乙酸酐衍生GC-ECD法測(cè)定飲料中三氯蔗糖含量

黃志勇，陳 艷，馮 慧，劉 超，景 贊（樂(lè)山市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，四川 樂(lè)山 614000）

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乙酸酐衍生GC-ECD法測(cè)定飲料中三氯蔗糖含量

黃志勇，陳 艷，馮 慧，劉 超，景 贊
（樂(lè)山市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，四川 樂(lè)山 614000）

建立一種乙酸酐衍生-氣相色譜-電子捕獲器檢測(cè)食品中三氯蔗糖含量的方法。樣品經(jīng)水稀釋、1-甲基咪唑催化、乙酸酐衍生，生成的衍生物采用氣相色譜-質(zhì)譜法定性，氣相色譜-電子捕獲器法定量。結(jié)果表明：衍生目標(biāo)物為4，1′，6′-三氯-2，3，6，3′，4′-五乙?；崽?，并且在0.02～1.2 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（R= 0.999 4），檢出限為0.23 mg/kg，回收率為90.0%～94.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）為0.6%～2.5%。該方法操作簡(jiǎn)單、干擾少、檢出限低、靈敏度高、線性好、結(jié)果準(zhǔn)確，能很好地滿足飲料中三氯蔗糖含量的測(cè)定。

三氯蔗糖；乙酸酐衍生；氣相色譜-電子捕獲器；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用

三氯蔗糖（4，1′，6′-三氯-4，1′，6′-三脫氧半乳型蔗糖），俗稱蔗糖素［1］，是天然產(chǎn)物蔗糖的氯代衍生物，首先由英國(guó)泰萊公司與倫敦大學(xué)合作研究小組成功合成。因其具有甜度高（甜度是蔗糖的600 倍）、且甜味純正、穩(wěn)定性好、熱值低（熱值幾乎為零）、安全性高［2-4］等諸多優(yōu)點(diǎn)而被視為是一種較理想的新型甜味劑5-6］。但也有三氯蔗糖可誘發(fā)偏頭疼發(fā)作［7］以及可能通過(guò)作用于人類腸道中的細(xì)菌，從而加重代謝性疾病病情的報(bào)道［8］。三氯蔗糖作為食品添加劑時(shí)必須按照GB 2760—2014《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》［9］中規(guī)定的范圍和限量使用。

目前，食品中三氯蔗糖的測(cè)定方法主要集中在液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法［10-12］和高效液相色譜的柱前衍生紫外檢測(cè)［13-14］、蒸發(fā)光散射檢測(cè)［15-19］和示差折光檢測(cè)［19-21］，但采用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器其重現(xiàn)性還不夠理想，示差折光檢測(cè)器靈敏度低，不能進(jìn)行梯度淋洗，達(dá)不到良好的分離效果。而對(duì)于實(shí)驗(yàn)室儀器普及率很高的氣相色譜（gas chromatography，GC）在這方面的應(yīng)用報(bào)道較少。Qiu Wenlong［22］、Farhadi［23］等報(bào)道了非食品中的三氯蔗糖在吡啶溶劑中進(jìn)行三甲基硅烷化衍生后GC法測(cè)定，都獲得了不錯(cuò)的結(jié)果，但此方法過(guò)程較復(fù)雜且對(duì)無(wú)水條件要求較高，產(chǎn)物易水解，同時(shí)在用氫火焰離子檢測(cè)器檢測(cè)時(shí)生成的二氧化硅容易附著其電極上對(duì)檢測(cè)器造成污染。本實(shí)驗(yàn)采用廖洪梅等［24］、賀永惠［25］等單糖的乙?；椒ǎ谒芤褐幸?-甲基咪唑?yàn)榇呋瘎?，乙酸酐為衍生化試劑，直接?duì)三氯蔗糖進(jìn)行衍生，并利用GC-MS儀對(duì)生成的糖醇乙酸酯衍生物進(jìn)行定性分析，并利用三氯蔗糖中含有氯原子而采用GC-電子捕獲檢測(cè)器（electron capture detector，ECD）對(duì)其進(jìn)行定量測(cè)定。該方法操作簡(jiǎn)單、干擾少、靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

三氯蔗糖（純度98%） 北京百靈威科技有限公司；三氯甲烷（色譜純） 美國(guó)Mreda Technology公司；亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、乙酸酐（均為分析純）成都長(zhǎng)征化學(xué)試劑公司；1-甲基咪唑（純度99%）成都化夏化學(xué)試劑有限公司；超純水（電阻率：18.25 MΩ·cm）。

