富血小板血漿聯(lián)合人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)大鼠骨質(zhì)疏松骨折愈合的影響

楚佳奇 孫杰聰 李鵬 李廣盛 牛艷茹 林顥 陳光華 魏波 魏勁松 曾榮*

1. 廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院骨科中心，湛江 524001 2. 廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院干細(xì)胞研發(fā)與細(xì)胞治療中心，湛江 524001

骨質(zhì)疏松癥(Osteoporosis，OP)是一種以全身低骨量和骨組織微結(jié)構(gòu)改變、破壞為特征，能導(dǎo)致骨脆性增加，骨折風(fēng)險(xiǎn)性增高的全身疾病。骨質(zhì)疏松性骨折(Osteoporosis fracture，OPF)是OP最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，其發(fā)生、致死致殘率較高，且OPF多為粉碎性，骨強(qiáng)度低，愈合慢，抗再骨折能力差，易發(fā)生內(nèi)固定松動(dòng)和再骨折。因此尋求一種更為之有效的治療方法是眾多臨床及科研工作者的迫切目標(biāo)。富血小板血漿(platelet-rich plasma，PRP)中含有大量生長(zhǎng)因子，可加快骨細(xì)胞活化，促進(jìn)骨細(xì)胞增殖、血管再生，誘導(dǎo)骨再生，促進(jìn)骨缺損修復(fù)[1, 2]。我們?cè)谇捌诘捏w外實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)證實(shí)，相對(duì)于單純成骨誘導(dǎo)，PRP輔助誘導(dǎo)的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(Human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUC-MSCs)成骨效果更佳。

本實(shí)驗(yàn)擬建立SD(Sprague Dawley)大鼠OPF模型并對(duì)其進(jìn)行細(xì)胞移植，通過Micro CT動(dòng)態(tài)觀察探討PRP及hUC-MSCs對(duì)動(dòng)物模型骨折愈合的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雌性SPF(Specefic pathogen Free)級(jí)SD大鼠50只，3月齡，體重250±17 g(購(gòu)自廣東醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)。

1.2 主要材料與試劑

人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(P3代)由廣東省臍帶血造血干細(xì)胞庫(kù)提供，低糖L-DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(GIBCO，美國(guó))，成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基(廣州賽業(yè)生物科技有限公司)，7%水合氯醛，常規(guī)手術(shù)器械，動(dòng)物固定臺(tái)架，注射器，法國(guó)Osteospace MEDI LINK雙能X線骨密度檢測(cè)儀，規(guī)格1.0×250 mm骨牽引針20支(張家港市?？滇t(yī)療器械有限公司)，克氏針截?cái)嗥鳎强齐娿@，骨折模型打擊支架[3]，SCANCO MEDICAL Micro CT (viva CT40)，NIKON D90數(shù)碼相機(jī)。

1.3 PRP制備及成骨誘導(dǎo)

知情同意情況下，無菌采取足月孕產(chǎn)婦臍帶血50 ml(預(yù)先加入10%枸櫞酸鈉抗凝劑)，第1次460 g室溫離心8 min，超凈臺(tái)內(nèi)吸取上層血漿及白膜層細(xì)胞，盡量去除紅細(xì)胞；第2次1100 g室溫離心10 min，去除約3/4上清及底層少許紅細(xì)胞，剩下中間層約1 ml即為PRP，-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

P5代hUC-MSCs接種于6孔板，待細(xì)胞80%融合時(shí)加入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，每3天換液1次，培養(yǎng)至21天時(shí)進(jìn)行茜素紅染色鑒定。

1.4 制作大鼠OPF模型

SD大鼠購(gòu)回后適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，正常飲食，籠中飼養(yǎng)，自由活動(dòng)。根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表，將50只SD

