)性能

表5 各組大鼠股骨中段生物力學(xué)性能評(píng)價(jià)Table 5 Biomechanical properties of the femur in rats of different

注：與Sham組比較，aP<0.05；與OVX組比較，bP<0.05；與OVX+S組比較，dP<0.05

由表5可知，OVX組的最大載荷和剛度顯著低于Sham組(P<0.05)；單純性的硬化蛋白抗體治療，可以顯著提高大鼠的最大載荷和剛度指標(biāo)(P<0.05)；單純性的運(yùn)動(dòng)對(duì)生物力學(xué)性能無(wú)顯著影響；運(yùn)動(dòng)和硬化蛋白抗體交互作用能顯著提高老齡去勢(shì)大鼠的最大載荷和剛度指標(biāo)(P<0.05)。各組的彈性模量和最大應(yīng)力之間不存在顯著性差異。

2.4 骨形成和骨吸收的生化分析

表6 硬化蛋白抗體和跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)去勢(shì)大鼠骨轉(zhuǎn)換標(biāo)志物的影響Table 6 Effect of Scl-Ab and exercise on bone turnover markers of the femur in female rats

注：與Sham組比較，aP<0.05；與OVX組比較，bP<0.05；與OVX+S組比較，dP<0.05

由表6可知，14w后，去勢(shì)組大鼠的骨形成標(biāo)志物OC和骨代謝標(biāo)志物NTx水平顯著高于Sham組的水平(P<0.05)；單純性的運(yùn)動(dòng)療法可以顯著降低去勢(shì)大鼠的NTx水平(P<0.05)，對(duì)OC水平的影響意義不大；單純性的硬化蛋白療法可以使OC水平升高，但對(duì)NTx水平影響不大；硬化蛋白抗體和運(yùn)動(dòng)交互作用可以進(jìn)一步提高去勢(shì)大鼠的OC水平(P<0.05)，顯著降低NTx水平(P<0.05)。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)老齡去勢(shì)大鼠進(jìn)行硬化蛋白抗體和跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)干預(yù)，探究運(yùn)動(dòng)結(jié)合藥物在去勢(shì)大鼠骨重建過程中，骨代謝指標(biāo)的影響。

3.1 跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)去勢(shì)大鼠骨重建指標(biāo)的影響

根據(jù)McClung等[10]的研究的運(yùn)動(dòng)療法結(jié)合硬化蛋白抗體的最佳劑量建議，使用低劑量的硬化蛋白抗體，每次5 mg/kg，每周2次，對(duì)老齡去勢(shì)大鼠進(jìn)行為期14 w的實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)切除卵巢使得老齡大鼠的脂肪量增加，導(dǎo)致脂肪百分比上升[11,12]，骨密度顯著下降，這符合實(shí)驗(yàn)預(yù)期。單純性的運(yùn)動(dòng)能降低去勢(shì)大鼠的脂肪量。分析運(yùn)動(dòng)持續(xù)時(shí)間對(duì)去勢(shì)大鼠的影響，陳曉紅等[13]研究發(fā)現(xiàn)持續(xù)8 w及8 w以上的中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)可以改善去勢(shì)大鼠的骨密度下降；黃誠(chéng)胤等[14]研究發(fā)現(xiàn)12 w的游泳運(yùn)動(dòng)能明顯抑制去勢(shì)大鼠股骨骨密度的降低；江大雷[15]研究發(fā)現(xiàn)12 w的中藥骨疏靈聯(lián)合運(yùn)動(dòng)能改善去勢(shì)大鼠的骨密度；張健等[16]研究發(fā)現(xiàn)為期14 w的運(yùn)動(dòng)結(jié)合雌二醇治療能改善去勢(shì)大鼠的骨密度。

目前臨床采用運(yùn)動(dòng)療法結(jié)合藥物干預(yù)，是治療骨質(zhì)疏松癥的常見手段。本研究中，單純性的運(yùn)動(dòng)療法能顯著提高去勢(shì)大鼠的骨小梁數(shù)目，單純的運(yùn)動(dòng)對(duì)皮質(zhì)骨參數(shù)無(wú)顯著影響。提示只有當(dāng)運(yùn)動(dòng)配合藥物治療時(shí)，對(duì)骨小梁結(jié)構(gòu)指標(biāo)會(huì)產(chǎn)生較大的影響。本研究還表明：?jiǎn)渭冃缘倪\(yùn)動(dòng)對(duì)去勢(shì)大鼠的股骨生物力學(xué)性能影響效果不大，這一發(fā)現(xiàn)與之前劉建宇[17]研究發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)能改善去卵巢大鼠股骨生物力性能的結(jié)論不盡相同。

