聯(lián)合使用甲狀旁腺激素和辛伐他汀對去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松癥的治療有疊加效應(yīng)

顏海彬 張炳云

浙江省溫嶺市第一人民醫(yī)院骨科，溫嶺 317500

隨著世界人口老年化進(jìn)一步加重，骨質(zhì)疏松癥已經(jīng)成為一種嚴(yán)重危害老年人群生活質(zhì)量的社會公害，其患病率預(yù)計在未來10年將顯著增加。骨質(zhì)疏松癥大大增加髖部的骨折發(fā)生率，相對于西方國家髖部的骨折發(fā)生率在下降，亞洲大部分國家髖部骨折發(fā)生率在明顯增加[1]。預(yù)計到2050年，世界上一半的髖部骨折會出現(xiàn)在亞洲的國家[2]。這些表明對骨質(zhì)疏松的防治在亞洲相對而言更為急迫。目前臨床上存在很多治療骨質(zhì)疏松的藥物,主要有抑制破骨細(xì)胞活性和促進(jìn)成骨細(xì)胞活性兩類藥物。目前最常見的抗骨質(zhì)疏松藥物如甲狀旁腺素(PTH)、唑來膦酸、他汀類藥物。研究表明小劑量間斷使用PTH可以加快機體的骨轉(zhuǎn)換，促進(jìn)成骨細(xì)胞的活性，最終會提高骨量，增加骨密度，改善骨質(zhì)疏松[3]. 辛伐他汀(SIM)作為一種的降膽固醇藥物，它可以促進(jìn)成骨基因表達(dá)如血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP-2)、核心結(jié)合因子α1等來促進(jìn)骨形成[4-8]。SIM常常被用來治療骨質(zhì)疏松癥，如今的研究表明其防治骨質(zhì)疏松的效果顯著[9]。目前臨床上有較多種類的抗骨質(zhì)疏松藥物,但這些藥物尚不能完全治愈骨質(zhì)疏松,為了能取得最大療效,人們尋求聯(lián)合或序貫治療等方法防治骨質(zhì)疏松癥。本研究聯(lián)合使用甲狀旁腺激素和辛伐他汀來對骨質(zhì)疏松進(jìn)行干預(yù)，為臨床上這兩類藥物的聯(lián)合使用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

PTH，SIM (GIBCO 公司)，Micro-CT (SkyScan1176，蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)院骨科研究所)，手術(shù)操作器械(美國史塞克醫(yī)療器械公司)。

1.2 方法

1.2.1骨質(zhì)疏松動物模型的建立：50只健康的雌性Sprague-Dawley大鼠(3月齡，體重 220～240 g。由上海實驗動物中心提供)用于去卵巢(OVX，N=40)制作骨質(zhì)疏松模型和假手術(shù)(Sham, N=10)。手術(shù)開始前，所有大鼠稱重，根據(jù)體重，適量腹腔注射10% 水合氯醛(3 ml/kg)進(jìn)行麻醉，麻醉成功后，于大鼠背部正中線中下 1/3處作一長約 2 cm 縱行切口，向兩側(cè)鈍性分離皮下軟組織，于脊柱旁開0.5 cm處鈍性分開肌肉組織，顯露卵巢脂肪包被組織，輕輕提起卵巢，于輸卵管卵巢交界處絲線結(jié)扎，完整摘除雙側(cè)卵巢，逐層縫合，關(guān)閉創(chuàng)口。術(shù)后前3天給予青霉素肌肉注射(2. 5萬U/kg)預(yù)防感染。術(shù)后所有的去卵巢(OVX)大鼠隨機的分成4組：OVX組、 SIM組、 PTH組、 PTH+SIM組。

1.2.2術(shù)后治療：術(shù)后第1天開始給予藥物治療，SIM組： SIM灌胃(劑量5 mg/kg，每天1次)，PTH組：PTH皮下注射(劑量60 μg/kg，每周3次)，PTH+SIM組：SIM灌胃和PTH皮下注射，劑量和用藥頻率和SIM組、PTH組相同，直至手術(shù)后12周為止，每周稱量大鼠體重，根據(jù)體重變化來調(diào)整藥物劑量。本實驗所使用的藥物劑量參考以前發(fā)表的治療骨質(zhì)疏松效果明顯的文獻(xiàn)中所使用劑量[10, 11]。

