鋅指結(jié)構(gòu)Osterix對骨骼發(fā)育影響的研究進展

姜宇 牛鵬飛 徐又佳*

1. 無錫市第二人民醫(yī)院骨科，無錫 214002 2. 蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院骨科， 蘇州 215000

骨骼的發(fā)育分為內(nèi)骨骼發(fā)育和外骨骼發(fā)育，外骨骼發(fā)育發(fā)生在節(jié)肢動物、軟體動物和一些昆蟲中，它們的骨骼是一層保護內(nèi)部器官的殼。脊椎動物的發(fā)育屬于內(nèi)骨骼發(fā)育。間充質(zhì)細胞接受到分子信號傳遞的模式信息遷移至特定的骨化位置，隨后間充質(zhì)細胞在骨化位置緊密濃縮形成骨軟骨的原基，而這一現(xiàn)象被稱為骨骼的形態(tài)發(fā)生，它決定了骨骼的類型及其發(fā)育的時空順序。原基會分泌一些Hedgehog，Wnt和FGF家族和TGF-β亞家族的多肽及Pax，Hox，homeodomain-containing，bHLH，F(xiàn)orkhead家族的轉(zhuǎn)錄因子，用于調(diào)控和起始早期骨骼相關(guān)基因的表達[1-3]。所以最初的脊椎動物外骨骼的發(fā)育受多種分子信號的調(diào)控[4, 5]。這些經(jīng)濃縮的骨軟骨的原基一部分分離為表達高水平的Sox9a的軟骨細胞，另一部分分離為表達高水平Runx2和低水平Col1a1及Akp的前體成骨細胞[6]。這些也表明無論是軟骨細胞還是成骨細胞都起源共同的前體[7]。所有的脊椎動物都具有兩種硬骨成骨方式：一種是膜內(nèi)骨化，即間充質(zhì)細胞直接分化為成骨細胞并生成骨骼,這種方式常見于顱骨的形成；另外一種被稱為軟骨內(nèi)骨化，間充質(zhì)細胞首先分化為軟骨細胞,軟骨細胞分泌并形成軟骨模板,隨后軟骨模板被含有成骨細胞和破骨細胞的骨骼取代[8]。

軟骨細胞分化為硬骨分為兩個階段，首先沉積在細胞外基質(zhì)上的軟骨細胞開始增殖，但是在絕大多情況下，這些增殖的軟骨細胞因變得過度肥大而最終凋亡，然后存在于軟骨細胞周圍的一些間充質(zhì)細胞和血管及破骨細胞遷移到這些過度肥大的軟骨細胞所在的位置，接著在硬骨特異性的基質(zhì)上分化為成骨細胞，從而代替已經(jīng)退化的軟骨細胞基質(zhì)。對于軟骨細胞分化的這兩個階段，Sox家族的三個轉(zhuǎn)錄因子Sox9，L-Sox5和Sox6是必不可少的，它們調(diào)控了軟骨細胞系的分化方向[9, 10]。非常有趣的是屬于膜內(nèi)骨化的成骨細胞的分化跟屬于軟骨內(nèi)骨化的成骨細胞的分化是同步的，這也暗示了兩種骨化方式具有時序控制的同步性。

為了研究骨骼發(fā)育的各個過程，一些涉及分化過程中的細胞系被創(chuàng)立，例如分化中的成肌細胞系[11]，脂肪細胞系[12]及軟骨細胞系，通過這些細胞系來研究骨骼發(fā)育發(fā)現(xiàn)不同的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控著不同的分化過程。如轉(zhuǎn)錄因子Runx2/Cbfa1是一種屬于Runt家族的多肽，它在多功能間充質(zhì)細胞分化為前體成骨細胞的過程中扮演了必不可少的角色。在Runx2/Cbfa1突變的小鼠中，分別屬于軟骨內(nèi)骨化和膜內(nèi)骨化的成骨細胞的分化停止了[13, 14]。此外在屬于軟骨內(nèi)骨化中過度肥大的軟骨細胞的分化過程中，Runx2/Cbfa1也起著正向調(diào)控的角色[15-17]。另外一種多肽Indian hedgehog (Ihh)是分泌蛋白Hedgehog家族中的一員，對于軟骨內(nèi)成骨是十分必要的，但是對于膜內(nèi)成骨并沒有多大的作用[18]。當(dāng)然在過程中，除了Runx2/Cbfa1，鋅指結(jié)構(gòu)Osterix基因作為重要的成骨細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子越來越被人們重視。