1.2 儀器與設(shè)備

UPT-Ⅱ-10T優(yōu)普純水機(jī) 成都超純科技有限公司；CP225D雙量程電子天平 德國(guó)賽多利斯公司；2010plus GC儀（配ECD）、TQ8040 GC-MS聯(lián)用儀日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)品的衍生化及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取適量三氯蔗糖標(biāo)準(zhǔn)品于25 mL容量瓶中，加水溶解，并定容至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度為10 mg/mL的三氯蔗糖儲(chǔ)備液。分別吸取三氯蔗糖儲(chǔ)備液0.02、0.04、0.2、0.4、0.6、1.2 mL于10 mL容量瓶中，各加水稀釋至刻度，即得質(zhì)量濃度為0.02、0..04、0.2、0.4、0.6、1.2 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。分別吸取0.5 mL標(biāo)準(zhǔn)系列溶液于50 mL離心管中，加入冰乙酸100 μL，混勻，再加入0.5 mL 1-甲基咪唑和5 mL乙酸酐，混勻，90 ℃水浴反應(yīng)1 h，冷卻后加入10 mL水，分解乙酸酐終止反應(yīng)，加入2 mL三氯甲烷，充分振搖萃取，靜置5 min后取下層，用適量的無(wú)水硫酸鈉干燥后用0.22 μm微孔膜過(guò)濾后，進(jìn)行GC-ECD分析，以三氯蔗糖的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。其中對(duì)質(zhì)量濃度為0.01 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液同時(shí)進(jìn)行GC-MS分析。

1.3.2 樣品溶液制備與分析

1.3.2.1 亞鐵氰化鉀溶液配制

稱取106 g亞鐵氰化鉀，加水至1 000 mL；乙酸鋅溶液：稱取220 g乙酸鋅，溶于少量水中，加入30 mL冰醋酸，加水稀釋至1 000 mL。

1.3.2.2 樣品分析

準(zhǔn)確稱取混勻后的樣品2.5 g于25 mL容量瓶中，加入15 mL水混勻，超聲20 min提取，用水定容至刻度，搖勻待衍生。對(duì)于含蛋白質(zhì)較多的樣品則加入亞鐵氰化鉀溶液和乙酸鋅溶液各2.5 mL處理提取液，沉淀蛋白質(zhì)。按1.3.1節(jié)法衍生、萃取、過(guò)濾后進(jìn)行GC-ECD分析。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)品和樣品衍生測(cè)定

1.3.3.1 GC條件

色譜柱：Rtx-5石英毛細(xì)柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度300 ℃；檢測(cè)器溫度310℃；升溫程序：180 ℃保持2 min，以20 ℃/min升至280 ℃，保持12 min；柱流量2.08 mL/min；不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣量1.0 μL；溶劑延遲時(shí)間5 min。

1.3.3.2 GC-MS條件

電子電離源；電子能量70 eV；離子源溫度200℃；質(zhì)量掃描范圍m/z 50～700。色譜柱：Rxi-5Sil MS （30 m×0.25 mm，0.25 μm）；進(jìn)樣口、柱溫箱溫度均與GC條件一致。色譜柱流量0.83 mL/min；分流比1∶10；進(jìn)樣量1.0 μL；溶劑延遲時(shí)間5 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 GC-MS聯(lián)用分析

圖1 T OSP A的 GC-M S碎片離子圖譜Fig.1 GC-MS analysis of TOSPA

從圖1可以看到，沒(méi)有出現(xiàn)4，1′，6′-三氯-2，3，6，3′，4′-五乙?；崽牵?，1′，6′-trichloro-2，3，6，3′，4′-sucrose pentaacetate，TOSPA）的分子離子峰（m/z 607），這是由于電子電離源能量為70 eV，遠(yuǎn)高于普通化學(xué)鍵的鍵能，容易產(chǎn)生碎片離子，加之目標(biāo)物本身具有多碳數(shù)、多支鏈的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，導(dǎo)致分子離子峰的穩(wěn)定性下降，最終沒(méi)有分子離子峰的出現(xiàn)，但其糖苷鍵在電子轟擊下斷裂產(chǎn)生了2 個(gè)較大的碎片離子m/z 283、307，以及分離一個(gè)乙酰酯基后得到的碎片離子m/z 223、347。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法獲得的三氯蔗糖衍生物為T(mén)OSPA。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

