經(jīng)典Wnt信號通路對骨代謝的調(diào)節(jié)作用

徐偉麗 牛玲玲 王文俠 崔鵬舉

1. 哈爾濱工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院食品科學(xué)系，哈爾濱 150090 2. 齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院黑龍江省普通高校農(nóng)產(chǎn)品加工重點實驗室，齊齊哈爾 161006

Wnt信號通路在各種生物中具有高度的保守性，對于細胞的分化、生長、凋亡及細胞功能的表達都有重要作用，為生物生長發(fā)育所必需。Wnt信號通路包含3條通路：經(jīng)典Wnt/ β-catenin信號通路，非經(jīng)典Wnt/鈣離子(Wnt/Ca2+)通路和Wnt/PCP(planar cell polarity，PCP)通路。與經(jīng)典通路相比，非經(jīng)典通路并不依賴胞內(nèi)的β-catenin，而是通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)Ca2+濃度或細胞極性來實現(xiàn)其功能[1,2]。目前，人類基因研究和小鼠實驗都證明Wnt信號通路在調(diào)控骨形成過程中發(fā)揮著重要作用。Wnt信號通路在骨形成中核心作用的確認，使它成為開發(fā)防治骨骼類疾病新藥的非常有吸引力的目標[1]。該信號通路已成為目前骨骼系統(tǒng)相關(guān)疾病發(fā)病機制和骨代謝研究的新熱點，現(xiàn)就相關(guān)報道綜述如下。

1 經(jīng)典Wnt信號通路的調(diào)控機理

Wnt/β-catenin通路的主要作用機制(見圖1)是胞外的Wnt蛋白與膜上的受體蛋白復(fù)合物結(jié)合(由卷曲蛋白(Frizzled，F(xiàn)z)和低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白(LDL receptor related protein，LRP5/6組成)，激活胞內(nèi)的散亂蛋白(Dishevelled，Dvl)誘導(dǎo)胞內(nèi)的四聚體(APC、Axin、GSK-3β、β-catenin)解體，從而使細胞內(nèi)的β-catenin濃度升高，進入細胞核內(nèi)與轉(zhuǎn)錄因子(T cell factor / lymphoid enhancer factor，TCF/LEF)結(jié)合，最終誘導(dǎo)靶基因(cyclinD1、c-myc、Runx2、Osx等)的表達。在沒有Wnt蛋白存在的情況下，四聚體將β-catenin泛素化標記并最終通過泛素化途徑降解，使其濃度降低而抑制靶基因的表達[3]。

圖1 經(jīng)典Wnt信號通路[4]Fig.1 Classic Wnt signaling[4]

2 與骨代謝相關(guān)的胞外成分—— Wnt

Wnt蛋白家族由19種分泌型富含半胱氨酸的蛋白質(zhì)組成，在骨細胞形成和骨構(gòu)建過程中起重要作用[5]。Wnt1類(Wnt1和Wnt3a)與經(jīng)典Wnt通路相關(guān)，它通過和卷曲蛋白、LRP5/6形成復(fù)合蛋白來激活經(jīng)典Wnt通路[6]。該復(fù)合體會引起GSK3β的磷酸化并導(dǎo)致其失活，這一過程能夠抑制β-catenin的降解，促進其在細胞核中積累進而發(fā)揮作用[7]。非經(jīng)典的Wnt5a類和卷曲蛋白結(jié)合，激活三聯(lián)體G偶聯(lián)蛋白，并且通過C依賴蛋白激酶系統(tǒng)或者JNK依賴的蛋白激酶來提高胞內(nèi)的鈣離子濃度，從而影響細胞骨架的形成[8]。

Wnts能夠通過經(jīng)典和非經(jīng)典通路抑制成熟的成骨細胞凋亡，從而延長它的壽命[9]。Wnts也能夠直接作用于破骨細胞，降低破骨細胞中的β-catenin濃度從而增加破骨細胞的數(shù)目，增加骨吸收，降低骨量[10]。最新研究發(fā)現(xiàn)，在早發(fā)型骨質(zhì)疏松和成骨不全癥患者的常染色體中，Wnt1基因發(fā)生了錯義突變[11]。

