高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測保健酒中非法添加物艾地那非

張麗媛，顏琳琦，周明昊，吳鴛鴦（浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院，浙江 杭州 310000）

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高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測保健酒中非法添加物艾地那非

張麗媛，顏琳琦，周明昊，吳鴛鴦
（浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院，浙江 杭州 310000）

目的：采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）法，建立保健酒中非法添加物艾地那非的檢測方法。方法：使用Agilent RRDH Eclipse-plus C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm），以0.1%甲酸-乙腈溶液為流動相A、0.1%乙酸-20 mmol/L乙酸銨溶液為流動相B進(jìn)行梯度洗脫。通過HPLC-MS/MS系統(tǒng)中全掃描模式對艾地那非進(jìn)行定性分析，多反應(yīng)監(jiān)測模式對艾地那非進(jìn)行定量分析。結(jié)果：該方法線性r2大于0.99，精密度相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于3%，不同質(zhì)量濃度樣品平均回收率為97.31%～100.66%，檢出限為0.6 ng/mL，定量限為1.6 ng/mL。結(jié)論：此方法測定準(zhǔn)確、靈敏度高、分離度高，可用于保健酒中非法添加物艾地那非的篩選和檢測。

艾地那非；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法；保健酒；檢測方法；非法添加

艾地那非是5型磷酸二酯酶（phosphodieseterase 5，PDE5）抑制劑枸櫞酸西地那非的新型衍生物［1］，枸櫞酸西地那非、伐地那非和他達(dá)拉非是美國食品藥品監(jiān)督管理局于1998年批準(zhǔn)，用于治療男性勃起功能障礙的藥物［2］。近年來，一些不法廠家將其加入到補(bǔ)腎壯陽類中成藥和保健食品中，利用其用量少、效果快的特點(diǎn)，謀取高額利潤。此類藥物，對具有心血管系統(tǒng)疾病和糖尿病的患者有嚴(yán)重不良反應(yīng)，消費(fèi)者長期服用此類保健品將對身體產(chǎn)生嚴(yán)重危害［3-7］。2015年7月31日，國家食藥監(jiān)總局在官網(wǎng)通告，有多達(dá)51 家69 種保健酒、配制酒中非法添加了西地那非等化學(xué)物質(zhì)，此消息令外界震驚，也暴露了保健酒行業(yè)的亂象［8］。

近年來，隨著國家查處力度的不斷增大，一些不法商家轉(zhuǎn)而向保健食品中添加PDE5型抑制劑的衍生物，以期利用更隱蔽的方法獲得高額利潤，危害人民健康［9］。對于PDE5型抑制劑及其衍生物的檢測多采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法，而HPLC-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）法，無論在選擇性、靈敏度及分子質(zhì)量的測定方面均優(yōu)于HPLC法［10-16］。目前，國家食品藥品監(jiān)督管理局已發(fā)布了補(bǔ)腎壯陽類中成藥中11 種PDE5型抑制劑及其衍生物的檢測方法（國家食品藥品監(jiān)督管理局藥品檢驗(yàn)補(bǔ)充檢驗(yàn)方法和檢驗(yàn)項(xiàng)目批準(zhǔn)件（批準(zhǔn)件編號：2009030））。但在日常監(jiān)督檢測中，發(fā)現(xiàn)某廠家生產(chǎn)的3 批保健酒中非法添加了新型的衍生物——艾地那非。故采用HPLC-MS/MS法，對保健酒中非法添加的化學(xué)藥物艾地那非進(jìn)行方法學(xué)研究，以期建立快速有效的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

艾地那非（純度9 9.9%）、紅地那非（純度99.1%）、偽伐地那非（純度99.5%）、羥基豪莫西地那非（純度98.8%）、那莫西地那非（純度99.7%）、豪莫西地那非（純度98.7%）、伐地那非（純度99.5%）、氨基他達(dá)拉非（純度99.9%）、那紅地那非（純度99.9%）、硫代艾地那非（純度99.7%） 加拿大TLC Pharmachem公司；西地那非（純度99.3%）、他達(dá)拉非（純度99.3%） 中國食品藥品檢定研究院；乙腈（色譜純） 德國Merck公司；乙酸銨、甲酸（均為色譜純） 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1290-6490QQQ HPLC-MS/MS聯(lián)用儀（配有電噴霧離子源及MassHunter數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)） 美國Agilent公司；MS205DU電子天平 瑞士梅特勒公司；KQ-300DB超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；Genpure UV/UF超純水儀 美國熱電公司。

1.3 方法

參考國家食品藥品監(jiān)督管理局發(fā)布的（國家食品藥品監(jiān)督管理局藥品檢驗(yàn)補(bǔ)充檢驗(yàn)方法和檢驗(yàn)項(xiàng)目批準(zhǔn)件（批準(zhǔn)件編號：2009030））對補(bǔ)腎壯陽類中成藥中11 種PDE5型抑制劑及其衍生物的檢測方法，優(yōu)化并確定對新發(fā)現(xiàn)PDE5型抑制劑衍生物艾地那非檢測的條件。

