1型糖尿病骨質(zhì)疏松大鼠模型的建立及評(píng)價(jià)

張麗媛 納青青 吳天秀 周滿如 李近 劉鈺瑜

1.廣東醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室，湛江 524023 2.廣東醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，湛江 524023

糖尿病與冠心病、腫瘤是當(dāng)前影響人類健康的三大非傳染性疾病，已成為全球性的衛(wèi)生問(wèn)題。根據(jù)WHO的預(yù)測(cè)報(bào)告，到2030年時(shí)，全球會(huì)有4.39億人患有糖尿病，約占世界總?cè)丝诘?.7%[1]。依賴胰島素的1型糖尿病是由免疫炎性T細(xì)胞通過(guò)直接或間接的方式選擇性損毀胰島β細(xì)胞導(dǎo)致的慢性自身免疫性疾病，多發(fā)于青少年。

早在1948年，Albright首先報(bào)道了血糖長(zhǎng)期控制不良的糖尿病病人可以發(fā)生骨質(zhì)疏松癥。目前的研究已經(jīng)明確1型糖尿病能夠?qū)е鹿橇繙p少，使骨折危險(xiǎn)性增加，但還不清楚其導(dǎo)致骨量減少的進(jìn)程，其作用機(jī)制也存在爭(zhēng)議[2]。目前大多數(shù)研究是針對(duì)中老年女性發(fā)生骨質(zhì)疏松進(jìn)行研究，較少研究青少年糖尿病性骨質(zhì)疏松，且對(duì)該疾病的研究大多局限在某一選定時(shí)間點(diǎn)上，沒(méi)有對(duì)整個(gè)疾病進(jìn)程的變化情況進(jìn)行系統(tǒng)的研究分析。為了進(jìn)一步研究1型糖尿病大鼠骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機(jī)理和藥物對(duì)其的防治作用，我們迫切需要一個(gè)動(dòng)物模型進(jìn)行研究，所以，建立理想的動(dòng)物模型至關(guān)重要。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料與儀器

炭化鎢鋼刀(德國(guó) LEICA 公司); LEICA2155 硬組織切片機(jī) (德國(guó) LEICA 公司); 低速鋸 (BuehlerLTD． USA); 數(shù)字化板(SummaSketchRIiplus); LEICAMP30 熒光顯微鏡及顯微照相機(jī) (德國(guó) LEICA 公司); LEICA QWN 半自動(dòng)圖象分析儀(德國(guó) LEICA公司);Micro-CT(SKYSCAN 1176)； AE240 電子天平(梅特勒-托利多儀器公司上海分公司); 游標(biāo)卡尺(湛江市量具刃具廠); 電熱恒溫電烤箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠); IRIS/AP 電感偶合等離子體發(fā)射光譜儀(TJA，USA)。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與方法

SD大鼠60只，雄性，體質(zhì)量(201±20) g，3 月齡，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(動(dòng)物合格證書(shū)編號(hào): 2006A015)。將60只大鼠隨機(jī)分為模型組、對(duì)照組，每組30只。

1.3造模與處理

1型糖尿病大鼠模型制備：分別用常規(guī)飼料喂養(yǎng)1周，第1周末禁食12 h后，進(jìn)行腹腔注射STZ60 mg/kg[3]，注射部位選擇在下腹部后1/3處避開(kāi)中部膀胱。造模72 h后，以血糖≥17.6 mmol/L作為成模標(biāo)準(zhǔn)，其余未成模大鼠剔除實(shí)驗(yàn)。兩組大鼠均正常飼養(yǎng)，保持合適的溫度和濕度，給予充足的飲水和食物，定期監(jiān)測(cè)血糖，保證模型的穩(wěn)定。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中通過(guò)活體MicroCT分析及三維結(jié)構(gòu)重建，測(cè)得實(shí)驗(yàn)組大鼠的骨密度值。采用隨機(jī)數(shù)字表法，分別于造模成功后1周、4周、8周、12周、16周各隨機(jī)選取6只糖尿病模型大鼠和周齡相匹配的6只對(duì)照組大鼠處死。選取大鼠稱重后，分別以1%的氯胺酮100 mg/kg腹腔注射行全身麻醉，留取所處死大鼠的股骨以備下一步實(shí)驗(yàn)用。

1.4觀察指標(biāo)

骨標(biāo)本的制作及測(cè)量指標(biāo): 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，用 3% 戊巴比妥鈉(1.5 mL/kg) 行腹腔注射麻醉后右心室徹底抽血處死(以減少骨髓中紅細(xì)胞，排除干擾，使骨片更易于觀察分析)。取大鼠左側(cè)股骨，剔干凈軟組織。左側(cè)脛骨用低速據(jù)沿額狀面鋸開(kāi)干骺端，暴露骨髓腔，于脛骨上端 1 /3 處橫行鋸斷脛骨，此為脛骨上端。將余下的脛骨于脛骨和腓骨結(jié)合處橫向鋸開(kāi)，作中段骨檢測(cè)。用 LEICA QWN 半自動(dòng)圖象分析儀測(cè)定并根據(jù)公式計(jì)算骨小梁面積、骨小梁厚度、骨小梁數(shù)目及骨小梁分離度[4]。