由骨細胞分泌的硬骨素(Sclerostin)，能夠和Wnt蛋白競爭LRP5/6在胞外的結(jié)合位點。硬骨素的缺乏，會啟動Wnt信號通路，從而導(dǎo)致人和鼠體內(nèi)的骨量急劇上升。處在失重狀況下的宇航員會快速的流失大量骨質(zhì)，就是由于骨細胞響應(yīng)相關(guān)的機械刺激，分泌的硬骨素升高造成的[12,13,14]。甲旁腺素(parathyroid hormone，PTH)能夠抑制骨細胞產(chǎn)生硬骨素，從而通過Wnt通路增加骨量來治療骨質(zhì)疏松，這也是目前唯一被廣泛認可的治療方案[15]。硬骨素的人源單克隆抗體—Romosozumab，能夠升高骨密度(bone mineral density，BMD)并促進骨形成，減少骨重吸收。在一項針對低BMD的絕經(jīng)后婦女實驗中(為期1年)，Romosozumab作用組BMD的增長幅度(11.3%)比bisphosphonate alendronate(4.1%)和PTH(7.1%)都要大[16]。目前這個藥物已進入三期臨床試驗階段，進一步驗證它對BMD的確切療效及長期服用的副作用[17]。

3 與骨代謝相關(guān)的胞內(nèi)成分

3.1 Axin

脊椎動物的兩種Axin基因分別表達Axin和Axin2蛋白。兩者的功能相似，但是Axin持續(xù)表達，而Axin2只有在Wnt通路激活時才表達，并且起到負反饋調(diào)節(jié)的作用；另外，Axin廣泛表達，而Axin2只在特定的組織表達[18]。人類Axin2的基因突變有可能導(dǎo)致遺傳性牙齒發(fā)育不全、直腸癌等[19]。在人胚胎早期，母體缺乏Axin會導(dǎo)致最初的糖原降解滯后。對S2細胞進行Axin-RNAi實驗，結(jié)果表明內(nèi)源性糖原水平以及GSK3β都有所升高[20]。

Axin是四合體的骨架蛋白，N末端的RSG區(qū)域和APC(adenomatous polyposis coli)結(jié)合。C末端的DIX區(qū)域和散亂蛋白的相關(guān)區(qū)域功能類似，主要促進兩者間的相互作用。另外還有單獨作用于β-catenin、GSK-3β和CKIa的區(qū)域以及與磷酸酶PP2A作用的區(qū)域。當Wnt蛋白與LRP5結(jié)合后，Axin就被征募到細胞膜，與LRP5的胞內(nèi)區(qū)域相互作用，進而阻止Axin參與β-catenin的降解過程[21]。Wynne Peterson-Nedry等發(fā)現(xiàn)完全敲除果蠅Axin上APC、GSK3或β-catenin結(jié)合位點，也只是導(dǎo)致中度的發(fā)育遲緩，因此他們認為Axin和另外的三聚體結(jié)合，主要作用是大大提高復(fù)合體的穩(wěn)定性[22]。

3.2 GSK-3β

糖原合成酶激酶-3(Glycogen synthase kinase 3，GSK-3)是一種絲氨酸(S)/蘇氨酸(T)激酶，在哺乳動物中有α(51ku)和β(47ku)兩種類型。GSK的酶活性受磷酸化位點的影響：GSK3β的9位和GSK3α的21位絲氨酸磷酸化是非活性形式，GSK3β的216位和GSK3α的279位酪氨酸磷酸化是活性形式[23]。GSK-3β在Wnt信號途徑中通過與Axin結(jié)合磷酸化β-catenin末端的3個絲氨酸/蘇氨酸(S33，S37，T41)，促進β-catenin被特定的泛素酶系統(tǒng)識別。Axin上也有CKIα的結(jié)合位點，其主要是通過磷酸化β-catenin的45位絲氨酸，來促進GSK-3β的磷酸化過程。在細胞內(nèi)GSK3β還可以磷酸化Wnt通路的其他成分如Axin，APC等，這一作用能夠增強它們與β-catenin結(jié)合的能力，并提高Axin的穩(wěn)定性[24]。Dvl與Fz/LRP復(fù)合體結(jié)合后被激活，然后將GBP帶入四聚體復(fù)合物，可使GSK-3β從Axin上解離，抑制β-catenin的降解[25]。

