骨折早期調(diào)節(jié)RANKL表達(dá)對(duì)骨折愈合影響的實(shí)驗(yàn)研究

沈業(yè)彤 張學(xué)斌 吳麗紅 劉果彤 王琳 陶敏燕 徐鳳琳

齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院骨外科，齊齊哈爾 161041

OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)自1997年被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，被認(rèn)為是骨科研究領(lǐng)域中的一項(xiàng)重大突破,許多細(xì)胞因子、激素等影響因素均可通過(guò)骨保護(hù)素(OPG)的競(jìng)爭(zhēng)機(jī)制來(lái)調(diào)節(jié)核因子-κB受體活化因子配體(RANKL) 的表達(dá), 從而調(diào)控OPG、RANKL和核因子-κB受體活化因子(RANK) 之間的比值,直接對(duì)破骨細(xì)胞的分化和功能產(chǎn)生決定性作用，OPG由成骨細(xì)胞及骨髓基質(zhì)細(xì)胞分泌,可與RANKL結(jié)合，競(jìng)爭(zhēng)性抑制其表達(dá), 來(lái)調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的活性及凋亡過(guò)程，體內(nèi)有很多激素及調(diào)控因子均可通過(guò)影響OPG/RANKL 的比值來(lái)調(diào)節(jié)其表達(dá)，并影響骨代謝。骨折早期的骨吸收階段，破骨細(xì)胞起著重要的作用，OPG在軟骨內(nèi)成骨過(guò)程中也有著重要的影響，既往研究表明，BMP、雌激素、IL-1、 1, 25-( OH)2D3、TGF和TNF等都能通過(guò)調(diào)節(jié)OPG mRNA的表達(dá)[1-5]，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制來(lái)調(diào)節(jié)RANKL的表達(dá)，使破骨細(xì)胞的活性降低，減少骨吸收，減輕固定后廢用性骨質(zhì)疏松，對(duì)縮短骨折的愈合時(shí)間，防治骨缺損、骨壞死、骨折不愈合及再骨折均具有重要的臨床意義。本項(xiàng)目通過(guò)對(duì)鼠的骨折模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)治療，以探討應(yīng)用基因技術(shù)治療骨折模式的可行性及有效性，同時(shí)為進(jìn)一步研究該系統(tǒng)對(duì)骨生成及代謝方向的影響機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和試劑

重組人骨保護(hù)素Fc 融合蛋白(Recombinant Human OPG-Fc)劑型(50 μg/支)、二甲苯溶液、蜂蠟、酒精溶液、蘇木精染液、石蠟溶液、1%鹽酸乙醇、1%伊紅酒精溶液、樹(shù)膠等。 TRAP 免疫組化染色試劑盒。健康雌性3個(gè)月齡SD大鼠48只,體重270 g～320 g,由齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究室提供。

1.2 動(dòng)物分組和模型

48只大鼠隨機(jī)分為骨折+OPG組和單純骨折對(duì)照組,每組各24只并標(biāo)記組別。備皮后以10%水合氯醛行腹腔注射麻醉。取右大腿外側(cè)切口,鈍性分離至股骨干,經(jīng)股骨中段(大轉(zhuǎn)子下1.5 cm處)以直徑1.0 mm牙科鉆鉆過(guò)，縱向形成規(guī)整的3 mm×1 mm不完全骨折及骨缺損槽，保持骨缺損兩側(cè)骨折完好，并有足夠強(qiáng)度不形成完全骨折，縫合后單純骨折組局部注射1 ml生理鹽水，OPG組將重組人骨保護(hù)素 Fc 融合蛋白50 μg溶入10 ml注射用水中，即濃度為5 μg/ml,亦以1 ml局部注射[6]，術(shù)前及術(shù)后兩組大鼠均肌注慶大霉素一次預(yù)防感染，淘汰失敗模型，并補(bǔ)充，保持?jǐn)?shù)目不變。

1.3 標(biāo)本采集和處理

兩組動(dòng)物于術(shù)后第7、14、21、28d 4個(gè)時(shí)間節(jié)段分批處死,每組每個(gè)節(jié)段各6只,在無(wú)菌操作下將骨折處骨痂組織截取, 用4%的多聚甲醛在4℃下固定24 h,用20%的乙二胺四乙酸以脫鈣,脫水,透明,包埋。將標(biāo)本均沿縱軸中線切片，連續(xù)3張,厚度5 μm,將一張行HE染色,而另兩張行免疫組化染色。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1HE染色:制好的切片經(jīng)脫蠟、水化、蘇木素染核、鹽酸及酒精分化、伊紅染漿、再脫水透明,最后以中性樹(shù)膠封片,在光鏡下觀察其骨痂生長(zhǎng)情況及其組織形態(tài)。