2 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)均采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，結(jié)果以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，組內(nèi)兩樣本均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，組間差異采用單因素方差分析的方法分析。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1造模后大鼠空腹血糖的變化情況 造模前對(duì)照組和造模組血糖無(wú)差異。造模后，模型組血糖遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常組，并且在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行期間，造模組的血糖一直維持在高位，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)造模成功。

表1 兩組大鼠不同時(shí)間血糖變化(mmol/l)Table 1 The change of blood glucose in rats of two groups (mmol/L)

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05，ΔP<0.01
Compared to controls,*P<0.05,ΔP<0.01

3.2造模對(duì)大鼠體重變化的影響

對(duì)照組大鼠體重從第1周至第16周一直呈上升趨勢(shì)，，模型組大鼠的體重在各選定實(shí)踐點(diǎn)都低于對(duì)照組，但第1周差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在第4周后模型組大鼠體重明顯低于對(duì)照組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。同時(shí)觀察造模大鼠的一般情況，發(fā)現(xiàn)造模后大鼠明顯多飲多尿，結(jié)合大鼠體重變化，可以從癥狀上判定造模成功，見(jiàn)表2。

表2 兩組大鼠不同時(shí)間體重變化(g)Table 2 The change of body weight in rats of two groups (g).

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05，ΔP<0.01
Compared to controls,*P<0.05,ΔP<0.01

3.3造模對(duì)大鼠股骨骨密度的影響

隨著大鼠年齡的增長(zhǎng)，正常大鼠股骨骨密度無(wú)明顯變化，糖尿病大鼠股骨骨密度逐漸降低。與對(duì)照組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較，模型組大鼠股骨骨密度明顯降低(P<0.05或P<0.01)，見(jiàn)表3。

表3 兩組大鼠不同時(shí)間股骨骨密度變化(g/cm3)Table 3 The change of BMD of the femur in rats of two groups (g/cm3).

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05，ΔP<0.01
Compared to controls,*P<0.05,ΔP<0.01

3.4造模對(duì)大鼠形態(tài)計(jì)量學(xué)參數(shù)的影響

表4 兩組大鼠不同時(shí)間脛骨上端形態(tài)計(jì)量學(xué)參數(shù)比較Table 4 Comparison of histomorphometry parameters of the upper tibia between the two groups.

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05，ΔP<0.01
Compared to controls,*P<0.05,ΔP<0.01

由表4可見(jiàn)，骨小梁面積于第1W即開(kāi)始降低，此后持續(xù)降低，第4W降低達(dá)17.71%；于第4W-第8W間降低速度最快，幅度最大，達(dá)到48.09%。骨小梁厚度也是第1W即開(kāi)始降低，此后持續(xù)降低，第4W降低達(dá)11.49%；于第4W-第8W間降低速度最快，幅度最大，達(dá)到48.91%。骨小梁數(shù)目降低較緩和，各個(gè)時(shí)間段下降的幅度差別不大。骨小梁分離度與第1W即開(kāi)始增加，此后持續(xù)增加，第4W增加達(dá)13.17%；于第4W-第8W間增加速度最快，幅度最大，達(dá)到51.28%。

4 討論

近年來(lái)糖尿病患病人數(shù)激增，已經(jīng)受到越來(lái)越多人的重視，逐漸成為研究的熱點(diǎn)?，F(xiàn)已明確I型糖尿病能夠?qū)е鹿橇繙p少，骨折危險(xiǎn)性增加，但是糖尿病性骨質(zhì)疏松的發(fā)病機(jī)理還未得到最終闡明[5]，在糖尿病研究領(lǐng)域?qū)ふ冶容^接近人類糖尿病發(fā)病過(guò)程的動(dòng)物模型，對(duì)于更深入闡明糖尿病性骨質(zhì)疏松的發(fā)病機(jī)理及分子生物學(xué)機(jī)制具有重要的科學(xué)意義。