GSK3β對成骨細胞的形成和分化有重要的影響。實驗表明GSK-3β的抑制劑如LiCl能夠使骨質(zhì)疏松的小鼠骨量增加，骨礦物質(zhì)密度顯著提高[26]。鋰雖然被用來治療極性功能紊亂病，但是卻會造成病人骨礦化密度降低[27]，對其進一步跟蹤研究表明，停止服用后有增加骨折的風險，[28]。Gregory等用GSK3β抑制劑(2’Z, 3’E)-6-bromoindirubin-3’-oxime(BIO)作用于斑馬魚(zebrafish)，發(fā)現(xiàn)使用GSK3β的抑制劑能夠促進魚鰭再生[29]。Sisask等將GSK3β的抑制劑AZD2858作用于股骨骨折的小鼠，作用一周后能明顯增加骨痂中骨礦化密度和升高骨礦物質(zhì)含量，在沒有先形成軟骨組織的情況下快速治愈骨折[30]。這些研究結(jié)果表明GSK3β是骨質(zhì)疏松預(yù)防治療的靶點。但是，由于GSK-3β分布廣泛，而且它在多種信號通路中同時存在，與人的多種疾病如神經(jīng)系統(tǒng)錯亂、糖尿病、炎癥、癌癥、心力衰竭等密切相關(guān)，所以限制了它在治療骨質(zhì)疏松癥中的應(yīng)用[31]。

GSK-3β對破骨細胞的形成也有重要的影響，GSK3β的非活性狀態(tài)對于單核巨噬細胞分化為破骨細胞尤為重要。有報道指出GSK3β的非活性形式促進了破骨細胞的形成[32]；而采用抑制上游調(diào)控因子RANKL的方式抑制GSK3β的表達，會抑制破骨細胞的形成。因此，關(guān)于GSK對于破骨細胞形成的確切作用機制還不清楚，仍需進一步研究[33]。

3.3 β-catenin

β-catenin由染色體3p21-22的CTNNbl基因編碼，其N端由130個氨基酸組成，是GSK-3β的作用位點。C末端的100個氨基酸主要通過與LEF/TCF結(jié)合發(fā)揮作用。中間連接臂還有550個氨基酸[34]。β-catenin主要通過胞質(zhì)中的濃度起作用。在沒有Wnt存在的情況下，其一端被固定在細胞膜上，另一端與GSK-3β、APC、Axin結(jié)合，被GSK-3β磷酸化標記后，通過泛素化酶水解系統(tǒng)降解，保持低濃度。在Wnt存在的情況下，通路被激活，四聚體復(fù)合物解體，β-catenin降解不發(fā)生，高濃度的β-catenin進入細胞核中發(fā)揮作用[6]。

體內(nèi)和體外實驗均證明β-catenin是影響Runx2基因表達的重要因素，可以通過抑制間質(zhì)細胞Runx2基因的表達，從而抑制間質(zhì)細胞向成骨細胞的轉(zhuǎn)化，促進其轉(zhuǎn)化為軟骨細胞[35]。Holmen等在體外實驗中發(fā)現(xiàn)成骨細胞中β-catenin基因的缺失會導(dǎo)致幾種骨質(zhì)疏松癥，并且影響成骨細胞的分化。在體內(nèi)試驗中，成骨細胞中該基因的缺失會導(dǎo)致體內(nèi)由核因子κ B受體活化因子配體(Receptor Activator for Nuclear Factor-κ B Ligand，RANKL)激活的骨保護素(Osteoprotegerin，OPG)和相關(guān)受體的改變，影響破骨細胞的生成。從而在基因?qū)用孀C明了破骨細胞中β-catenin的異常調(diào)節(jié)會導(dǎo)致骨發(fā)育不良，并證明了成骨細胞中的Wnt/β-catenin通路和破骨細胞的功能轉(zhuǎn)變相關(guān)[36]。

Xu等對480位絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者和170位正常絕經(jīng)后婦女調(diào)查后發(fā)現(xiàn)，前者比后者血清中的β-catenin水平要低。在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者血清中，β-catenin與OPG正相關(guān)，跟RANKL/OPG、體重指數(shù)、硬骨素負相關(guān)。這說明絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的發(fā)病可能和血清中β-catenin濃度的降低和RANKL/OPG比率的升高有關(guān)[37]。

