尾巨桉3個(gè)無性系繼代增殖培養(yǎng)研究

石 前， 李飛宇， 梁秀莉， 鄧冬麗， 李麗芳， 蘭 俊*

(1. 廣西壯族自治區(qū)國有東門林場，廣西扶綏 532108；2. 中種國際種子有限公司，北京100028)

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尾巨桉3個(gè)無性系繼代增殖培養(yǎng)研究

石 前1， 李飛宇2， 梁秀莉1， 鄧冬麗1， 李麗芳1， 蘭 俊1*

(1. 廣西壯族自治區(qū)國有東門林場，廣西扶綏 532108；2. 中種國際種子有限公司，北京100028)

摘要[目的]研究尾巨桉3個(gè)無性系繼代增殖培養(yǎng)技術(shù)，為尾巨桉苗木快速繁殖提供理論依據(jù)。[方法]以尾巨桉3個(gè)無性系DH32-26、DH32-29、DH32-28為試驗(yàn)材料，篩選最佳的植物生長調(diào)節(jié)劑組合、凝固劑、暗培養(yǎng)天數(shù)和培養(yǎng)瓶，達(dá)到較高的繼代增殖系數(shù)。[結(jié)果] 3個(gè)無性系繼代增殖培養(yǎng)時(shí)最適的植物生長調(diào)節(jié)劑組合為：DH32-26(6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L)；DH32-28(6-BA 0.4 mg/L+NAA 0.2 mg/L)；DH32-29(6-BA 0.3 mg/L+NAA0.2 mg/L)；DH32-26的繼代增殖系數(shù)在凝固劑為卡拉膠和瓊脂的培養(yǎng)基中差異不大，DH32-28、DH32-29的繼代增殖系數(shù)在以卡拉膠作為凝固劑的培養(yǎng)基中比在以瓊脂作為凝固劑的培養(yǎng)基中有所提高，在生根培養(yǎng)過程中，以卡拉膠作為凝固劑的培養(yǎng)基遠(yuǎn)比用瓊脂作為凝固劑的培養(yǎng)基誘導(dǎo)出根好；繼代增殖初期DH32-26、DH32-28需用黑布進(jìn)行全暗遮光5～10 d，而DH32-29不需全暗培養(yǎng)；用廣口瓶繼代增殖培養(yǎng)DH32-29可降低苗木生產(chǎn)成本，但DH32-26、DH32-28不適合用廣口瓶進(jìn)行繼代增殖培養(yǎng)。[結(jié)論]要提高無性系繼代增殖系數(shù)，需要選取最優(yōu)的植物生長調(diào)節(jié)劑組合、凝固劑、暗培養(yǎng)天數(shù)和培養(yǎng)瓶。

關(guān)鍵詞尾巨桉；無性系；繼代增殖

目前在造林中推廣應(yīng)用較多的無性系是尾巨桉系列的優(yōu)良無性系，已應(yīng)用于造林的尾巨桉優(yōu)良無性系主要有DH32-29、DH32-28、DH32-26、DH32-27、DH32-13等。其中DH32-26在速豐林高產(chǎn)競賽評(píng)比活動(dòng)中，年均蓄積生長量優(yōu)于其他品種，被評(píng)為最優(yōu)品種。根據(jù)造林試驗(yàn)效果反饋，DH32-29和DH32-28也獲得了較好的評(píng)價(jià)。從選育到推廣造林，尾巨桉無性系在廣西和華南地區(qū)的桉樹造林中占據(jù)重要地位，為林漿紙板一體化的發(fā)展做出巨大貢獻(xiàn)，產(chǎn)生了巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。