1.4.2免疫組化染色:將切片脫蠟復(fù)水, 首先孵育液 A 液：0.2 mol/L 醋酸緩沖液8 ml；再孵育液 B 液：取六偶氮副品紅 1 ml；再孵育液C液：在1 ml N,N-二甲基甲酰胺中溶解20 mg萘酚AS-BI 磷酸酯。然后將 A、B 液按比例混和，并將pH值調(diào)到5.0，加入C液，最后將141 mg酒石酸鉀鈉加入。破骨細(xì)胞固定后，切片浸入孵育液內(nèi)，封片。鏡下觀察破骨細(xì)胞數(shù)量。

1.5 數(shù)據(jù)收集與處理

將染色后的切片在光學(xué)顯微鏡 400 倍鏡頭下觀察，并計(jì)數(shù)TRAP 陽(yáng)性染色的破骨細(xì)胞。在顯微鏡下，染色陽(yáng)性的破骨細(xì)胞胞漿呈酒紅色，將這兩張切片中的破骨細(xì)胞數(shù)量分別計(jì)數(shù)。選擇染色明、分布均的部位進(jìn)行破骨細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)10 個(gè)高倍視野下的破骨細(xì)胞細(xì)胞總數(shù)為值，即該張切片的破骨細(xì)胞數(shù)。樣本的數(shù)值為兩張切片的破骨細(xì)胞總數(shù)的平均數(shù)。然后采用SPSS11. 0軟件分析, 對(duì)各時(shí)間點(diǎn)兩組數(shù)值行t檢驗(yàn)，最后比較,如P<0. 05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 骨痂組織形態(tài)觀察

HE染色切片低倍鏡下觀察發(fā)現(xiàn)每時(shí)間點(diǎn)骨折+OPG組，骨痂直徑平均值均大于單純骨折組,骨痂生成速度快及生成量增多。具體情形如下：7d時(shí),骨折+OPG組骨折處可見(jiàn)大量的軟骨細(xì)胞在形成的纖維肉芽組織中，并有明顯的成骨出現(xiàn)，軟骨基質(zhì)形成，軟骨明顯膜內(nèi)化骨及軟骨內(nèi)化骨現(xiàn)象,骨折間隙的纖維肉芽組織中有大片軟骨細(xì)胞骨膜增生變厚，其下出現(xiàn)新生骨組織，有大量成骨細(xì)胞聚集；單純骨折組骨痂中纖維組織成分多,出現(xiàn)散在少量軟骨細(xì)胞及成骨細(xì)胞，骨膜有增厚，但新生骨組織明顯較少。第14天時(shí),骨折+OPG組纖維性骨痂減少,軟骨性骨痂增多并向編織骨轉(zhuǎn)化；單純骨折組軟骨性骨痂少。21天時(shí),骨折+OPG組骨折間隙編織骨逐漸聚集,呈連續(xù)性骨痂,骨小梁逐漸形成并增多;單純骨折組骨折有大量軟骨細(xì)胞，骨小梁形成少。28天時(shí),骨折+OPG組骨折處進(jìn)一步融合、連接，出現(xiàn)板層骨，骨量增多;單純骨折組仍有軟骨組織，骨組織成熟慢、量較少，見(jiàn)圖1、圖2。

圖1 單純骨折組28天時(shí)低倍鏡下見(jiàn)軟骨組織多，骨組織少Fig.1 The simple fracture group was lower than that in the 28 days of the fracture group, and there were more cartilage tissues and less bone tissue

圖2 骨折+OPG組28天時(shí)低倍鏡下見(jiàn)骨量多，多為板層骨，骨成熟度高Fig.2 The fracture +OPG group was lower than that in 28 days, and the number of bone was much more than that of lamellar bone, and the height of bone was high

2.2 光學(xué)顯微鏡下對(duì)破骨細(xì)胞觀察并計(jì)數(shù)

將骨折+OPG組、生理鹽水組所計(jì)數(shù)的破骨細(xì)胞個(gè)數(shù)取平均值，得出7d、14d、21d、28d的兩組中每個(gè)樣本的破骨細(xì)胞個(gè)數(shù)的平均數(shù)，OPG 組分別為3.153±0.057,2.964±0.162,1.831±0.068,5.462±0.073, 對(duì)照組分別為5.536±0.035,8.859±0.041,5.464±0.027,7.427±0.052再對(duì)兩組破骨細(xì)胞數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。見(jiàn)圖3。

圖3 OPG組與對(duì)照組在不同時(shí)間節(jié)段破骨細(xì)胞數(shù)量對(duì)比圖Fig.3 OPG group and control group at different time of the number of broken bone cells