在選定的色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，以峰面積對(duì)三氯蔗糖標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度作校正曲線。配制標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度分別為0.02、0.04、0.2、0.4、0.6、1.2 mg/mL，其線性方程為y=3 970 876x+69 602，R=0.999 4，其標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖如圖2A所示。將按1.3.2節(jié)前處理的加標(biāo)樣品稀釋至含三氯蔗糖0.015 mg/mL，再按1.3.3.1節(jié)色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以3 倍信噪比計(jì)算該方法的檢出限為0.23 mg/kg。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法在0.02～1.2 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，檢出限較低，能滿足飲料中三氯蔗糖含量測(cè)定的要求。2.3 加標(biāo)回收率和精密度

圖2 三氯蔗糖對(duì)照品 （ A）、陰性樣品（ B）和陰性加標(biāo)樣品 （ C）的色譜圖Fig.2 Chromatograms of sucralose standard， negative sample and spiked negative sample

在陰性果蔬飲料樣品中分別添加低、中、高3 個(gè)水平的工作溶液，按照上述衍生和色譜條件進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)水平重復(fù)6 次，色譜圖見(jiàn)圖2B、C?；厥章式Y(jié)果見(jiàn)表1，平均回收率為90.0%～94.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviations，RSD）為0.6%～2.5%，證實(shí)該方法的準(zhǔn)確度與精密度都較高，滿足測(cè)定要求。

表1 陰性樣品的加標(biāo)回收率和RSD（n=6）Table 1 Spiked recoveries and RSDs of negatives ample（n= 6）

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)針對(duì)飲料中三氯蔗糖建立了一種衍生、GCECD檢測(cè)方法。利用1-甲基咪唑催化，在水溶液中直接對(duì)三氯蔗糖進(jìn)行衍生，用GC-MS對(duì)生成的糖醇乙酸酯衍生物進(jìn)行分析，確定其衍生物為T(mén)OSPA，用GC-ECD對(duì)其進(jìn)行定量測(cè)定。在0.02～1.2 mg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性響應(yīng)（R=0.999 4），方法檢出限為0.23 mg/kg，添加0.25、0.5、1.0 mg/kg三個(gè)水平條件下的平均回收率在90.0%～94.5%之間，RSD在0.6%～2.5%之間。該方法具有操作簡(jiǎn)單、干擾少、靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確等特點(diǎn)，適用于飲料中三氯蔗糖含量的測(cè)定。

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Determination of Sucralose in Drinks by Gas Chromatography with Electron Capture Detector （GC-ECD） after Derivatization with Acetic Anhydride

HUANG Zhiyong， CHEN Yan， FENG Hui， LIU Chao， JING Zan
（Leshan Institute for Food and Drug Control， Leshan 614000， China）

A gas chromatographic （GC） method with an electron capture detector （ECD） after acetylation was developed for the determination of sucralose in drinks.Samples were diluted with water and then derivatized with acetic anhydride in the presence of 1-methylimidazole as a catalyst.Qualitative and quantitative analyses of the derivatives were achieved by GC-MS and GC-ECD， respectively.The results showed that the target derivative was 4，1′，6′-trichloro-2，3，6，3′，4′-sucrose pentaacetate （TOSPA）.The calibration curve for the analyte showed good linearity in the range of 0.02-1.2 mg/mL （R = 0.999 4）.The limit of detection （LOD） for sucralose was 0.23 mg/kg， and the recoveries obtained by standard addition method were between 90.0% and 94.5%， with relative standard deviations （RSD， n = 6） between 0.6% and 2.5%.This method provides the advantages of low LOD， high sensitivity， less disturbance， good linearity， high accuracy and simple operation.Thus， it can be applied in sucralose analysis in drinks.

sucralose； derivatization with acetic anhydride； gas chromatography-electron capture detector （GC-ECD）； gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS）

10.7506/spkx1002-6630-201614037

O657

A

1002-6630（2016）14-0203-04

黃志勇， 陳艷， 馮慧， 等.乙酸酐衍生GC-ECD法測(cè)定飲料中三氯蔗糖含量［J］.食品科學(xué)， 2016， 37（14）: 203-206.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201614037. http://www.spkx.net.cn

HUANG Zhiyong， CHEN Yan， FENG Hui， et al.Determination of sucralose in drinks by gas chromatography with electron capture detector （GC-ECD） after derivatization with acetic anhydride［J］.Food Science， 2016， 37（14）: 203-206.（in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201614037. http://www.spkx.net.cn

2015-10-25

黃志勇（1986—），男，碩士，研究方向?yàn)閮x器分析與食品質(zhì)量控制。E-mail：huangzhy86@163.com