胃癌細(xì)胞miR-100表達(dá)及對(duì)靶基因ZBTB7A的調(diào)控作用

方 瑩 張小平 鄔萬(wàn)新

胃癌細(xì)胞miR-100表達(dá)及對(duì)靶基因ZBTB7A的調(diào)控作用

方 瑩 張小平 鄔萬(wàn)新

目的探討胃癌細(xì)胞miR-100表達(dá)及其對(duì)ZBTB7A基因的調(diào)控作用。方法使用人胃癌細(xì)胞株SGC-7901（低分化、轉(zhuǎn)移）和BGC-823（低分化），將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為SGC-7901miR-100組、SGC-7901miR-100抑制劑組、SGC-7901Si-陰性對(duì)照組、SGC-7901Si-ZBTB7A組、BGC-823 miR-100組、BGC-823 miR-100抑制劑組、BGC-823 Si-陰性對(duì)照組及BGC-823 Si-ZBTB7A組。定量PCR法檢測(cè)各組miR-100及ZBTB7A mRNA的表達(dá)，免疫印跡法檢測(cè)ZBTB7A蛋白表達(dá)水平，細(xì)胞遷移與體外侵襲實(shí)驗(yàn)測(cè)定體外細(xì)胞遷移和侵襲能力，通過(guò)質(zhì)粒構(gòu)建及雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)ZBTB7A 3′UTR載體相關(guān)的熒光素酶的活性情況。結(jié)果熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)顯示，在miR-100過(guò)度表達(dá)的SGC7901和BGC823細(xì)胞中，與熒光素酶活性相關(guān)的ZBTB7A 3′UTR載體顯著減少，分別為（46.4±1.9）%和（55.7±2.3）%；miR-100被敲除時(shí)，ZBTB7A 3′UTR載體相關(guān)的熒光素酶的活性上調(diào)，分別為（32.7±1.9）%和（25.4±3.3）%。蛋白免疫印跡法顯示，過(guò)表達(dá)的miR-100導(dǎo)致SGC7901和BGC823細(xì)胞中ZBTB7A表達(dá)的蛋白水平分別降低（81.8±3.8）%和（62.9± 1.3）%；當(dāng)miR-100被敲除時(shí)，ZBTB7A的蛋白水平分別上調(diào)（38.1±2.7）%和（46.5±3.4）%。結(jié)論ZBTB7A是miR-100的靶基因，miR-100表達(dá)可以下調(diào)ZBTB7A的表達(dá)，從而抑制胃癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和生長(zhǎng)。

胃癌；miR-100；ZBTB7A

胃癌是一個(gè)重大的世界性的公共衛(wèi)生問(wèn)題，是癌癥相關(guān)致死的第二大常見原因[1]，當(dāng)前對(duì)miRNA的研究給胃癌的治療提供了新的策略和方向。miR-100是一種非編碼、由20～25核苷酸組成的RNA，屬于MicroRNAs（miRNAs）的一種，常在人類癌癥中出現(xiàn)異常表達(dá)，ZBTB7A是一個(gè)腫瘤抑制基因，而在胃癌中，ZBTB7A基因是否是miR-100的靶點(diǎn)，以及對(duì)胃癌的轉(zhuǎn)移和侵襲的聯(lián)系仍然未知，本文以此為出發(fā)點(diǎn)，探究胃癌中miR-100的異常表達(dá)對(duì)ZBTB7A基因的作用。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞系使用人胃癌細(xì)胞株SGC-7901（低分化、轉(zhuǎn)移）和BGC-823（低分化）。購(gòu)于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（馬納薩斯，VA，美國(guó)）以及上海癌癥研究所（上海，中國(guó)）。所有細(xì)胞系均在37℃，適宜濕度，和5%CO2的環(huán)境中培養(yǎng)，于RPMI 1640培養(yǎng)液中，添加10%的胎牛血清（FBS）。