1.3.1 HPLC條件

A g i l e n t R R D H E c l i p s e-p l u s C1 8色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流速0.2 mL/min；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量1 μL；流動相A：0.1%甲酸-乙腈溶液；流動相B：0.1%乙酸-20 mmol/L乙酸銨溶液；梯度洗脫程序：0～7 min，30% A，70% B；7～12.5 min，30%～85% A，70%～15% B；12.5～13 min，85% A，15% B；13～13.5 min，85%～30% A，15%～70% B；13.5～15 min，30% A，70% B。

1.3.2 MS條件

離子化方式：電噴霧離子源；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：全掃描一級質(zhì)譜，選擇離子全掃描二級質(zhì)譜方式定性檢測；一級質(zhì)譜掃描范圍為m/z 100～1 000；二級質(zhì)譜掃描范圍為m/z 50～550；多反應(yīng)監(jiān)測模式定量檢測；毛細(xì)管溫度350 ℃；鞘氣流速11 L/min；離子源電壓4 kV。

1.3.3 對照品溶液制備

精密稱取艾地那非對照品適量，加乙腈配制成每1 mL含1 μg、100 ng的溶液，分別作為一級質(zhì)譜掃描及選擇離子全掃描二級質(zhì)譜溶液。

1.3.4 樣品溶液制備

取待測保健酒樣品過0.22 μm有機(jī)濾膜，取續(xù)濾液置進(jìn)樣瓶中，待測。用乙腈稀釋，并進(jìn)行一、二級質(zhì)譜掃描。待測保健酒樣品均采自浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院日常抽檢。

2 結(jié)果與分析

2.1 艾地那非一、二級質(zhì)譜掃描圖譜

由圖1可知，艾地那非［M+H+］m/z如下：一級質(zhì)譜母離子為489，二級質(zhì)譜分子離子碎片為377、311、283、113、99、71。在二級質(zhì)譜掃描模式下對艾地那非碰撞能進(jìn)行優(yōu)化，選擇碰撞能量為43 cid。

圖1 艾地那非一級（A）、二級（B）質(zhì)譜掃描圖Fig.1 MS （A） and MS2 （B） spectra of aildenafil

艾地那非與西地那非衍生物-豪莫西地那非具有相同的分子式和相似的結(jié)構(gòu)式［1，17］，見圖2。在HPLC-MS/ MS系統(tǒng)下，通過一級質(zhì)譜全掃描發(fā)現(xiàn)艾地那非與豪莫西地那非具有相同的母離子，兩者二級質(zhì)譜掃描圖相似，如圖3所示，且在色譜圖中出峰時間相近。因此，采用HPLC-MS/MS方法檢測保健酒中非法添加艾地那非時，應(yīng)注意各色譜峰的分離度，避免誤判。

圖2 艾地那非（A）、豪莫西地那非（B）結(jié)構(gòu)式Fig.2 Structural formulas of aildenafil （A） and homosildenafi （B）

圖3 豪莫西地那非二級質(zhì)譜掃描圖Fig.3 MS2 spectrum of homosildenafil

2.2 多反應(yīng)監(jiān)測模式下艾地那非的定量分析結(jié)果

選擇艾地那非對照品碎片離子中離子豐度較高的2 個碎片離子283、99，分別作為定性和定量離子，見圖4。采用MassHunter軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

圖4 艾地那非多重反應(yīng)監(jiān)測質(zhì)譜圖Fig.4 Mass spectrum of aildenafil in MRM mode

2.2.1 線性關(guān)系

精密稱取艾地那非對照品適量，加乙腈配制成質(zhì)量濃度分別為1.61、3.22、8.05、16.10、32.20 ng/mL的梯度對照品，測定峰面積［18］。以質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，計(jì)算得回歸方程Y=709.69X+238.49，r2=0.999 5?？梢?，艾地那非在質(zhì)量濃度為1.61～32.20 ng/mL范圍內(nèi)線性良好。

2.2.2 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

分別精密吸取質(zhì)量濃度為1.61、8.05、32.20 ng/mL的艾地那非對照品溶液作為低、中、高質(zhì)量濃度溶液，各重復(fù)進(jìn)樣3 次，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）小于3.0%，表明儀器精密度良好［19-20］。結(jié)果見表1。

表1 艾地那非在不同質(zhì)量濃度條件下的精密度Table 1 Precisi on （RSD） for 3 replicated eterm in ati on s of aildena fila td ifferentc on centrati on levels

2.2.3 檢出限與定量限測定結(jié)果

采用空白樣品加標(biāo)準(zhǔn)溶液的方法測定［18-22］。取某廠生產(chǎn)的在上述檢測條件下未檢出艾地那非的保健酒溶液2 份，分別加入適量對照品溶液。以3 倍信噪比為檢出限最低響應(yīng)值，計(jì)算檢出限為0.6 ng/mL；以10 倍信噪比為定量限最低響應(yīng)值，計(jì)算定量限為1.6 ng/mL。

2.2.4 回收率測定結(jié)果

表2 艾地那非在不同質(zhì)量濃度條件下的回收率Table 2 Recoveries of aildenafilspiked at different c on centrati on levels