在生產(chǎn)中，單一無性系造林易受病蟲的襲擊，給造林戶造成直接經(jīng)濟(jì)損失，采用多種無性系造林對(duì)林分的穩(wěn)定性有一定的促進(jìn)作用。目前在尾巨桉組培快繁技術(shù)方面已有一定的研究，但對(duì)尾巨桉不同無性系在組織培養(yǎng)方面的差異性研究還較少。由于各無性系的遺傳物質(zhì)不同，所以在外植體誘導(dǎo)、繼代增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)、移栽方面有不同的要求。筆者以尾巨桉3個(gè)優(yōu)良無性系(DH32-26、DH32-29、DH32-28)為研究對(duì)象，從繼代增殖培養(yǎng)方面探索桉樹不同無性系在組培技術(shù)上的差異性，以期完善尾巨桉的快繁技術(shù)，為尾巨桉苗木快速繁殖提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)地概況試驗(yàn)地位于崇左市扶綏縣廣西國營東門林場林業(yè)科學(xué)研究所國家良種繁育中心苗圃，107°15′～108°00′E、22°17′～22°30′N，東西長80km、南北寬20km，屬于南亞熱帶地區(qū)，季風(fēng)氣候明顯，年日照時(shí)數(shù)1 634～1 719h，年平均氣溫22 ℃，極端最高氣溫40 ℃，極端最低氣溫-4 ℃，位于十萬大山的雨影區(qū)，雨量偏少，年降雨量1 100～1 300mm，相對(duì)濕度74%～83%。

1.2供試材料尾巨桉3個(gè)無性系DH32-26、DH32-29、DH32-28。

1.3研究方法

1.3.1植物生長調(diào)節(jié)劑組合對(duì)無性系繼代苗增殖的影響。以改良MS為繼代培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基，添加6-BA、NAA形成6 種濃度組合的增殖培養(yǎng)基(表1)。各處理3個(gè)重復(fù)，每重復(fù)5瓶，每瓶接入15叢芽，每叢2～3條芽。將誘導(dǎo)出的無菌材料DH32-26、DH32-28、DH32-29不定芽接種到增殖培養(yǎng)基上培養(yǎng)，20d后觀察各培養(yǎng)基叢生芽分化情況，統(tǒng)計(jì)繼代苗平均苗高、增殖系數(shù)、生長狀況及有效芽苗數(shù)，篩選出適宜的植物生長調(diào)節(jié)劑組合。

表1不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合

Table1Combinationofgrowthregulatorsofdifferentplants

mg/L

1.3.2凝固劑對(duì)無性系繼代苗增殖的影響。研究瓊脂和卡拉膠2種凝固劑對(duì)不同無性系繼代苗增殖的影響，瓊脂用量為4g/L(1 300g/cm2強(qiáng)度)，卡拉膠用量6g/L。將誘導(dǎo)出的無菌材料DH32-26、DH32-28、DH32-29不定芽分別接種到用瓊脂和卡拉膠作為凝固劑的改良MS繼代培養(yǎng)基中，各處理3個(gè)重復(fù)，每重復(fù)5瓶，每瓶接入15叢芽，每叢2～3條芽，接種 20d后統(tǒng)計(jì)繼代苗平均高、增殖系數(shù)、生長狀況。

1.3.3暗培養(yǎng)天數(shù)對(duì)無性系繼代苗增殖的影響。繼代苗接種后，不能直接放在強(qiáng)光下培養(yǎng)，一般要暗培養(yǎng)一段時(shí)間。研究不同暗培養(yǎng)天數(shù)對(duì)不同無性系繼代苗增殖的影響，試驗(yàn)設(shè)4個(gè)處理：黑布覆蓋0 (弱光培養(yǎng)5d)、5、10、15d。各處理3個(gè)重復(fù)，每重復(fù)5瓶，每瓶接入15叢芽，每叢2～3條芽，25d后統(tǒng)計(jì)繼代苗平均高、繼代增殖系數(shù)、繼代苗生長狀況。

1.3.4培養(yǎng)瓶對(duì)無性系繼代苗增殖的影響。采用2種培養(yǎng)瓶，即500mL的三角瓶和250mL的廣口瓶進(jìn)行繼代培養(yǎng)，研究這2種培養(yǎng)瓶對(duì)尾巨桉3種無性系繼代苗增殖的影響。各處理3個(gè)重復(fù)，每重復(fù)5瓶，每瓶接入15叢芽，每叢2～3條芽，20d統(tǒng)計(jì)繼代增殖系數(shù)、平均有效芽數(shù)、繼代苗生長狀況。

