不同雙膦酸鹽類藥物在骨代謝的實(shí)驗(yàn)研究

李冬梅 高克加

1. 上海市同仁醫(yī)院藥學(xué)部，上海 200336 2. 上海市黃浦區(qū)中心醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，上海 200002

隨著城市人口的老齡化的增加，骨質(zhì)疏松癥及相關(guān)的并發(fā)癥已成為全球關(guān)注的健康難題[1-3]。雖然目前治療骨質(zhì)疏松癥的方法不少，而雙膦酸鹽類藥物是治療骨質(zhì)疏松的一種主流藥物，但不同的雙膦酸鹽藥物治療結(jié)果并不一樣，并以實(shí)驗(yàn)分析。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

制作骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)兔由上海生旺實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖有限公司提供；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)場所為上海市交通大學(xué)第六人民醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品

放射性骨顯像劑“99mTc-MDP”(锝-99-m-亞甲基二磷酸鈉)由上海欣科藥業(yè)有限公司提供；治療藥物“99Tc-MDP”(锝-99-亞甲基二磷酸鈉)由成都云克藥業(yè)責(zé)任有限公司提供：其中A瓶為99Tc液5.5 μg/5ml/瓶，B瓶MDP為5 mg/瓶，用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和骨性疾病；治療骨質(zhì)疏松癥的代表藥物“氨基二膦酸鹽”(阿侖磷酸鈉)由默沙東(意大利)美國默克公司分部提供70 mg/片；治療轉(zhuǎn)移性骨腫瘤藥物“帕米磷酸二鈉”(博寧)由深圳海王藥業(yè)有限公司購置，15 mg/瓶(凍干粉劑)； “地塞米松磷酸鈉注射液”(DX)5 mg/1 ml/支，由辰欣藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)。

1.3 檢測儀器

骨密度測定儀(雙能X線骨密度儀LUNAR.DXP-L.USA)。骨生物力學(xué)測定(骨力學(xué)測試儀INSTRON-5543.USA)。CT為飛利浦CT-SECURA，X線攝片、病理、骨形態(tài)計(jì)量檢測及生化儀均為常規(guī)設(shè)備。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組

健康雌性新西蘭實(shí)驗(yàn)兔56只，平均體重3.0±0.18 kg。實(shí)驗(yàn)分為二個(gè)階段進(jìn)行，第一階段(制作骨質(zhì)疏松模型階段)，按隨機(jī)數(shù)字表排列形式將實(shí)驗(yàn)兔分為正常組16只，骨質(zhì)疏松模型組40只。制作骨質(zhì)疏松模型第6周時(shí)，二組各處死8只，以證實(shí)骨質(zhì)疏松模型成立。余下的試驗(yàn)兔在第二階段(治療觀察階段)，設(shè)計(jì)為：A組(正常對照組，余下的8只正常兔)；另余下的骨質(zhì)疏松模型組分為B組(骨質(zhì)疏松對照組)；C組(“99Tc-MDP”治療組)；D組(“阿侖膦酸鈉”治療組)；E 組(“博寧”治療組)，每組8只，治療觀察總療程為16周。

2.2 骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型制作

參照相關(guān)制作兔骨質(zhì)疏松模型資料[4-5]，實(shí)驗(yàn)兔購入先適應(yīng)性飼養(yǎng)2周，對正常組采用生理鹽水2 ml肌肉注射，但不注射DX針劑；對40只骨質(zhì)疏松模型組的試驗(yàn)兔實(shí)行肌肉注射鹽酸地塞米松針劑：2 mg/kg/次肌肉注射，每周2次，連續(xù)6周，兩組各處死8只，并進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的檢測，用以正實(shí)骨質(zhì)疏松模型成立。6周后進(jìn)行第二階段試驗(yàn)：A組(正常對照組，與第一階段的正常組同樣操作)，其他B、C、D、E組第7周后繼續(xù)維持DX肌肉注射，但劑量改為1次/周，直至試驗(yàn)結(jié)束。

2.3 治療方法

“99Tc-MDP”治療組，參照臨床成人治療用藥方法：將A瓶中99Tc液5 ml注入B瓶內(nèi)，搖勻1分鐘后，治療量用生理鹽水稀釋后以0.2 mg/5 ml/kg對C組進(jìn)行耳靜脈推注治療，每周1次?！鞍鲮⑺徕c”治療組，按成人常規(guī)劑量，0.2 mg/3 ml/kg用水溶解后清晨給實(shí)驗(yàn)兔采用軟管喂服，1次/周?！安帯敝委熃M以1 mg/10 ml/kg劑量經(jīng)實(shí)驗(yàn)兔耳靜脈注射治療，每周1次。總療程為16周。