采用樣品加標(biāo)回收法測定［20，22］。取上述檢測條件下陰性保健酒溶液9 份，分別加入適量對照品溶液，使加標(biāo)質(zhì)量濃度分別達(dá)到定量限質(zhì)量濃度、2 倍定量限質(zhì)量濃度、10 倍定量限質(zhì)量濃度3 個添加水平，按1.3.3節(jié)供試品溶液制備，每個添加水平平行制備3 份樣，計(jì)算回收率，如表2所示，不同質(zhì)量濃度水平平均回收率為97.31%～100.66%，RSD小于3%。

2.2.5 專屬性

在3 批檢出艾地那非的保健酒中，按1.3節(jié)方法測定，樣品中出現(xiàn)與對照品保留時間和質(zhì)譜圖一致的色譜峰［18］。同條件下艾地那非與11 種對照品能有效分離，如圖5所示。

圖5 12 種對照品色譜圖Fig.5 Chromatogram of mixture of12 reference substances

2.2.6 樣品定量測定結(jié)果

按照上述方法對10 批保健酒樣品進(jìn)行確證定量，檢測出3 批含艾地那非的陽性樣品，含量分別為1.00、0.83、0.91 mg/kg，如圖6所示。

圖6 陽性樣品色譜圖（A）、多重反應(yīng)監(jiān)測質(zhì)譜圖（B）Fig.6 Chromatogram of positive samples （A） and MRM spectrum （B）

3 結(jié) 論

西地那非等化學(xué)藥物為可溶于乙醇和水的白色或類白色結(jié)晶粉末［23］，故易溶解于保健酒中。經(jīng)過文獻(xiàn)［24］檢索發(fā)現(xiàn)，艾地那非為西地那非的衍生物。故參照國家食品藥品監(jiān)督管理局藥品檢驗(yàn)補(bǔ)充檢驗(yàn)方法和檢驗(yàn)項(xiàng)目批準(zhǔn)件（批準(zhǔn)件編號：2009030）檢測方法，采用直接進(jìn)樣法可有效檢測出保健酒中非法添加的化學(xué)藥物。本實(shí)驗(yàn)中涉及到的保健酒中非法添加的化學(xué)藥品艾地那非是日常監(jiān)督樣品中的“異常圖譜”，屬于意外發(fā)現(xiàn)。參照上述方法對保健酒中添加的化學(xué)藥物艾地那非進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證表明：該方法可方便、快速、準(zhǔn)確的對保健酒中非法添加的化學(xué)藥品艾地那非進(jìn)行定性、定量檢測。且可以在同一系統(tǒng)條件下將12 種化學(xué)藥品成分有效分離，提高了工作效率。

西地那非等PDE5抑制劑作為臨床治療陰莖勃起功能障礙的一線藥物，且主要為進(jìn)口藥物［25-26］，目前有針對的檢測方法。但艾地那非是新型PDE5抑制劑，未廣泛應(yīng)用且檢測方法未成熟，故在監(jiān)管上存在一定程度的漏洞，讓不法商家有機(jī)可乘。通過建立保健酒中非法添加物艾地那非的檢測方法，來進(jìn)一步擴(kuò)大檢測范圍，更有效的規(guī)范市場，使行業(yè)更加健康有序的發(fā)展。

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Determination of Aildenafil Illegally Added in Health Wine by High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

ZHANG Liyuan， YAN Linqi， ZHOU Minghao， WU Yuanyang
（Zhejiang Institute for Food and Drug Control， Hangzhou 310000， China）

Objective: To develop a detection method for aildenafil adulterated in health wine using high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （HPLC-MS/MS）.Methods: The chromatography was performed using an Agilent RRDH Eclipse plus C18column （2.1 mm × 100 mm， 1.8 μm）， with a mobile phase consisting of acetonitrile-0.1% formic acid （phase A） and 0.1% acetic acid-20 mmol/L ammonium acetate （phase B） by gradient elution.Qualitative analysis of aildenafil was conducted under full-scan model， and quantitative analysis in the multiple reaction monitoring （MRM） model.Results: The method was linear with a correlation coefficient （r2） ＞ 0.99， and its precision， expressed as RSD， was ＜ 3%.The recoveries of aildenafil at different spiked concentrations ranged from 97.31% to 100.66%.The limit of detection （LOD） was 0.6 ng/mL and the limit of quantitation （LOQ） was 1.6 ng/mL.Conclusion: This method is fast and accurate with a high sensitivity and a high degree of separation.It can be used for the screening and detection of aildenafil illegally added in health wine.

aildenafil； high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （HPLC-MS/MS）； health wine；detection method； illegally added

10.7506/spkx1002-6630-201614036

TS207.3

A

1002-6630（2016）14-0198-05

張麗媛， 顏琳琦， 周明昊， 等.高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測保健酒中非法添加物艾地那非［J］.食品科學(xué)， 2016， 37（14）: 198-202.DOI:10.7506/spkx1002-6630-201614036. http://www.spkx.net.cn

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2015-11-30

張麗媛（1985—），女，助理工程師，碩士，研究方向?yàn)楸＝∈称坊瘖y品檢測。E-mail：xiaojie1119ok@163.com