1.2 試劑和藥品Trizol試劑（Takara公司）,一抗兔體ZBTB7A（1：1000，劍橋，英國(guó)），一抗小鼠抗β-Actin（1：1000）。預(yù)染標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白marker（Fermentas）。雙熒光素酶載體pmirGLO，內(nèi)切酶XbaI、SacI，T4 DNA連接酶，感受態(tài)細(xì)菌DHS a（Transgen），雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒（Promega），Pre-miR-100，Negative Control，si-ZBTB7A，Anti-miR-100 inhibitor，X-treme GENE transfection reagent（Roche）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞分組及轉(zhuǎn)染將SGC-7901細(xì)胞系和BGC-823細(xì)胞系分為8組，即SGC-7901miR-100組；SGC-7901miR-100抑制劑組；SGC-7901Si-陰性對(duì)照組（SCC-7901-空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組）；SGC-7901Si-ZBTB7A組；BGC-823 miR-100組；BGC-823 miR-100抑制劑組；BGC-823 Si-陰性對(duì)照組（BGC-823-空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組）；BGC-823 Si-ZBTB7A組。分別對(duì)每組細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染[2]，轉(zhuǎn)染步驟按Roche公司GENE transfection reagent試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。將BGC823和SGC7901細(xì)胞消化接種于12孔板，每孔接種1× 105個(gè)細(xì)胞,待其貼壁后轉(zhuǎn)染，于2個(gè)EP管中，1個(gè)EP管加入47μL無(wú)血清培養(yǎng)基和3μL相對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，另一個(gè)EP管加入48μL無(wú)血清培養(yǎng)基和2μLX-treme GENE轉(zhuǎn)染試劑，將兩個(gè)EP管混合并孵育15min，將轉(zhuǎn)染試劑添加到12孔板內(nèi)，培養(yǎng)箱孵育72h之內(nèi)通過(guò)熒光顯微鏡觀察并驗(yàn)證其轉(zhuǎn)染效率,每組轉(zhuǎn)染效率大于70%的樣本即可滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。

2.2 定量PCR按Trizol試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）[3]，對(duì)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的四組細(xì)胞提取細(xì)胞總RNA,通過(guò)紫外分光光度計(jì)對(duì)RNA濃度及純度進(jìn)行測(cè)定。每組取5μL總RNA，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以此為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，之后予2%瓊脂糖凝膠電泳，Band Scan 6.0圖像分析軟件對(duì)各電泳條帶灰度值進(jìn)行分析，目的條帶的灰度值與內(nèi)參灰度值的比值為miRNA和ZBTB7A mRNA的相對(duì)表達(dá)量。每個(gè)樣品分析3次。

2.3 免疫印跡法在細(xì)胞中加入RIPA裂解液提取總蛋白，通過(guò)12%SDS變性聚丙烯酰胺凝膠（SDSPAGE）電泳分離獲得的蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，封閉后將膜加入目標(biāo)蛋白的抗體ZBTB7A（1：1000，劍橋，英國(guó)）或β-actin（1：1000）進(jìn)行孵育2h，經(jīng)洗膜封閉再將膜置于含HRP標(biāo)記的二抗，ECL反應(yīng)顯色、曝光。進(jìn)行3次獨(dú)立的蛋白免疫印跡分析實(shí)驗(yàn)。

2.4 細(xì)胞遷移與體外侵襲實(shí)驗(yàn)使用8μm孔徑（24-well insert、Corning、紐約、美國(guó)）的Transwell，對(duì)體外細(xì)胞遷移和侵襲能力的測(cè)定[4]。通過(guò)48h的轉(zhuǎn)染后再對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化，在每個(gè)8μm孔徑的小室中鋪入80μL的1：8基質(zhì)膠，在每個(gè)小室中接種1×105個(gè)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，添加100μL不含血清的RPMI1640培養(yǎng)基，在Transwell的下室中加入含有血清的完全RPMI1640培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱中孵育24h，棉簽拭去上室細(xì)胞，用4%多聚甲醛進(jìn)行15min的固定后用結(jié)晶紫常規(guī)染色10min，最后顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野拍照并計(jì)數(shù)。在遷移實(shí)驗(yàn)中不需要在小室中鋪基質(zhì)膠，于培養(yǎng)箱中孵育16h。

2.5 熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)質(zhì)粒構(gòu)建參照文獻(xiàn)[2]。將推定的miR-100的基因啟動(dòng)子區(qū)域包含的結(jié)合位點(diǎn)通過(guò)PCR擴(kuò)增放大并亞克隆到pGL3-Basic載體上游區(qū)（Promega）。從SGC7901細(xì)胞和BGC823細(xì)胞中提取Total RNA，并擴(kuò)增出ZBTB基因的3'UTR區(qū)，3'-UTR片段與pmirGLO載體連接。分別將PremiR-100及NC與構(gòu)建好的熒光載體共轉(zhuǎn)染至胃癌細(xì)胞內(nèi)，于12孔板中37℃下孵育48h，用細(xì)胞裂解液將細(xì)胞裂解，取50μL裂解液轉(zhuǎn)移至96孔板內(nèi)，每孔加50μL螢火蟲、海腎熒光素酶底物，于高靈敏度化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀上檢測(cè)并讀取平均值。進(jìn)行3次獨(dú)立的熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s） 表示,并進(jìn)行正態(tài)性及方差齊性檢驗(yàn)，多組均數(shù)比較采用ANOVA分析，兩兩比較采用Dunnett-t檢驗(yàn)，Spearman相關(guān)分析檢測(cè)miR-100和ZBTB7A表達(dá)水平之間的關(guān)系。P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 胃癌細(xì)胞ZBTB7A是miR-100的直接功能靶基因熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)顯示在miR-100中過(guò)度表達(dá)的SGC7901和BGC823細(xì)胞中，與熒光素酶活性相關(guān)的ZBTB7A pmirglo3′UTR載體顯著減少,與陰性對(duì)照組比較，分別下調(diào)（46.4±1.9）%和（55.7± 2.3）%（P均＜0.01）。當(dāng)miR-100被敲除時(shí)，ZBTB7A pmirglo-3′UTR載體相關(guān)的熒光素酶的活性分別上調(diào)（32.7±1.9）%和（25.4±3.3）%（P均＜0.05）。見圖1（封二）。