2.4 實(shí)驗(yàn)室觀察檢測指標(biāo)

病理骨組織學(xué)、骨密度、骨形態(tài)計(jì)量、生物力學(xué)試驗(yàn)、放射性“99mTc-MDP”骨骼顯像ROI比值(此顯像是一種成骨性的功能性顯像，升高是成骨需求的標(biāo)志，顯像中放射性分布所感興趣的區(qū)域稱為RIO，取實(shí)驗(yàn)兔股骨頭與股骨中段相比較值)、X線、CT攝片及血清骨堿性磷酸酶(BALP)、骨鈣素(BGP)。

3 檢測方法

3.1 取材方法

取第三腰椎(L3)和右側(cè)股骨頭行病理細(xì)胞學(xué)、骨形態(tài)計(jì)量分析(骨小梁體積%)、第四腰椎(L4)和左側(cè)股骨行骨密度檢測(分別采用整體股骨、單個(gè)椎體進(jìn)行檢測骨密度，g/cm2)、生物力學(xué)試驗(yàn)(分別以股骨三點(diǎn)彎曲、腰椎壓縮方法、最大壓縮載荷試驗(yàn)，單位為牛頓N)，處死前進(jìn)行X線攝片、CT攝片、“99mTc-MDP”骨骼顯像ROI比值、血清BALP(骨堿性磷酸酶)、BGP(骨鈣素)指標(biāo)進(jìn)行檢測。

3.2 相對療效評判

將治療后的各組動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果與B組相比較，根據(jù)骨細(xì)胞學(xué)、骨密度、骨生物力學(xué)、形態(tài)計(jì)量和X線攝片、CT攝片的骨小梁密度變化及“99mTc-MDP”骨骼顯像ROI比值上升或下降、血清BALP、BGP值的增高或降低結(jié)果相對評判為為顯效、有效和無效。

顯效：病理切片見骨組織中骨小梁增多、增粗，骨密度、骨力學(xué)、骨形態(tài)計(jì)量增加≥5%，99mTc-MDP骨骼顯像ROI比值降低率>5%，血清BALP、BGP在原來的基礎(chǔ)上降低率>15%，X線攝片和CT攝片不變或略見密度提高。

有效：病理切片見骨組織中骨小梁密度略有所增加，骨密度、骨力學(xué)、骨形態(tài)計(jì)量增加<5%，>0，99mTc-MDP骨骼顯像ROI比值降低率<5%，>0，血清BALP、BGP在原來的基礎(chǔ)上降低率<15%>0；X線攝片和CT攝片無改變。

無效：各治療組與B組相比較，各指標(biāo)改變不明顯或加重。

3.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

4 結(jié)果

4.1 第一階段試驗(yàn)

第一階段試驗(yàn)結(jié)果，正常組與骨質(zhì)疏松模型組之間試驗(yàn)指標(biāo)存在較大的差異。骨病理學(xué)切片顯示：正常組股骨頭的骨細(xì)胞和骨小梁排列規(guī)則，骨組織和關(guān)節(jié)表面未見骨質(zhì)破壞。而骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型組則表現(xiàn)為股骨頭骨小梁稀疏明顯，有斷裂現(xiàn)象。X線、CT攝片示骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型組的骨小梁略有所稀疏差異。骨密度、骨力學(xué)、骨形態(tài)計(jì)量、99mTc-MDP骨骼顯像ROI比值、BALP、BGP等試驗(yàn)結(jié)果經(jīng)二組間差異明顯(P<0.05)。并存在一定的規(guī)律性改變，見表1，由此證實(shí)經(jīng)DX誘導(dǎo)的兔骨質(zhì)疏松模型成立。

4.2 第二階段試驗(yàn)

對C、D、E組實(shí)驗(yàn)兔進(jìn)行治療16周后，采用與第一階段相似的實(shí)驗(yàn)室檢測，病理切片顯示：正常組與A組和骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型組與B組結(jié)果基本相似； 而 C、D、E組在B組的基礎(chǔ)上均有所改善，骨小梁排列密度提高依次為C組、D組和E組，見圖1。X線攝片、CT攝片攝片差異仍不明顯，但99mTc-MDP骨骼顯像ROI比值、血清ALP、BGP檢測結(jié)果均存在不同程度的差異。以B組為基礎(chǔ)，各組的病理組織學(xué)、骨密度、生物力學(xué)、99mTc-MDP骨骼顯像ROI比值、血清ALP、BGP檢測的改善程度，C組改善最明顯(顯效)，D組和E組為有效，但E組變化較小。見表2。

表1 制模6周時(shí)實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果Table 1 Laboratory test results were detected at 6 weeks after successful molding