糖尿病模型制備的選擇：糖尿病動(dòng)物模型有實(shí)驗(yàn)性和自發(fā)性動(dòng)物模型，自發(fā)性動(dòng)物模型的應(yīng)用價(jià)值很高，但由于價(jià)格昂貴，飼養(yǎng)條件要求嚴(yán)格和不易成模等原因得不到廣泛應(yīng)用；實(shí)驗(yàn)性動(dòng)物模型的制備方法包括胰腺切除、藥物誘發(fā)、食物誘發(fā)等。其中藥物誘發(fā)由于操作簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉及成模率等優(yōu)點(diǎn)在糖尿病動(dòng)物模型中應(yīng)用最為廣泛，常用藥物為鏈脲佐菌素(STZ)。它是一種廣譜抗菌素,具有抗菌、抗腫瘤的性能和致糖尿病的副作用。STZ導(dǎo)致糖尿病的機(jī)制為[6]:STZ具有活撥的烴基結(jié)構(gòu),可以直接損傷胰島β細(xì)胞DNA,刺激其釋放H2O2,過(guò)量的H2O2及其轉(zhuǎn)化形成的烴自由基引起細(xì)胞DNA斷裂,增加脂質(zhì)過(guò)氧化物水平,抑制胰島素的釋放[7]。有研究表明,STZ對(duì)破壞胰島β細(xì)胞具有高度特異性的毒性作用,造模成功后較穩(wěn)定,死亡率低。有研究指出,大鼠腹腔注射STZ成模率可達(dá)到90%,并：腹腔注射較尾靜脈注射操作簡(jiǎn)單,準(zhǔn)確快速,因此現(xiàn)多采用腹腔注射STZ法制作糖尿病模型。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),糖尿病模型大鼠成模后,血糖值高于造模成的隨機(jī)血糖標(biāo)準(zhǔn)且較穩(wěn)定。通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析各時(shí)間點(diǎn)大鼠血糖變化,發(fā)現(xiàn)血糖變化起伏小。從而也證明了STZ確為造模效果明確、造模穩(wěn)定、成活率較高的胰島細(xì)胞破壞藥物。總之,本研究認(rèn)為一次大劑量STZ注射制備糖尿病模型的方法使用簡(jiǎn)單,造模效果好,成活率高。

造模動(dòng)物的選擇：常用于制作骨質(zhì)疏松模型的動(dòng)物油犬、羊、豬、大鼠、小鼠和兔等[8]，由于大鼠與人類骨骼的病例生理相似且比較經(jīng)濟(jì)，所以，本研究采用大鼠制作1型糖尿病性骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型。

造模動(dòng)物種屬、性別的選擇：STZ誘發(fā)糖尿病的作用具有種屬差異性，wistar糖尿病鼠少數(shù)可自發(fā)緩解，但少見(jiàn)SD大鼠自發(fā)緩解的報(bào)道，提示SD大鼠可能優(yōu)于wistar鼠。此外有報(bào)道SD大鼠成模率也高于wistar鼠，但無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[9]。綜合文獻(xiàn)報(bào)道，在本實(shí)驗(yàn)中，我們選擇了SD大鼠。此外Mordes[10]等報(bào)道，選用雄性大鼠制備模型的成模率明顯高于雌性大鼠。故在本實(shí)驗(yàn)中，我們選擇雄性大鼠。

造模動(dòng)物年齡選擇：大鼠壽命一般為2～3年，3月齡的大鼠已達(dá)到性成熟，6月齡大鼠才能真正達(dá)到骨成熟，17月齡即進(jìn)入老年時(shí)期。本實(shí)驗(yàn)主要研究多發(fā)于青少年的1型糖尿病性骨質(zhì)疏松，故選擇小于3月齡大鼠制作1型糖尿病模型是合適的，本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇的是6～8周的SD大鼠。為觀察成模的穩(wěn)定性，本實(shí)驗(yàn)觀察了成模后16W各種指標(biāo)的變化，結(jié)果顯示該模型穩(wěn)定性好。

骨質(zhì)疏松模型的指標(biāo)有骨密度、生物力學(xué)、骨組織形態(tài)、血清生化和尿生化，以及骨生成和吸收耦聯(lián)中分子的變化。而骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)是用定量的方法分析骨組織結(jié)構(gòu)改變的測(cè)量技術(shù)，能精確地測(cè)量骨組織結(jié)構(gòu)和總體骨量的變化，是描述骨小梁結(jié)構(gòu)變化的有效指標(biāo)，為骨質(zhì)疏松提供病理學(xué)證據(jù)，可作為診斷骨質(zhì)疏松依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)研究6-8周齡雄性大鼠1型糖尿病模型制備成功后，第1W開(kāi)始骨量降低，第4W后發(fā)生急劇的下降，第8W已降低接近50%。1型糖尿病早期即開(kāi)始出現(xiàn)骨質(zhì)破壞，提示糖尿病性骨質(zhì)疏松的預(yù)防和治療應(yīng)從發(fā)病初期即開(kāi)始進(jìn)行。

綜上所述，利用一次大劑量STZ注射的方法，可以制備符合1型糖尿病特點(diǎn)的1型糖尿病大鼠模型，本研究從大鼠成模后第1W開(kāi)始觀察其骨形態(tài)學(xué)的變化，連續(xù)觀察16W，揭示在糖尿病性骨質(zhì)疏松癥發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中骨骼變化的規(guī)律，為臨床預(yù)防和治療I型糖尿病性骨質(zhì)疏松提供動(dòng)物實(shí)驗(yàn)依據(jù)。