3.2 miR-100表達(dá)水平與胃癌細(xì)胞ZBTB7A蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)免疫印跡法實(shí)驗(yàn)表明，過(guò)表達(dá)的miR-100導(dǎo)致SGC7901和BGC823細(xì)胞中的ZBTB7A表達(dá)的蛋白水平分別降低（81.8±3.8）%（P＜0.01）和（62.9± 1.3）%（P＜0.05）。當(dāng)miR-100被敲除時(shí)，ZBTB7A的蛋白水平出現(xiàn)分別上調(diào)（38.1±2.7）%（P＜0.05）和（46.5± 3.4）%（P＜0.05），見圖2（封二）。spearman相關(guān)性分析：miR-100表達(dá)水平與胃癌中ZBTB7A蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，見圖3（封二）。

3.3 ZBTB7A下調(diào)抑制胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲與空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的Si-陰性對(duì)照組比較，通過(guò)si-ZBTB7A敲除SGC7901和BGC823細(xì)胞中的ZBTB7A后，RT-qPCR檢測(cè)SGC7901和BGC823細(xì)胞中的ZBTB7AmRNA和蛋白表達(dá)顯著減少，分別下調(diào)（84.6±2.9）%（P＜0.01）和（70.4±1.2）%（P＜0.05），免疫印跡法檢測(cè)SGC7901和BGC823細(xì)胞中ZBTB7Am-RNA和蛋白表達(dá)分別下調(diào)（56.9±2.9）%和（73.2± 1.2）%（均P＜0.01），見圖4（封二）。通過(guò)Transwells對(duì)體外胃癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的測(cè)定，ZBTB7A敲除的胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力被抑制，SGC7901胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移細(xì)胞數(shù)下降（59.4±1.3）%（P＜0.01），侵襲細(xì)胞數(shù)下降（48.4±2.7）%（P＜0.05），BGC823胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移細(xì)胞數(shù)下降（36.4±2.4）%（P＜0.05），侵襲細(xì)胞數(shù)下降（41.9±3.0）%（P＜0.05），見圖5～6（封二）。顯示提示在胃癌的發(fā)病機(jī)制中，ZBTB7A可能扮演了重要角色，將有可能作為判斷胃癌患者預(yù)后的生物標(biāo)志物。見表1～2。

表1 SGC7901 transwell遷移、侵襲能力（x±s）

表2 BGC823 transwell遷移、侵襲能力（x±s）

4 討論

目前已知miR-100是兒童腎上腺皮質(zhì)腫瘤和卵巢透明細(xì)胞癌的mTOR基因的靶點(diǎn)[5-6]。在急性髓系白血病，miR-100通過(guò)下調(diào)RBSP3促進(jìn)癌細(xì)胞增殖[7]。miR-100在胃癌組織和細(xì)胞系中也出現(xiàn)顯著下調(diào)，miR-100的下調(diào)促進(jìn)了胃癌細(xì)胞在體外和體內(nèi)的侵襲和轉(zhuǎn)移[8]。

ZBTB7A是POK（POZ/BTB and Kruppel）轉(zhuǎn)錄因子家族的一個(gè)成員，可直接結(jié)合到啟動(dòng)子區(qū)域并對(duì)糖酵解關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄抑制。以往研究表明，ZBTB7A在多種腫瘤的原癌基因失調(diào)中扮演了重要的角色[9]。在一些文獻(xiàn)中ZBTB7A曾被描述為前列腺癌[10]和結(jié)腸癌[11]的一個(gè)腫瘤抑制基因，在這些腫瘤中，ZBTB7A的缺乏使其表現(xiàn)出更強(qiáng)的侵襲性，但是腫瘤相關(guān)基因受到不同的機(jī)制調(diào)控，因此在不同的人類腫瘤中表現(xiàn)出不一致的功能。Mann等[12]報(bào)道ZBTB7A通過(guò)抑制ARF促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，ZBTB7A也促進(jìn)細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)基因小鼠淋巴瘤的形成。Fang等[13]發(fā)現(xiàn)ZBTB7A通過(guò)p53、p21和p27的表達(dá)來(lái)促進(jìn)細(xì)胞增殖。