1 轉(zhuǎn)錄因子Osterix的發(fā)現(xiàn)及基因的功能

在2002年，Nakashima 等人通過差別雜交的方法在C2C12細胞中首次克隆了Osterix的cDNA[19]，BMP2通過誘導(dǎo)一些成骨細胞相關(guān)基因的表達來引起C2C12細胞分化為成骨細胞。作者分析了Osterix的cDNA的分子特性發(fā)現(xiàn)：Osterix的N端包含一個富含脯氨酸的激活域，氨基酸序列為1-289， C端包含三個C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)型的DNA綁定區(qū)域。在Osterix的細胞轉(zhuǎn)染實驗中發(fā)現(xiàn)：Osterix的1-172的氨基酸序列對于其的轉(zhuǎn)錄激活作用是不可或缺的。在小鼠的胚胎發(fā)育過程中，Osterix于13.5天的胚胎中在頭骨及長骨的軟骨膜周圍開始表達，并于15.5天的胚胎中在所有的骨原件中高表達，Osterix也在過度肥大的軟骨細胞及其前體中表達，但是表達水平較低[19]。

在Osterix突變的小鼠胚胎中，盡管Runx2的表達是正常的，但成骨細胞的標(biāo)記基因并不表達或者是低表達，如Col1a1它在野生型小鼠的間充質(zhì)細胞是高表達的，但是在Osterix突變體中表達顯著減少，而包括Osteonectin, Osteopontin和Bonesialo protein等其它的成骨細胞標(biāo)記基因的表達幾乎檢測不到，本應(yīng)在15.5天胚胎的成骨細胞中正常表達的Osteocalcin基因，在Osterix突變體中也檢測不到。在Osterix突變的胚胎和長骨中，Runx2的在軟骨成骨的區(qū)域及膜內(nèi)成骨的區(qū)域正常表達，但是在Runx2突變的小鼠胚胎中，Osterix明顯不表達，這些都表明Runx2是調(diào)節(jié)Osterix表達的上游基因。同時也顯示出Osterix通過激活成骨細胞中基因的表達來引起Runx2調(diào)控的成骨細胞前體分化為成骨細胞[19]。

2 Osterix對小鼠中骨骼的發(fā)育及成骨細胞影響的研究

在Osterix突變的小鼠胚胎中，雖然沒有形成硬骨，但是軟骨細胞的分化及軟骨的形成都沒有受到影響，在Runx2正常表達而Osterix沒有表達的成骨細胞中，軟骨特異性表達的基因Sox9和Col2a1都是正常表達的，且這些細胞獲得了分化為軟骨細胞的命運[19]。這些結(jié)果讓我們推測：在前體成骨細胞中Osterix可能抑制了軟骨細胞的分化。這些推測的依據(jù)是：Runx2在早期形成軟骨前體的間充質(zhì)細胞中開始表達，這個時候Sox9高表達，隨著Osterix開始表達，Runx2表達的細胞離開成骨細胞的前體，這個時候Sox9的表達下調(diào)，這些結(jié)果都暗示著Sox9和Osterix的表達是相互排斥的。當(dāng)表達Runx2/Osterix的細胞完全分化為成熟的具有功能性的成骨細胞后，Sox9就不再表達。先于Osterix表達的Runx2表達的前體存在于軟骨形成細胞系中，最后也并沒有分化為成骨細胞的前體。Kaback對Osterix時空性表達的研究顯示：Osterix表達量的增加跟成骨細胞分化的起始是同時發(fā)生的[20]，而在形成軟骨及軟骨內(nèi)成骨后，Osterix的mRNA水平仍然很高。所以這些研究暗示Osterix有兩種功能：一是抑制軟骨細胞形成。二是促進成骨細胞分化(圖1)[6]。