3 討論

在實(shí)驗(yàn)研究及臨床治療中觀察發(fā)現(xiàn)，骨折早期即有破骨細(xì)胞參與骨吸收及骨生成的動(dòng)態(tài)平衡，并為其重要調(diào)節(jié)因素之一。RANKL為破骨細(xì)胞生長(zhǎng)及分化所必需的細(xì)胞因子[7],它通過(guò)與RNAK結(jié)合使破骨細(xì)胞活性增強(qiáng),達(dá)到骨吸收加強(qiáng)的效果，OPG是RANKL的誘騙受體,通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用，可以減少RANKL與RNAK結(jié)合，從而抑制破骨細(xì)胞分化、成熟，并且成熟破骨細(xì)胞活性也受到抑制[8-9]。OPG還可以激發(fā)成骨活性，通過(guò)促進(jìn)成骨細(xì)胞樣細(xì)胞分化成熟為成骨細(xì)胞來(lái)完成,進(jìn)而促進(jìn)新骨組織形成[10]。AyaShiotani等[11]也通過(guò)研究證實(shí)了OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)對(duì)破骨細(xì)胞的分化和重吸收的作用。體內(nèi)諸多激素、細(xì)胞因子也是通過(guò)RANKL/RANK/OPG環(huán)路來(lái)實(shí)現(xiàn)調(diào)控破骨細(xì)胞的活化和功能的[12]。破骨細(xì)胞表面的RANK是RANKL的唯一受體，成骨細(xì)胞分泌OPG，競(jìng)爭(zhēng)性地抑制了RANKL與RANK結(jié)合，從而抑制了破骨細(xì)胞的生物活性及其成熟[13]。骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMPs、PGE2、甲狀旁腺激素PTH、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGFβ、雌激素、糖皮質(zhì)激素等對(duì)破骨細(xì)胞的抑制作用均是通過(guò)調(diào)節(jié)該通路，改變成骨細(xì)胞系的OPG和RANKL的表達(dá)而完成的。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用OPG-Fc可排除其他因素，達(dá)到直接下調(diào)RANKL表達(dá)的目的，與應(yīng)用腺病毒改變基因表達(dá)效果相同，使OPG/RANKL比值增大，為基因治療奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，以往實(shí)驗(yàn)顯示該蛋白藥效為局部作用，半衰期約 6-7 天，藥物性能持續(xù)約30天，可完全滿足本實(shí)驗(yàn)要求，也是28天后OPG組破骨細(xì)胞數(shù)量開(kāi)始回升的原因之一。

Kon等[14]發(fā)現(xiàn)OPG表達(dá)高峰在骨折后24小時(shí)內(nèi)和骨折后第7天;而RANKL表達(dá)高峰在骨折后第3天和第14天。在我們實(shí)驗(yàn)研究中，術(shù)后即應(yīng)用OPG-Fc，觀察到第7天、第14天、第21天時(shí)間點(diǎn)明顯下調(diào)了RANKL的表達(dá)，破骨細(xì)胞數(shù)量遞減，28天時(shí)破骨細(xì)胞數(shù)量回升，考慮為隨著藥物代謝，性能下降導(dǎo)致，也可能與骨折后期骨改造增強(qiáng)，破骨細(xì)胞活性增強(qiáng)有關(guān)，對(duì)照組破骨細(xì)胞數(shù)量也回升，也說(shuō)明了這個(gè)問(wèn)題。對(duì)照組顯示破骨細(xì)胞活性最活躍是在第14天和第28天以后，與RANKL表達(dá)高峰相符，對(duì)比其臨床意義，考慮第一個(gè)高峰可促進(jìn)骨折斷端及壞死骨的吸收，第二個(gè)高峰有利于骨痂的塑形改造，結(jié)合低倍鏡下觀察骨痂愈合情況，充分說(shuō)明骨折早期下調(diào)RANKL表達(dá)，能明顯抑制破骨細(xì)胞活性，抑制早期骨折端骨質(zhì)的吸收，打破骨生成與骨吸收的動(dòng)態(tài)平衡，使骨痂明顯增多，并可促進(jìn)骨成熟加速，減少骨吸收，提高骨密度，28天后隨著藥效的減低，對(duì)骨折后期骨痂的塑形改造并不會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重影響，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究骨折愈合不同階段骨痂OPG/RANKL的表達(dá)變化,提示OPG/RANKL比值決定骨代謝方向和骨折愈合進(jìn)程。骨組織中OPG/RANKL的相對(duì)比值升高則骨形成作用大于骨吸收作用,骨折愈合加速;反之則骨折愈合減慢，但本實(shí)驗(yàn)并未對(duì)成骨細(xì)胞表達(dá)進(jìn)行觀察比較，有待于進(jìn)一步研究探討。

過(guò)度抑制RANKL的表達(dá)，將使破骨細(xì)胞的活性極度下降，嚴(yán)重影響骨吸收及改造，當(dāng)敲除小鼠OPG基因后會(huì)患嚴(yán)重的骨質(zhì)疏松癥；而小鼠OPG基因過(guò)度表達(dá)時(shí)，將出現(xiàn)嚴(yán)重的石骨癥。所以，在骨折早期適度下調(diào)RANKL表達(dá)對(duì)骨折愈合具有積極的促進(jìn)作用，但過(guò)度抑制其表達(dá)將會(huì)過(guò)猶不及。