2結(jié)果與分析

2.1植物生長調(diào)節(jié)劑組合對(duì)無性系繼代苗增殖的影響植物生長調(diào)節(jié)劑是一種活性物質(zhì)，對(duì)植物生長發(fā)育有調(diào)節(jié)作用。用于繼代增殖培養(yǎng)的是能促進(jìn)芽分化的細(xì)胞分裂素和促生長的生長素，具體運(yùn)用時(shí)要根據(jù)需要來決定兩者的比例。DH32-26在6-BA0.5mg/L+NAA0.2mg/L培養(yǎng)基中葉淡綠，有效芽最多；DH32-28在6-BA0.4mg/L+NAA0.2mg/L培養(yǎng)基中葉色綠，芽密，有效芽最多；DH32-29在6-BA0.3mg/L+NAA0.2mg/L培養(yǎng)基中葉色綠而舒展，芽多而密，有效芽最多(表2)。

表2　植物生長調(diào)節(jié)劑組合對(duì)無性系繼代苗增殖的影響

2.2凝固劑對(duì)無性系繼代苗增殖的影響瓊脂和卡拉膠同為培養(yǎng)材料的支撐物，由于原料不同，其對(duì)繼代苗的增殖率有一定影響。研究3個(gè)無性系在瓊脂和卡拉膠凝固劑中的繼代增殖表現(xiàn)，結(jié)果表明在卡拉膠培養(yǎng)基中，DH32-26、DH32-28、DH32-29這3個(gè)無性系繼代苗高稍高于瓊脂培養(yǎng)基中苗高。DH32-29、DH32-28這2個(gè)無性系在卡拉膠培養(yǎng)基中繼代增殖系數(shù)比瓊脂的高，而DH32-26在卡拉膠培養(yǎng)基中繼代增殖系數(shù)與在瓊脂培養(yǎng)基中差別不大。各無性系在同一種凝固劑中，表現(xiàn)也有所不同，DH32-29繼代增殖系數(shù)最高，其次為DH32-28、DH32-26(表3)。

表3　凝固劑對(duì)無性系繼代苗增殖的影響

2.3暗培養(yǎng)天數(shù)對(duì)無性系繼代苗增殖的影響光照在植物組織培養(yǎng)中是一個(gè)十分重要的因子，在繼代苗增殖初期中，要形成大量的愈傷組織，需進(jìn)行暗培養(yǎng)處理，一般在300～500lx的光照強(qiáng)度下，即放置在一般的暗培養(yǎng)架上弱光培養(yǎng)便可達(dá)到很好的增殖效果，但由于各無性系生理特點(diǎn)不同，這種方式達(dá)不到所需的增殖倍數(shù)，所以采用黑布覆蓋的避光措施，以達(dá)到提高繼代增殖率的目的。在繼代培養(yǎng)的后期，植物對(duì)光的需求加大，避光暗培養(yǎng)時(shí)間過長會(huì)影響繼代芽苗的質(zhì)量。由表4可知，DH32-26和DH32-28全暗培養(yǎng)時(shí)間以10d內(nèi)為宜，全暗培養(yǎng)時(shí)間過少苗不高，增殖系數(shù)低，過高苗水腫、纖細(xì)，DH32-29不用全暗培養(yǎng)也可達(dá)到好的效果。3個(gè)無性系隨著暗培養(yǎng)時(shí)間的增加，增殖系數(shù)和苗高也增加，但當(dāng)全暗培養(yǎng)時(shí)間超過一定天數(shù)后，會(huì)出現(xiàn)莖纖細(xì)、弱，木質(zhì)化差，苗水腫的現(xiàn)象。

表4　暗培養(yǎng)天數(shù)對(duì)無性系繼代苗增殖的影響

2.4培養(yǎng)瓶對(duì)無性系繼代苗增殖的影響由表5可知，由于三角瓶的底徑大，光線充足，采光更好，接種于三角瓶的繼代苗比接種于廣口瓶的繼代苗增殖系數(shù)高。由于空間不足，接種于廣口瓶的繼代苗有效芽較少。廣口瓶接受光照的面積少，對(duì)DH32-26、DH32-28這2個(gè)無性系來說其繼代苗需要較強(qiáng)光照，用廣口瓶作為繼代培養(yǎng)瓶，分化增殖不理想，用作生根有效芽少，而三角瓶比較適合它們所需的光照，用作生根有效芽多；對(duì)DH32-29來說廣口瓶作繼代培養(yǎng)瓶的光照已經(jīng)滿足了它的生長，不論是用三角瓶作為繼代培養(yǎng)瓶，還是用廣口瓶作繼代培養(yǎng)瓶都可以。