許多科研工作者通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)MicroRNAs對(duì)胃癌的發(fā)生及轉(zhuǎn)歸存在重要的作用，陳宗科等[14]發(fā)現(xiàn)miR-24在胃癌細(xì)胞株SGC-7901和BGC-803及胃癌組織中的表達(dá)呈現(xiàn)上調(diào)，可能參與了胃癌發(fā)生；林巧愛等[15]發(fā)現(xiàn)miR-143在胃癌組織較癌旁正常胃黏膜組織中的表達(dá)呈現(xiàn)下調(diào)，在胃癌分化度的區(qū)分上有更好的敏感性及特異性。然而在人類胃癌中miR-100的功能及其臨床病理意義尚未描述清楚，前面有論述miR-100在胃癌組織和細(xì)胞系中也出現(xiàn)顯著下調(diào)[9]，然而關(guān)于miR-100下調(diào)后ZBTB7A表達(dá)以及miR-100與ZBTB7A的關(guān)系目前尚無(wú)相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行研究以及解釋，因此本研究基于ZBTB7A基因是否是miR-100的靶點(diǎn)，以及對(duì)胃癌的轉(zhuǎn)移和侵襲的聯(lián)系仍然未知為出發(fā)點(diǎn)，探究胃癌中miR-100的異常表達(dá)對(duì)ZBTB7A基因的作用，為臨床治療提供可靠的分子機(jī)制。

本研究通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因與免疫印跡法發(fā)現(xiàn)miR-100過(guò)度表達(dá)的SGC7901和BGC823細(xì)胞中，與熒光素酶活性相關(guān)的ZBTB7A 3′UTR載體顯著減少，ZBTB7A表達(dá)的蛋白水平降低。同時(shí)觀察到人胃癌中ZBTB7A的表達(dá)與miR-100之間呈負(fù)相關(guān)。這證實(shí)ZBTB7A是miR-100在胃癌中的靶基因。發(fā)現(xiàn)通過(guò)SiRNA敲除ZBTB7A顯著減少了體外培養(yǎng)的胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，提示在胃癌的發(fā)病機(jī)制中，ZBTB7A可能扮演了重要角色，將有可能作為判斷胃癌患者預(yù)后的生物標(biāo)志物。

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（收稿：2016-04-23修回：2016-07-13）

Expression of m iR-100 and Its Effect on ZBTB7A Gene in Gastric Cancer

Fang Ying,Zhang Xiaoping,Wu Wanxin.Department of Pathology,First Hospital of Jiaxing,Jiaxing(314000)，China

Objective To investigate on the effect of miR-100 expression on ZBTB7A gene in gastric cancer. Methods Gastric cancer cell lines SGC-7901（poorly differentiated and metastasized）and BGC-823（poorly differentiated）were used in this study.They were divided into 8 groups：SGC-7901miR-100 group,SGC-7901miR-100-inhibited group,SGC-7901 Si-negative control group,and SGC-7901 Si-ZBTB7A group,BGC-823miR-100 group, BGC-823miR-100-inhibited group,BGC-823miR-100 negative control group,and BGC-823 Si-ZBTB7A group. Real-time quantitative PCR was used to analyze the mRNA expression of miR-100 and ZBTB7A;Western blot was used to detect the level of ZBTB7A protein;cell migration and invasion assay was used to assess in vitro the migration and invasion ability of cells.The luciferase activity of ZBTB7A 3'UTR vector was measured by plasmid construction and dual-luciferase report assay.Results The relative luciferase activity of the ZBTB7A 3'UTR vector were significantly reduced in miR-100 overpressing SGC7901 and BGC823 cells by（46.4±1.9）%and（55.7±2.3）%, respectively;when miR-100 was knocked down,the upregulated luciferase activity of ZBTB7A 3'UTR vector was observed by（32.7±1.9）%and（25.4±3.3）%,respectively.Western blot results showed that overexpression of miR-100 reduced the protein level of ZBTB7A in SGC7901 and BGC823 cells by（81.8±3.8）%and（62.9±1.3）%,respectively; the protein level of ZBTB7A was upregulated by（38.1±2.7）%and（46.5±3.4）%when miR-100 was knocked down. Conclusion ZBTB7A is a direct target of miR-100 in gastric cancer.The expression of miR-100 can downregulate the expression of ZBTB7A,resulting in inhibiting the metastasis and growth of gastric cancer.

gastric cancer;miR-100;ZBTB7A

浙江省嘉興市第一醫(yī)院病理科（嘉興314000）

方瑩，Tel：13857329715；E-mail：64111309@qq.com