大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組10只，手術(shù)組40只，手術(shù)組又分為：安慰劑組、未誘導(dǎo)組、成骨誘導(dǎo)組、PRP+成骨誘導(dǎo)組，每組10只。術(shù)前采用雙能X線骨密度檢測(cè)儀對(duì)大鼠股骨遠(yuǎn)端進(jìn)行骨密度(Bone mineral density，BMD)檢測(cè)。大鼠麻醉后，手術(shù)組切除雙側(cè)卵巢，假手術(shù)組切除相同體積的卵巢周圍組織。術(shù)后將大鼠分籠飼養(yǎng)，允許其自由活動(dòng)。各組大鼠手術(shù)后3個(gè)月再次以同樣方法，同樣參數(shù)測(cè)定骨密度。確定骨質(zhì)疏松造模成功后，參照前人方法進(jìn)行OPF造模[4]。

1.5 細(xì)胞移植及動(dòng)態(tài)觀察OPF愈合

P5代細(xì)胞成骨誘導(dǎo)7天后消化，生理鹽水重懸，細(xì)胞濃度調(diào)整為2×106/ml，移植0.5 ml細(xì)胞于動(dòng)物骨折部位。細(xì)胞移植共進(jìn)行3次，時(shí)間點(diǎn)選為OPF模型建立后1周、3周和7周。安慰劑組直接注射生理鹽水，未誘導(dǎo)組給予未誘導(dǎo)的hUC-MSCs，成骨誘導(dǎo)組移植誘導(dǎo)后的hUC-MSCs，PRP+成骨誘導(dǎo)組移植誘導(dǎo)后的hUC-MSCs聯(lián)合PRP(含TGF-β1 750 pg/ml)[5]。

骨折后的第1周、3周、5周、7周、11周、13周進(jìn)行Micro CT掃描動(dòng)物模型患肢。Micro CT掃描參數(shù)設(shè)置如下：X線能量70 kVp，114μA，8W，掃描模式BH：ALU，掃描分辨率0.038 mm，曝光時(shí)間200ms。以HP圖像采集工作站及μCT Tomography(V6.1-2)圖像采集分析系統(tǒng)進(jìn)行三維重建。計(jì)算骨體積分?jǐn)?shù)(Bone volume/Total volume，BV/TV)，以SPSS 17.0 做單因素ANOVA分析，P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及成骨誘導(dǎo)

倒置顯微鏡下觀察P5代hUC-MSCs，接種12小時(shí)后80%左右細(xì)胞均已貼壁生長(zhǎng)，呈梭形。接種后第二天細(xì)胞約有80%融合。hUC-MSCs經(jīng)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)21 d，茜素紅染色可見間質(zhì)內(nèi)含大量礦鹽沉積的鈣化結(jié)節(jié)呈紅色。

圖1 光鏡下細(xì)胞生長(zhǎng)及成骨誘導(dǎo)后茜素紅染色鑒定(40×)。 a，接種后12小時(shí)80%細(xì)胞貼壁；b，接種后24小時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)融合約80%；c，成骨誘導(dǎo)后21天茜素紅染色，箭頭所示為被染紅的鈣結(jié)節(jié)Fig.1 The morphology of cell growth and alizarin red staining after osteogenic induction (40×). a, There were 80% adherent cells at 12 h post-inoculation；b,Cells were grown to confluence about 80% 24 h post-seeding；c, Alizarin red staining was performed after osteogenic induction for 21 d, calcium nodules were marked with red arrows

2.2 骨密度檢測(cè)

采用MEDI LINK雙能X線骨密度檢測(cè)儀進(jìn)行骨密度掃描后分析數(shù)據(jù)：假手術(shù)組術(shù)前術(shù)后樣本均數(shù)及標(biāo)準(zhǔn)差分別為0.222±0.071和0.238±0.068，P>0.05，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；其它4個(gè)手術(shù)組術(shù)前術(shù)后骨密度均有不同程度降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，提示骨質(zhì)疏松造模成功(表1)。

表1 假手術(shù)組，手術(shù)組術(shù)前術(shù)后樣本BMD均數(shù)比較(g/cm2)Table 1 Comparison of BMD before and after operation in sham and operation group(g/cm2)

注：*假手術(shù)組術(shù)前與術(shù)后BMD比較，P>0.05；**手術(shù)組術(shù)前與術(shù)后BMD比較，P<0.01。*Comparison of BMD before and after operation in sham operation group，P>0.05；**Comparison of BMD before and after operation in operation group，P<0.01.