表5　培養(yǎng)瓶對(duì)無性系繼代苗增殖的影響

3結(jié)論與建議

(1) 該試驗(yàn)通過用6-BA和NAA的不同配比來篩選適合3個(gè)無性系繼代增殖的植物生長調(diào)節(jié)劑配方。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果可得出，DH32-26繼代增殖培養(yǎng)適用的植物生長調(diào)節(jié)劑組合為6-BA0.5mg/L+NAA0.2mg/L；DH32-28繼代增殖培養(yǎng)適用的植物生長調(diào)節(jié)劑組合為6-BA0.4mg/L+NAA0.2mg/L；DH32-29繼代增殖培養(yǎng)適用的植物生長調(diào)節(jié)劑組合為6-BA0.3mg/L+NAA0.2mg/L。繼代培養(yǎng)的目的就是將誘導(dǎo)產(chǎn)生的芽不斷擴(kuò)繁，使繁殖材料增多來達(dá)到繼代增殖的效果。繼代培養(yǎng)基中，對(duì)芽器官分化起重要作用的是細(xì)胞分裂素，細(xì)胞分裂素要與生長素配合使用，在合適的配比下才能達(dá)到較好的效果[1-2]，過高或者過低都不利于繼代增殖[3]。在專做繼代增殖時(shí)，6-BA與NAA比值增大可提高繼代增殖系數(shù)，但如果比值過大，繼代苗過于細(xì)弱，玻璃化苗的幾率增大。

(2) 為找出適合DH32-26、DH32-28、DH32-29無性系的暗培養(yǎng)方式，該試驗(yàn)做了4個(gè)暗培養(yǎng)時(shí)間處理，試驗(yàn)結(jié)果表明DH32-26、DH32-28這2個(gè)無性系需用黑布覆蓋全暗培養(yǎng)5～10d，苗高和繼代增殖系數(shù)會(huì)有所提高，有效芽增多，DH32-29只需弱光培養(yǎng)就可達(dá)到較高的繼代增殖系數(shù)。桉樹繼代培養(yǎng)中，光照是一個(gè)較重要的環(huán)境因子，桉樹無性系不同，對(duì)環(huán)境條件的要求也不同，繼代增殖初期需要避光培養(yǎng)，長時(shí)間在光線不足的環(huán)境中，植物會(huì)出現(xiàn)玻璃化和徒長現(xiàn)象[4-6]。

(3)在桉樹繼代培養(yǎng)中使用的是固體培養(yǎng)基，瓊脂和卡拉膠屬于凝固劑，用于提取它們的海藻種類不同，表現(xiàn)特性也不同。用瓊脂配制培養(yǎng)基，其凝固性和穩(wěn)定性好，但價(jià)格較貴，用卡拉膠配制的培養(yǎng)基，非常透明，易于觀察瓶內(nèi)的培養(yǎng)材料。該試驗(yàn)用含有這2種凝固劑的培養(yǎng)基接入3種無性系的繁殖材料，進(jìn)一步觀察3種無性系在2種凝固劑培養(yǎng)基中繼代增殖系數(shù)及苗木表現(xiàn)，試驗(yàn)結(jié)果表明DH32-28、DH32-29這2個(gè)無性系的繼代增殖系數(shù)在含卡拉膠凝固劑

的培養(yǎng)基中稍有提高，但在此培養(yǎng)基中繼代苗易老、黃化，當(dāng)放置在溫度較高(超過30℃以上)的高架煉苗時(shí)，培養(yǎng)基會(huì)溶解成水，繼代苗沒有了培養(yǎng)基的支撐，逐漸枯萎?？ɡz會(huì)化為水，變成水培狀，但瓊脂未出現(xiàn)此情況，這現(xiàn)象說明卡拉膠的穩(wěn)定性不如瓊脂。