同時Osterix對成年小鼠骨形成及相關(guān)成骨細胞基因的表達也是必不可少的。Zhou[20]的研究證明：在成年小鼠中通過LoxP/inducible Cre使Osterix失活，導(dǎo)致了多種骨骼缺陷的表型，如新的骨骼無法形成、在生長板下非正常的軟骨積累以及骨細胞成熟和功能的缺陷等，同時除了成骨細胞基因發(fā)生下調(diào)以外，一些骨細胞特異性的marker基因如Sost, Dkk1, Dmp1, Phe等都發(fā)生了下調(diào)。這些結(jié)果表明：Osterix在骨基質(zhì)代替軟骨基質(zhì)的重吸收中扮演了重要角色[21]。Osterix的這種新作用在Nishimura的研究中進一步被說明，Nishimura發(fā)現(xiàn)：在軟骨內(nèi)成骨的過程中，Osterix在生長板的過度肥大軟骨細胞中直接激活了MMP-13的表達，從而影響軟骨基質(zhì)的鈣化過程，同時還發(fā)現(xiàn)在小鼠中無論Osterix被條件性的敲除還是全部敲除，都不會使MMP-13不表達，也不會阻止過度肥大的軟骨細胞骨化[22]。在胚胎發(fā)育階段運用2.3kbCol1a1-Cre特異性的使成骨細胞中的Osterix失活，但是在出生的小鼠中并沒有觀察到明顯的骨骼缺陷，當(dāng)這些突變的小鼠存活到8周或者更大時發(fā)現(xiàn)：這些突變小鼠不僅骨小梁及腰椎的骨量減少，同時骨小梁的厚度及數(shù)量也在減少，這些表型非常類似于人類中骨量減少的骨骼缺陷表型[23]。當(dāng)我們用同樣的方法在成年小鼠中使Osterix失活時發(fā)現(xiàn)：成年小鼠的骨骼展現(xiàn)出的表型為成骨細胞基因的表達減少、分化和功能性的成骨細胞減少及少量的骨質(zhì)疏松[24]。對不同時間段Osterix失活對骨骼發(fā)育影響的研究表明：在成年小鼠中，Osterix作為一個合成代謝調(diào)節(jié)器支持了成年小鼠的骨穩(wěn)態(tài)并扮演了不可或缺的作用。

Osterix失活的小鼠骨骼的發(fā)育被抑制了，但是在用2.3kb Col1a1啟動子構(gòu)建的Osterix過表達的轉(zhuǎn)基因小鼠中發(fā)現(xiàn)骨量減少、成骨細胞基因尤其是Osteonectin表達減少。并且在這種轉(zhuǎn)基因小鼠中，成骨細胞不再分化從而造成了大量未成熟成骨細胞的積累。這些結(jié)果表明：在成年小鼠中，適當(dāng)劑量的Osterix對于成骨細胞的分化及骨形成是必不可少的(圖1)[25]。

牙齒形成與骨骼發(fā)育的過程十分相似，首先牙齒的間充質(zhì)細胞分化為成牙質(zhì)細胞，在牙質(zhì)形成過程中，成牙質(zhì)細胞會產(chǎn)生并分泌膠原的或是非膠原的基質(zhì)蛋白。Dsp(Dentin sialo phospho)蛋白是非膠原的牙質(zhì)基質(zhì)蛋白中主要的成分之一，它對于牙質(zhì)形成十分必要。小鼠的遺傳學(xué)和生物化學(xué)研究表明：Runx2和Osterix在牙齒的形成過程中有著重要的作用，并且會單獨激活一些跟成牙質(zhì)細胞分化相關(guān)的的特別基因[26-28]。Chen[29]的研究表明：Dsp的表達跟Osterix呈正相關(guān)關(guān)系，而不是Runx2。在16天的小鼠胚胎中，Dsp表達很少，而在牙槽骨的成骨細胞、成牙質(zhì)細胞、amyloblasts和牙髓細胞中Runx2和Osterix表達很多。在18天的胚胎成牙質(zhì)細胞中Runx2的表達顯著減少，而在牙髓細胞和成牙質(zhì)細胞中Osterix的表達依然很高，并且Dsp也開始高表達，這說明Osterix激活晚期一些marker基因?qū)τ诔裳蕾|(zhì)細胞前體到成牙質(zhì)細胞的成熟及分化是必須的，Osterix在牙齒發(fā)育中的位置相當(dāng)于在骨發(fā)育中的位置，而Osterix和Dsp在牙齒發(fā)育的后期也可以被檢測到，而當(dāng)我們強制性地在小鼠的成牙質(zhì)細胞類似細胞中表達Osterix也可以刺激Dsp的表達，這說明Dsp可能是Osterix直接激活的目標(biāo)基因[26]。越來越多關(guān)于Osterix在骨骼發(fā)育和牙齒發(fā)育中的功能的研究在展開，Cao[29]第一個使用小鼠模型闡明了Osterix在細胞牙骨質(zhì)形成中的作用，細胞牙骨質(zhì)是一種可以支持牙齒發(fā)育的礦化組織。在用3.6kbCol1a1啟動子來驅(qū)動Osterix過表達的轉(zhuǎn)基因小鼠中發(fā)現(xiàn)：過表達Osterix可以增加牙骨質(zhì)的形成，而在小鼠胚胎中用Col1a1-Cre敲除Osterix或者在成年小鼠中用CMV-Cre ERT2敲除Osterix都會引起牙骨質(zhì)形成的減少及Dmp1表達的減少。這些結(jié)果進一步說明Osterix在牙齒形成過程中起著重要的作用[29]。