2.3 OPF造模

骨折術(shù)后行Micro CT觀察OPF造模情況(圖2)。內(nèi)固定過程中， 39支克氏針正常通過大鼠股骨骨髓腔，X線攝片骨折線清晰可見。另外1只動(dòng)物克氏針于股骨中下1/3處穿出骨髓腔，與股骨并行，造模失敗； 1只動(dòng)物進(jìn)行骨折打擊時(shí)擊中股骨血管神經(jīng)束，造成大量出血，動(dòng)物死亡，造模失敗； 1只動(dòng)物術(shù)后第二天不明原因死亡，造模失敗?？傮w造模成功率達(dá)92.5%。

圖2 OPF造模后X線攝片觀察。箭頭所指為骨折斷端。Fig.2 X-ray images of OPF model. The fracture area was marked with arrow

2.4 Micro CT動(dòng)態(tài)觀察OPF愈合

安慰劑組：在骨折后第13周骨痂仍未對(duì)骨折端形成有效包裹，與PRP+成骨誘導(dǎo)組第7周時(shí)的骨痂包裹量相仿(圖3)；

未誘導(dǎo)組：骨折后第11骨痂包裹與成骨誘導(dǎo)組無明顯區(qū)別，優(yōu)于安慰劑組，13周時(shí)，骨痂量、包裹程度與成骨誘導(dǎo)組相仿(圖3)；

成骨誘導(dǎo)組：第3、7周骨痂量與安慰劑組、未誘導(dǎo)組無明顯區(qū)別，少于PRP+成骨誘導(dǎo)組，骨折后第11周骨痂尚未形成完全包裹，第13周時(shí)，骨折端雖被骨痂包裹，但愈合程度不及PRP+成骨誘導(dǎo)組(圖3)；

PRP+成骨誘導(dǎo)組：在骨折后第3周重建即可見在骨折部位附近有少量骨痂生長(zhǎng)，第7周時(shí)骨痂在骨折端的包裹明顯優(yōu)于其他組，骨折線逐漸消失；第11周時(shí)，骨痂已明顯包裹骨折部位，提示進(jìn)入骨折塑形期。(圖3)。

圖3 Micro CT 動(dòng)態(tài)觀察骨折愈合情況Fig.3 Fracture healing was monitored using Micro CT

2.5 Micro CT 動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)骨體積分?jǐn)?shù)

利用GraphPad Prism 5.0，以掃描時(shí)間點(diǎn)為橫坐標(biāo)，BV/TV值為縱坐標(biāo)作圖，可見PRP+成骨誘導(dǎo)組骨體積分?jǐn)?shù)在各時(shí)間點(diǎn)明顯高于其它三組(圖4)。利用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果表明在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)安慰劑組與未誘導(dǎo)組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，PRP+成骨誘導(dǎo)組各個(gè)觀察周期BV/TV值均高于其他各組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，成骨誘導(dǎo)組3、7、11周BV/TV值高于未誘導(dǎo)組與安慰劑組，低于PRP+成骨誘導(dǎo)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖4 Micro CT 動(dòng)態(tài)觀察BV/TV值變化情況Fig.4 BV/TV value was analyzed using Micro CT