(4)工廠化育苗是進(jìn)行大規(guī)模、高效率的組培苗生產(chǎn)，不僅對(duì)數(shù)量和質(zhì)量有要求，而且要考慮如何降低生產(chǎn)成本，提高生產(chǎn)和經(jīng)濟(jì)效益。組培生產(chǎn)中用量最多的是培養(yǎng)瓶，如果能在此項(xiàng)尋找到合適的替代品，可以降低成本。目前使用繼代培養(yǎng)的大多是三角瓶，在廣東的很多組培廠使用的是廣口瓶(罐頭瓶)。三角瓶的價(jià)格高，1個(gè)500mL的三角瓶約6元，而廣口瓶價(jià)格低，1個(gè)廣口瓶0.7元，價(jià)格相差8倍左右。在節(jié)約成本的同時(shí)，也要考慮苗木的質(zhì)量，為探求這2種繼代培養(yǎng)瓶對(duì)3種無性系繼代苗生長和增殖的影響，經(jīng)過試驗(yàn)，結(jié)果表明DH32-29在2種繼代培養(yǎng)瓶中，繼代增殖系數(shù)沒有大的變化，以三角瓶為培養(yǎng)瓶的消毒用時(shí)多，工序繁瑣，而用廣口瓶為培養(yǎng)瓶方便操作，速度快，DH32-29對(duì)光照要求不是很嚴(yán)格，可用2種培養(yǎng)瓶進(jìn)行繼代培養(yǎng)，但從成本上來說用廣口瓶作繼代培養(yǎng)瓶比較劃算；DH32-26、DH32-28用廣口瓶作繼代培養(yǎng)瓶時(shí)，繼代增殖有效芽少，光線太弱，而這2個(gè)無性系對(duì)光照的需求較強(qiáng)，用三角瓶作為繼代培養(yǎng)瓶能滿足它們對(duì)光照的需求，因此對(duì)DH32-26和DH32-28這2個(gè)無性系來說，用三角瓶作為繼代培養(yǎng)瓶較為合適。

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作者簡介石前(1982-)，女，湖南衡陽人，工程師，碩士，從事林木良種繁育研究。*通訊作者，高級(jí)工程師，碩士，從事桉樹遺傳改良和無性系開發(fā)研究。

收稿日期2016-05-16

中圖分類號(hào)S 722.8

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611(2016)16-179-04

MultiplicationSubcultureofThreeClonesofEucalyptus urophylla × E. grandis

SHIQian1,LIFei-yu2,LIANGXiu-li1,LANJun1*etal

(1.GuangxiDongmenForestFarm,Fusui,Guangxi532108; 2.ChinaSeedInternationalSeedCo.,Ltd.,Beijing100028)

Abstract[Objective] To research the multiplication subculture technology of three clones of Eucalyptus urophylla × E. grandis, and to provide theoretical foundation for the rapid propagation of E. urophylla × E. grandis seedlings. [Method] With three clones (DH32-26, DH32-29, DH32-28) as the test materials, the optimal combination of regulators was screened, as well as the coagulator, dark culture days and culture flask. Thus, multiplication coefficient was relatively high. [Result] The optimal combination of plant growth regulators for subculture of three clones were DH32-26(6-BA 0.5 mg/L + NAA 0.2 mg/L), DH32-28(6-BA 0.4 mg/L + NAA 0.2 mg/L) and DH32-29(6-BA 0.3 mg/L + NAA 0.2 mg/L). DH32-26 multiplication coefficient showed no significant differences in culture medium with carrageenan and agar as the coagulators. Subculture multiplication coefficients of DH32-28 and DH32-29 in culture medium with carrageenan as the coagulator was higher than those with agar as the coagulator. During the process of rooting, culture medium with carrageenan as the coagulator had far better rooting than that with agar as the coagulator. In the initial stage of DH32-26 and DH32-28 subculture, black cloth was used for shading for 5-10 d; while DH32-29 did not need all dark culture. DH32-29 subculture in wild-mouth bottle reduced the production cost of seedlings; but DH32-26 and DH32-28 were not suitable for the subculture in wild-mouth bottle. [Conclusion] To enhance the multiplication coefficient of clones, we should select the optimal regulators, coagulator, dark culture days and culture flask.

Key wordsEucalyptus urophylla × E. grandis; Clones; Multiplication