1.2.3Micro- CT檢測：所有存活的大鼠在術(shù)后周時處死，完整取下大鼠雙側(cè)脛骨， 剔除周圍軟組織， 生理鹽水沖洗后，采用10%的多聚甲醛固定用于Micro- CT 檢測。將左側(cè)脛骨置于掃描床上， 掃描興趣區(qū)為腔骨近端飯板下2 mm遠(yuǎn)端2 mm范圍內(nèi)松質(zhì)骨。斷層掃描后,3D重建,去除骨皮質(zhì)影像,分析軟件定量分析。獲得大鼠脛骨感興趣區(qū)域骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)骨體積分?jǐn)?shù) (bone volume/total volume, BV/TV)、骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb．Th)、骨小粱數(shù)量(trabeculae number，Tb．N)、 骨小粱分離度(trabecular spacing， Tb．Sp)、連接密度(connective density, Conn. D.)及骨密度(BMD)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 手術(shù)對大鼠的影響

截止到術(shù)后12周時，有3只大鼠由于手術(shù)不當(dāng)、麻醉不當(dāng)和傷口感染死亡，它們其中1只屬于OVX組，1只屬于PTH組，一種屬于SIM，最終共有47只大鼠進(jìn)入最終試驗結(jié)果評估。12周時Sham大鼠的脛骨骨密度為233.67±30.14 (mg/cm2)，而OVX組大鼠脛骨骨密度為165.34±27.34 (mg/cm2)。相對Sham組，OVX組大鼠的骨密度下降41.21%(P<0.05)，這表明我們的模型建立是成功的。

2.2 大鼠骨密度的改變

12周時，大鼠脛骨近端的骨密度由Micro-CT檢測的結(jié)果如表1所示，我們可以發(fā)現(xiàn)各治療組的脛骨近端的骨密度都明顯高OVX組。相對于OVX組，SIM組、PTH組、 PTH+SIM組分別增加了22.5%、26.4%、34.3%，有明顯的統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。從表1我們可以發(fā)現(xiàn)PTH+SIM組的骨密度最高，和SIM組、PTH組比較也有明顯的統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，這表明聯(lián)合使用SIM和PTH治療骨質(zhì)疏松有相互促進(jìn)作用。

2.3 Micro- CT 三維重建分析及骨微觀參數(shù)

我們通過Micro- CT對感興趣區(qū)域進(jìn)行三維重建，重建的結(jié)果如圖1所示，通過內(nèi)置軟件計算的骨微觀參數(shù)如表2所示。我們可以通過觀察圖1 明顯的發(fā)現(xiàn)相對而言PTH+SIM組骨小梁的數(shù)量明顯多于其他組，而且骨小梁聯(lián)系緊密，骨小梁更粗。骨微觀參數(shù)更加明顯的表明PTH+SIM組有最高的BV/TV、Tb.Th、Tb.N、Conn. D和最低Tb.Sp，而OVX組有最高的Tb.Sp和最低BV/TV、Tb.Th、Tb.N、Conn. D。和OVX組比較，SIM組、PTH組、 PTH+SIM組骨微觀參數(shù)有明顯的統(tǒng)計學(xué)意義，這些表明聯(lián)合使用PTH和SIM可以明顯增加骨小梁的量。

表1 大鼠脛骨近端骨密度的變化Table 1 The change of BMD of the proximal tibia in rats

*:與OVX組比較有顯著性差異(P<0.05);#:與SIM組比較有顯著性差異(P<0.05);&:與PTH組比較有顯著性差異(P<0.05)。S*P<0.05, vs OVX group;#P<0.05, vs SIM group;&P<0.05, vs PTH group.

3 討論

骨質(zhì)疏松癥(Osteoporosis，OP)是一種由于體內(nèi)雌激素代謝紊亂導(dǎo)致骨形成和骨吸收之間的平衡被打破，結(jié)果使骨吸收增強，最終導(dǎo)致骨量減少、骨骼脆性增加和易發(fā)骨折為特征的代謝性骨病。參與調(diào)節(jié)骨重建主要有甲狀旁腺激素(PTH)，1,25(OH)2D3，降鈣素和雌激素這四種主要激素。連續(xù)給予PTH刺激機體會增強破骨細(xì)胞活性，導(dǎo)致骨量丟失，如最常見的原發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)就是這種表現(xiàn)，而間歇性小劑量使用PTH具有促進(jìn)骨合成代謝作用，并導(dǎo)致改善骨微結(jié)構(gòu)，增加骨量。大量的研究已經(jīng)表明間歇性小劑量使用PTH確實具有提高骨質(zhì)疏松狀態(tài)下骨密度，增加骨量，降低骨折的發(fā)生率[12, 13]，這可能和PTH的作用機制有關(guān)，PTH 可以抑制成骨細(xì)胞凋亡，加速骨襯細(xì)胞對新分化成骨細(xì)胞的招募及破骨細(xì)胞的增殖，這些作用主要通過Wnt信號通路來進(jìn)行[14]。我們的實驗再一次證實了間歇性小劑量使用PTH確實可以對骨質(zhì)疏松的防治效果顯著，不僅可以保持骨密度，阻止骨小梁的減少。