4.3 實(shí)驗(yàn)兔情況

在實(shí)驗(yàn)中，骨質(zhì)疏松組有1只實(shí)驗(yàn)兔于第5周時(shí)死亡，A組1只、B組有2只、E組1只實(shí)驗(yàn)兔分別于第10、11、13、15周因腹瀉死亡，其他實(shí)驗(yàn)兔的一般情況尚屬正常。

5 討論

雙膦酸鹽類藥物能夠治療骨質(zhì)疏松癥的關(guān)鍵是具有穩(wěn)定P-C-P結(jié)構(gòu)，能抵御生物酶解作用，對破骨細(xì)胞發(fā)揮細(xì)胞毒作用，誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分泌抑制因子，阻斷破骨細(xì)胞啟動(dòng)的破骨過程，抑制骨吸收，強(qiáng)力親和磷酸鈣，吸附于骨組織中羥基磷灰石結(jié)晶表面，抑制其結(jié)晶和非結(jié)晶前體物質(zhì)形成，阻止骨骼中鈣鹽“逸出”[6]，從而達(dá)到改善骨質(zhì)疏松的現(xiàn)象。但抑制骨吸收的作用大小與各種雙膦酸鹽特點(diǎn)所不同。

“99Tc-MDP”治療組、“阿侖膦酸鈉”和“博寧”都屬于雙膦酸鹽類藥物，但各有其治療價(jià)值。“阿侖膦酸鈉”在骨質(zhì)代謝中能夠明顯抑制破骨細(xì)胞的活性作用，被認(rèn)為與抑制破骨細(xì)胞的功能和抑制骨鈣的流失有關(guān)[7-8]，是臨床上治療骨質(zhì)疏松癥的主要藥物之一?！?9Tc-MDP”有較好的親骨性，而且“99Tc-MDP”中的微量元素锝-99(99Tc)能夠發(fā)生化學(xué)價(jià)態(tài)的變化，通過其失去或者獲得電子的過程中而不斷消除人體內(nèi)的自由基。有報(bào)道99Tc在人體內(nèi)具有調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能的作用，保護(hù)過氧化歧酶(SOD)的活力，防止自由基對組織的破壞，并對炎性介質(zhì)和免疫調(diào)節(jié)因子白介素Ⅰ(IL-1)的產(chǎn)生有抑制作用，從而起到調(diào)節(jié)人體免疫功能的作用[9-11]?？梢姟?9Tc-MDP”在治療骨質(zhì)疏松中，不僅具有雙膦酸鹽抑制骨鈣的流失的作用，可能存在更有價(jià)值的調(diào)節(jié)骨代謝的功效，對存在免疫性疾病的骨質(zhì)疏松療效更明顯。“博寧”主要用于治療轉(zhuǎn)移性骨腫瘤，通過抑制破骨細(xì)胞吞噬骨質(zhì)、抑制骨吸收從而起到阻止骨溶解的作用，是骨磷作用的10倍[12]。

圖1 A、B、C、D、E病理圖片(HE染色10×40)Fig.1 Pathohistology structure of femoral head in different groups (HE dyeing 10×40)

表2 治療16周實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果Table 2 Laboratory test results were detected at 16 weeks with treatment

通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，在骨質(zhì)疏松模型的基礎(chǔ)上經(jīng)C組、D組和E 組治療，均有較明顯的改善，但療效不一樣。“博寧”雖然具有抑制破骨細(xì)胞吞噬骨質(zhì)的作用，以前往往用于抑制轉(zhuǎn)移性骨腫瘤的急性擴(kuò)展和止痛；而“阿侖膦酸鈉”是在藥物“博寧”的療效基礎(chǔ)上研制的新一代治療骨質(zhì)疏松癥的雙膦酸鹽類藥物，對骨組織過快的骨吸收進(jìn)行抑制而提高了治療價(jià)值，所以實(shí)驗(yàn)中“阿侖膦酸鈉”治療骨質(zhì)疏松的療效優(yōu)于“博寧”。而“99Tc-MDP”是在雙膦酸鹽上標(biāo)記一種穩(wěn)定的微量元素锝-99，治療骨質(zhì)疏松療效更明顯，說明锝-99在P-C-P結(jié)構(gòu)上功能鍵的結(jié)構(gòu)差異，療效價(jià)值也不同，在雙膦酸鹽分子上，螯合上微量元素锝-99以后，不光有抑制骨吸收外，可能對骨組織存在免疫調(diào)節(jié)價(jià)值。由此可見，對骨質(zhì)疏松的治療應(yīng)該了解雙膦酸鹽類藥物的療效價(jià)值，針對性地選擇雙膦酸鹽類藥物將可為臨床治療骨質(zhì)疏松癥提供依據(jù)。