4 與骨代謝相關(guān)的核內(nèi)因子——Runx2/Cbfa1

Runx/Cbfa/Aml/Pebp轉(zhuǎn)錄因子家族包含3個單獨的基因。Cbfa1(Core binding factor a1)/Runx2(tunt related transcriptional factor a1) 能夠決定多功能間質(zhì)干細胞向成骨細胞的分化，其作用機理包括早期誘導(dǎo)成骨細胞的分化和后期抑制它的凋亡[38]，在成骨細胞中的分布最多(在成骨細胞中，Cbfa1和骨鈣素基因、膠原蛋白Ia、骨唾液蛋白和骨橋蛋白的啟動子區(qū)相結(jié)合)，在胸腺細胞和T細胞中也有表達。Cbfa1的遺傳突變會嚴重損害人的骨形成過程，這種疾病稱為顱骨鎖骨發(fā)育不良綜合癥。小鼠體內(nèi)缺乏Cbfa1基因會導(dǎo)致間質(zhì)細胞的分化受到抑制，造成骨形成不足[39]。小鼠細胞膜和軟骨細胞中如果完全缺少Cbfa1/Runx2或者不足單倍劑量的基因表達，都會導(dǎo)致中央軸空病(central core disease，CCD)的發(fā)生。已有證據(jù)表明，Runx2能夠同Lef1或TCF構(gòu)成復(fù)合體，結(jié)合在FGF18(成纖維細胞生長因子)啟動子上，誘導(dǎo)骨發(fā)育調(diào)控因子FGF18的表達[40]。體外實驗表明Runx2有多種調(diào)控作用，它能夠影響堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase，ALP)的活性、誘導(dǎo)不成熟間質(zhì)干細胞中骨基質(zhì)蛋白基因的表達、成骨細胞的礦化等[41]。

5 與骨代謝相關(guān)的下游調(diào)控因子

經(jīng)典Wnt通路的下游調(diào)控基因有cyclinD1、c-myc、Runx2等。cyclinD1是細胞周期增殖信號的關(guān)鍵蛋白，主要調(diào)控細胞從G1期到S期，由β-catenin和LEF/TCF的復(fù)合體所激活[42]。c-myc基因同cyclinD1的作用類似，它能夠加速細胞的周期過程，促進成骨細胞的分化增殖[43]。核內(nèi)的Runx2基因是眾多信號通路調(diào)整的共同靶基因，它的表達能夠明顯刺激成骨細胞的增殖分化[1]。

6 展望

隨著人口數(shù)量的增加、社會人口老齡化的出現(xiàn)，骨骼類疾病，特別是原發(fā)性骨質(zhì)疏松(osteoporosis，OP)已經(jīng)成為老年人、尤其是老年婦女最為常見的疾病之一。由于其患病率和死亡率高，骨骼類疾病現(xiàn)已成為公眾關(guān)注的健康問題。經(jīng)典 Wnt/β-catenin通路對骨細胞的調(diào)控作用已經(jīng)得到廣泛的證實。該信號通路涉及骨骼類疾病、癌癥等多種疾病的發(fā)生，特別是在骨骼類疾病的發(fā)病和治療過程中扮演著重要角色，所以研究更加深入。近年來對Wnt/β-catenin通路的研究主要集中于兩個方向：一是細胞核內(nèi)下游靶基因的調(diào)控因子及調(diào)控路徑；二是影響通路的限制因子。Wnt通路的眾多組分為治療骨質(zhì)疏松提供了大量的潛在作用靶點如Dkk1，硬骨素，各調(diào)控因子的單克隆抗體等。但是整個 Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中細胞因子如何調(diào)節(jié)成骨細胞的具體機制并不完全明確。另外，骨骼在形成過程中除了受到經(jīng)典和非經(jīng)典的Wnt通路的調(diào)控作用外，還涉及ER通路、osteoprotegerin receptor activator for nuclear factor κ B ligand(OPG/RANKL)通路、BMP-2/Smads通路、絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases，MAPK)通路等的調(diào)節(jié)，它們的許多成分對細胞的作用相互重疊。這些通路之間如何聯(lián)系，仍未闡明。所以，除了各個通路成分單獨作用的效果外，該成分對其他通路的作用將成為另一個研究的熱點。