圖1 左脛骨近端骺線下2 mm感興趣區(qū)域通過Micro-CT三維重建的結(jié)果。Fig.1 Image of 3-D reconstruction of micro-CT of interested area of 2 mm below epiphysis in the left tibia.

表2 術(shù)后12周時,各組大鼠左脛骨近端骺線下2 mm感興趣區(qū)域骨微觀參數(shù)Table 2 Bone histomorphometry parameters at the interested area of 2 mm below epiphysis in the left tibia 12-week after the operation

*:與OVX組比較有顯著性差異(P<0.05);#:與SIM組比較有顯著性差異(P<0.05);&:與PTH組比較有顯著性差異(P<0.05)。*P<0.05, vs OVX group;#P<0.05, vs SIM group;&P<0.05, vs PTH group.

如今的研究已經(jīng)表明SIM確實可以治療骨質(zhì)疏松，我們的實驗結(jié)果很好的證明了這點，去卵巢12周后，相對OVX組大鼠，SIM組大鼠的骨密度以及骨量較高。研究表明SIM可以刺激骨髓來源的骨間充質(zhì)干細(xì)胞形成[15]，并能誘導(dǎo)骨髓細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞[16]。我們在實驗中發(fā)現(xiàn)SIM相對于PTH的抗骨質(zhì)疏松效果較差，這可能和我們實驗中使用的劑量有關(guān)，我們PTH所使用的劑量明顯大于日常預(yù)防骨質(zhì)疏松常用的劑量，同時SIM的給藥方式也會影響療效，但是和OVX組對比有統(tǒng)計學(xué)意義，這表明SIM使用來防治骨質(zhì)疏松是有效的。

在實驗中我們發(fā)現(xiàn)PTH聯(lián)合SIM使用的效果明顯好于它們?nèi)魏我环N藥物單獨使用的效果，這說明它們同時使用有互相促進(jìn)作用。具體的機制尚不清楚，以前的研究表明PTH聯(lián)合SIM使用可以協(xié)同增加成骨細(xì)胞活性[17]。研究表明SIM可以顯著的促進(jìn)骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP 2)的表達(dá)[18]，而PTH也可以刺激BMP-2 mRNA的表達(dá)，并顯著提高BMP-2的活性和功能[19, 20]。PTH和SIM相互協(xié)同作用是可能是通過BMP-2來偶聯(lián)，具體機制還需要進(jìn)一步探討。

本次試驗也有其局限性，首先我們實驗使用的大鼠數(shù)量有限，且時間較短，12周之后動物骨質(zhì)疏松的具體情況不知。我們沒有進(jìn)一步從微觀結(jié)構(gòu)如病理切片角度進(jìn)一步觀察骨骼的具體改變，同時也沒有進(jìn)一步探索機制。最后我們實驗使用的藥物劑量明顯高于臨床上這類藥物使用的劑量，同時PTH和SIM聯(lián)合使用效果最好的劑量組合也不得而知，進(jìn)一步確定聯(lián)合使用PTH和SIM最佳劑量也是下一步要考慮的事。

綜上所述，本次試驗雖然沒有從機制，生化方面進(jìn)一步研究PTH 聯(lián)合 SIM可以協(xié)同防治骨質(zhì)疏松，但是這次試驗從體外很好的證實 PTH 聯(lián)合 SIM 可以協(xié)同防治骨質(zhì)疏松，為其在臨床藥物方面提供了可能性。但目前動物實驗中用于治療骨質(zhì)疏松藥物的劑量遠(yuǎn)高于臨床上推薦劑量，因此在人體這個復(fù)雜環(huán)境，聯(lián)合使用協(xié)同使用PTH 和SIM 治療骨質(zhì)疏松，仍需進(jìn)一步研究。