3.2 硬化蛋白對(duì)去勢(shì)大鼠骨重建指標(biāo)的影響

本研究中，去勢(shì)大鼠的股骨遠(yuǎn)端干骺端的骨小梁體積顯著降低。單純性的硬化蛋白抗體療法，可以顯著提高去勢(shì)大鼠的股骨厚度。單純性硬化蛋白抗體療法能提高最大載荷和剛度，說明硬化蛋白可以使骨的應(yīng)變?cè)鰪?qiáng)，使得骨結(jié)構(gòu)穩(wěn)定在一個(gè)較高的水平。

研究表明對(duì)獼猴[18]、老年雄性大鼠[19]和雌性大鼠[20]使用硬化蛋白抗體，可以提高骨形成、骨密度和骨強(qiáng)度。硬化蛋白抗體還能顯著增強(qiáng)健康男性和絕經(jīng)后婦女骨形成標(biāo)志物水平[21]，用于治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的單克隆抗體目前正在進(jìn)行臨床Ⅲ期實(shí)驗(yàn)。金麗等[22]研究發(fā)現(xiàn)游泳加中藥淫羊藿綜合療法能促進(jìn)骨形成、抑制骨吸收，防治去卵巢大鼠發(fā)生骨質(zhì)疏松。

本研究發(fā)現(xiàn)：?jiǎn)渭冃缘倪\(yùn)動(dòng)療法能使NTx下降而不影響OC水平，單純性的硬化蛋白抗體療法可以使OC水平顯著升高而NTx水平保持不變。提示去勢(shì)大鼠骨量丟失與骨轉(zhuǎn)換標(biāo)志物OC和骨代謝標(biāo)志物NTx的變化不同步。

3.3 硬化蛋白和跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)交互作用對(duì)去勢(shì)大鼠骨重建指標(biāo)的影響

本研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)和硬化蛋白抗體交互作用時(shí)，不僅降低了去勢(shì)大鼠的脂肪量，還顯著提高了BMD，說明硬化蛋白抗體結(jié)合運(yùn)動(dòng)能改善老齡去勢(shì)大鼠的骨密度。硬化蛋白和跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)協(xié)同作用對(duì)去勢(shì)大鼠骨小梁靜態(tài)參數(shù)有促進(jìn)作用。分析藥物結(jié)合運(yùn)動(dòng)的治療方案，有助于解釋不同藥物結(jié)合運(yùn)動(dòng)對(duì)皮質(zhì)骨的影響差異。孫曉雷等[23]研究發(fā)現(xiàn)柚皮苷聯(lián)合運(yùn)動(dòng)能有效治療去勢(shì)大鼠股骨遠(yuǎn)端骨小梁結(jié)構(gòu)。覃飛等[24]研究發(fā)現(xiàn)低強(qiáng)度激光和有氧運(yùn)動(dòng)能增加絕經(jīng)期大鼠骨小梁數(shù)目。本研究中運(yùn)動(dòng)和低劑量的硬化蛋白交互作用時(shí)，才能發(fā)揮顯著地促進(jìn)作用，進(jìn)一步為硬化蛋白抗體與運(yùn)動(dòng)之間的協(xié)同作用提供了間接佐證。

當(dāng)運(yùn)動(dòng)和硬化蛋白交互作用時(shí)，對(duì)股骨生物力學(xué)性能起到了促進(jìn)作用，分析原因：一方面是硬化蛋白的間接作用，另一方面可能是運(yùn)動(dòng)降低非酶糖化的骨基質(zhì)，這與骨的延展性有一定聯(lián)系，可能是OVX+E+S組大鼠骨膜輕微擴(kuò)張的結(jié)果。也有研究表明通過數(shù)月的運(yùn)動(dòng)，可以降低大鼠非酶交聯(lián)骨基質(zhì)[25]。考慮到本實(shí)驗(yàn)對(duì)象為老齡大鼠，強(qiáng)度與Kohrt建議的運(yùn)動(dòng)處方一致，所以認(rèn)為本實(shí)驗(yàn)采用的藥物聯(lián)合運(yùn)動(dòng)防止骨質(zhì)疏松癥方法可以應(yīng)用于中老年人，建議該人群采用步行、劃船、持舉啞鈴等運(yùn)動(dòng)方式、50%～60%VO2max的運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度進(jìn)行運(yùn)動(dòng)。當(dāng)運(yùn)動(dòng)配合藥物治療，表現(xiàn)出良好的協(xié)同作用，可以提高OC水平的同時(shí)減低NTx水平。

4 結(jié)論

適度的跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)可以防止老齡去勢(shì)大鼠骨丟失，改善去勢(shì)大鼠骨健康。硬化蛋白抗體療法可以增加皮質(zhì)骨骨量和骨強(qiáng)度，預(yù)防去勢(shì)大鼠絕經(jīng)后對(duì)骨代謝產(chǎn)生的不良影響。硬化蛋白和運(yùn)動(dòng)表現(xiàn)出良好的協(xié)同作用，對(duì)老齡去勢(shì)大鼠骨重建具有積極的作用。