3 討論

PRP富含多種生長(zhǎng)因子，其中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(Transforming growth factor β，TGF-β)是參與創(chuàng)傷、促進(jìn)成骨的重要成分之一。TGF-β可促進(jìn)前成骨細(xì)胞趨化和有絲分裂，增進(jìn)膠原基質(zhì)合成，同時(shí)抑制破骨細(xì)胞生成和骨吸收，從而對(duì)創(chuàng)傷愈合和骨組織再生起促進(jìn)作用[1, 2, 6]。在移植骨和骨松質(zhì)內(nèi)許多細(xì)胞膜上存在著TGF-β等因子受體，如成骨細(xì)胞和前成骨細(xì)胞，當(dāng)加入PRP后，高質(zhì)量分?jǐn)?shù)的生長(zhǎng)因子加快了這些細(xì)胞的活化。前人研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1含量為750 pg/ml的PRP對(duì)誘導(dǎo)干細(xì)胞增殖、分化作用顯著，因此本實(shí)驗(yàn)采用此濃度的PRP對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理[5]。

hUC-MSCs在體外誘導(dǎo)條件下具有向成骨細(xì)胞定向分化的潛能，相對(duì)其它成體干細(xì)胞，來源更豐富，臨床取材方便，分離純度更高，具有強(qiáng)大的增殖與自我更新能力，免疫原性較低，蘊(yùn)藏著比骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞更加優(yōu)越的臨床應(yīng)用價(jià)值[7, 8]，目前已廣泛應(yīng)用于脊髓神經(jīng)損傷、心肌梗死、軟骨組織缺損等領(lǐng)域的臨床應(yīng)用與實(shí)驗(yàn)研究[9, 10]。

OP患者常伴隨骨密度降低，骨強(qiáng)度減弱，骨折風(fēng)險(xiǎn)增加[11]。OPF的常發(fā)部位是腰椎、股骨頸等[12]。目前已有眾多藥物投入到臨床中用以O(shè)PF的治療，如雌激素類、雙膦酸鹽類、降鈣素及鈣制劑等，雖有療效，但往往存在著較大副作用，并且可能會(huì)影響骨組織礦化以及骨折愈合。通常情況下，OPF比正常骨量的骨折更難愈合。正常中年大鼠的股骨骨折一般在第8周即可形成完全包裹的骨痂，進(jìn)入骨痂重塑期。本實(shí)驗(yàn)我們以O(shè)PF大鼠模型作為研究對(duì)象，將PRP聯(lián)合hUC-MSCs分三次移植骨折部位，采用Micro CT動(dòng)態(tài)觀察愈合效果，結(jié)果顯示， PRP+成骨誘導(dǎo)組在第11周開始即進(jìn)入骨痂重塑期，而其他組別骨痂重塑期更加滯后，比正常骨量大鼠愈合時(shí)間至少推遲了37.5%。

骨體積分?jǐn)?shù)(BV/TV)是Micro CT掃描結(jié)果中的重要參數(shù)，它反應(yīng)了重建范圍內(nèi)骨量與整個(gè)骨組織的比值，通過BV/TV能觀察到不同時(shí)期骨量變化。正常骨折愈合過程主要分為3個(gè)階段：血腫機(jī)化期，原始骨痂形成期，骨痂改造期，在這三個(gè)階段中，BV/TV值呈上升趨勢(shì)。崔燎等在對(duì)小鼠骨折進(jìn)行治療過程中采用Micro CT監(jiān)測(cè)到隨時(shí)間增加BV/TV值升高[13]。本實(shí)驗(yàn)中，我們觀察到各組大鼠的骨折部位在血腫機(jī)化期和原始骨痂形成期BV/TV呈上升趨勢(shì)，但在進(jìn)入骨痂改造期后呈下降趨勢(shì)。這可能與動(dòng)物模型有關(guān)：因OP會(huì)導(dǎo)致雌激素分泌不足，破骨細(xì)胞活躍程度提高，在骨痂重建期相對(duì)于骨形成，骨吸收占優(yōu)勢(shì)，致使BV/TV的下降超過正常水平。

綜上所述，PRP聯(lián)合hUC-MSCs移植可促進(jìn)OPF愈合，但愈合的骨組織骨體積分?jǐn)?shù)并未提高，尚存在較大的再次骨折風(fēng)險(xiǎn)，如何提高骨體積分?jǐn)?shù)，從根本上治療OPF，還有待進(jìn)一步研究。