3 Osterix對人類中骨骼的發(fā)育影響的研究

Osterix作為一個典型的成骨細胞marker基因，對骨骼發(fā)育必不可少，同時它還是一個合成代謝分子，因此利用Osterix來修復(fù)骨折及骨創(chuàng)傷無疑是一個不錯的選擇。在骨折愈合中骨修復(fù)是一個非常復(fù)雜的過程，它涉及到多種分子的時空表達及這些分子在新骨形成過程中的相互作用，而現(xiàn)在通過這些分子對骨再生進行基因治療已經(jīng)開始被關(guān)注[30]。關(guān)于骨創(chuàng)傷到骨愈合調(diào)控的研究已經(jīng)證明：Osterix在骨折處再生的骨細胞中是高表達的。將表達Osterix的BMSc移植到手術(shù)切開的大鼠頭骨處發(fā)現(xiàn)：比較移植了單純的BMSc的手術(shù)切開的大鼠頭骨，表達Osterix的BMSc可以加快大鼠頭骨的愈合，同時也引起了一些骨骼發(fā)育特異性基因的表達[31]。通過加速移植的骨整合，表達Osterix的BMSc移植到裸鼠中也可以引起骨骼形成[32, 33]。Kaback[20]等的研究表明：在骨折的小鼠中，骨折處的愈傷組織和軟骨在骨折后的第7天開始形成，持續(xù)到第10天并伴隨著Sox9的mRNA水平的增加，但是Osterix只在愈傷組織的非層板骨的成骨細胞中表達，而在骨密質(zhì)、過度肥大的軟骨細胞及血管中并沒有表達。骨折后14天，Osterix主要在圍繞在愈合處的成骨細胞中表達，Sox9的表達開始減少，這個時候愈傷組織處的軟骨重塑為硬骨[20]。

圖1 Osx/Osterix在成骨細胞分化中是不可或缺的[6]間充質(zhì)細胞經(jīng)過沉積后一部分分化為成骨細胞的前體，在RUNX2的作用下分化為成骨細胞，而OSTERIX在成骨細胞的成熟及再分化過程中起到了重要的作用，另一部分沉積的間充質(zhì)細胞分化為軟骨細胞，在SOX9的作用下分化為軟骨Fig.1 Osx/Osterix is indispensable in the osteoblast differentiation of ectomesenchymal cells after deposition [6] part of the differentiation of osteoblast precursors, under the action of RUNX2 differentiate into osteoblasts, and Osterix again in osteoblast maturation and differentiation and played an important role in the process of ectomesenchymal cells of another part of the sedimentary differentiation into cartilage cells, under the action of SOX9 differentiate into cartilage

為了研究在正常的骨形成及骨愈合過程中初始骨化位點上成骨細胞前體遷移的機制，將含有Osterix-CreERt和 Col1a1-ERt的兩種轉(zhuǎn)基因小鼠系與含有Rosa26R-LacZ reporter的小鼠雜交，得到了可以追蹤成骨細胞遷移的轉(zhuǎn)基因小鼠[34, 35]。通過注射四羥基三苯氧胺到這些轉(zhuǎn)基因小鼠中，激活了Cre重組酶的表達，隨后引起了LacZ的表達[35]。在這個研究中，作者報道了兩種存在于軟骨膜上的成骨細胞系：一種表達Osterix的成骨細胞前體，另一種表達Col1a1的分化了的成骨細胞。實驗結(jié)果表明：表達的Osterix/LacZ的成骨細胞前體很少存在于皮質(zhì)中，在骨小梁里存在很多，而表達Col1a1/LacZ的細胞在皮質(zhì)中存在很多且用于皮質(zhì)骨的形成，在骨小梁中卻很少。同時研究還發(fā)現(xiàn)：成骨細胞前體是跟血管一起進入初級骨化中心的，而這是因為Osterix表達的前體成骨細胞跟血管的內(nèi)皮細胞是密切相關(guān)的。為了更好的研究Osterix在骨折后愈合中的功能及機制，Osterix-Cre:GFP轉(zhuǎn)基因小鼠被構(gòu)建，發(fā)現(xiàn)表達Osterix-GFP 的細胞主要存在于皮質(zhì)骨的薄骨膜層，在骨折后，這些細胞和血管一同定位到了愈合區(qū)域的骨愈傷組織處，可以作為一種新型的治療骨折的藥物[36]。

4 OSTERIX的突變與人類骨骼疾病的關(guān)系

通過運用GWAS, SNP和linkage mapping等用來鑒定跟人類疾病相關(guān)基因的方法進行基因分析發(fā)現(xiàn)，骨質(zhì)疏松癥和成骨不全癥這兩種骨骼異常的疾病都跟一些誘導(dǎo)基因的突變相關(guān)，例如I型膠原蛋白相關(guān)基因的突變導(dǎo)致了低骨量和低骨密度的表型，這使動物容易遭受多種骨折。Lapunzina[37]等在一名患有成骨不全癥的埃及小孩上鑒定了Osterix的純合突變體，該突變體是由于一個單核苷酸發(fā)生缺失(1052delA)，造成了移碼突變從而導(dǎo)致Osterix鋅指結(jié)構(gòu)的缺失。成骨不全癥患者表現(xiàn)為重復(fù)骨折、輕微的骨質(zhì)疏松及延遲出牙等癥狀(圖2A,B,C)。該病人可能是由于Osterix的缺失改變了Osterix的下游基因主要是骨發(fā)育相關(guān)的基因的表達如type1 collagen。全基因組關(guān)聯(lián)研究進一步揭示了一系列跟骨密度及骨質(zhì)疏松癥相關(guān)的基因。在幾個GWAS推斷的位點上發(fā)現(xiàn)：Osterix是唯一一個在骨密度增大的女性兒童期肥胖癥中表達并含有遺傳變異的位點，在Osterix基因區(qū)域中用SNPs的方法進一步發(fā)現(xiàn)：關(guān)于Osterix在成年腰椎和骨密度的遺傳變異位點有極大的關(guān)聯(lián)性[38, 39]。這些遺傳學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)及流行病學(xué)的研究表明了Osterix對于成年整體骨骼的健康具有極大的意義，這也說明無論是研究骨骼異常的病人還是研究Osterix突變與骨骼疾病的關(guān)系，構(gòu)建Osterix突變體的動物模型都是十分必要的。

圖2 一名8歲的埃及小男孩由于OSTERIX突變導(dǎo)致了成骨不全癥[37]A.該男孩的臨床表現(xiàn)為長骨和脛骨的彎曲(圖上方是長骨，圖下方是脛骨)B.右上肢的X射線成像右上肢的下端彎曲，其肱骨、橈骨及尺骨表現(xiàn)為畸形及不規(guī)則，骨密度降低，小箭頭所示為肱骨的1/3處有骨折后愈合的痕跡及橈骨和尺骨橫向骨折的現(xiàn)象，長箭頭所示為橈骨末端骨生長的橫截線 C.右下肢的X射線成像脛腓骨向前彎曲，箭頭所示處為脛骨的2/3處有橫向骨折的現(xiàn)象Fig.2 An eight-year-old boy in Egypt with OSTERIX mutation causing osteogenesisimperfecta[37]A.The clinical manifestations of the boy is long bone and tibial bending (below the figure above is long bone, figure is shin) B. right upper limb X-ray imaging right bottom bend of the upper extremity, the humerus, radius and ulna show the deformity and irregular, bone mineral density is reduced, small arrow as shown in the third part of the humerus with traces of fracture healing and the phenomenon of radius and ulna transverse fracture, indicated by the arrows of long radius bone growth at the end of the transverse line C. right lower limb X-ray imaging of tibiofibula bend forward, indicated by the arrows for two-thirds of the tibia in A transverse fracture phenomenon

現(xiàn)在反向遺傳學(xué)的方法日新月異，如ZFN[40]、TALEN[41]、CRISPR/cas9[42]等對于研究和治療這些骨骼疾病，構(gòu)建一個Osterix完全突變并能夠穩(wěn)定遺傳的突變體十分必要。由于在小鼠中Osterix的突變會導(dǎo)致小鼠出生后死亡，因此在小鼠中大多關(guān)于Osterix的研究運用的方法都是條件性敲除或者運用細胞實驗進行研究。然而細胞實驗屬于體外實驗，跟體內(nèi)的實際情況還是有很大的差別，而條件性敲除也只是研究了其在成年小鼠中的功能，關(guān)于其在整個發(fā)育過程的研究無法企及，因此運用小鼠來研究Osterix存在一定的局限性，所以關(guān)于治療骨骼疾病存在著諸多不便。因此相關(guān)突變體的構(gòu)建，以及圍繞Osterix的相關(guān)的研究深入的進展，可以讓我們更加清楚地了解到Osterix基因?qū)Τ晒谴x的作用及影響機制。