甜玉米單倍體誘導(dǎo)和加倍方法研究

姜　龍，南　楠，王薪淇，李向永，景桂昕，邢　政，趙仁貴

(1 吉林農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)學院，吉林 長春 130118； 2 東北師范大學 生命科學學院，吉林 長春 130024)

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甜玉米單倍體誘導(dǎo)和加倍方法研究

姜龍1，南楠2，王薪淇1，李向永1，景桂昕1，邢政1，趙仁貴1

(1 吉林農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)學院，吉林 長春 130118； 2 東北師范大學 生命科學學院，吉林 長春 130024)

[摘要]【目的】 探索單倍體誘導(dǎo)系在甜玉米單倍體育種中應(yīng)用的可能性及適宜的甜玉米單倍體誘導(dǎo)和加倍方法，為加快我國甜玉米育種進程、提高甜玉米育種效率奠定基礎(chǔ)?！痉椒ā?采用3個誘導(dǎo)系和4個甜玉米雜交種，設(shè)計4種秋水仙素化學加倍甜玉米單倍體的方法，對提高甜玉米單倍體誘導(dǎo)率和加倍率的方法進行比較研究?！窘Y(jié)果】 甜玉米單倍體誘導(dǎo)試驗表明，3個單倍體誘導(dǎo)系的誘導(dǎo)率有極顯著差異，其中以TY1的誘導(dǎo)率最高，為7.99%；4個甜玉米雜交種誘導(dǎo)率差異極顯著，以“綠色先鋒”的誘導(dǎo)率最高，為7.57%。秋水仙素加倍甜玉米單倍體試驗表明，浸芽法和針刺生長點法對植株傷害較嚴重，存活率低于50%；浸種法(0.5 mg/mL秋水仙素)和針刺生長點法(0.3 mg/mL秋水仙素)的散粉率較高(48.4%,28.9%)，相應(yīng)的結(jié)實率也較高(15.2%,11.1%)，說明浸種法處理效果最好，針刺生長點法次之?！窘Y(jié)論】 適宜的單倍體誘導(dǎo)和加倍方法能顯著提高甜玉米單倍體的育種效率。

[關(guān)鍵詞]甜玉米；單倍體誘導(dǎo)；單倍體加倍；育種效率

甜玉米(ZeamaysL.saccharata Sturt)又稱甜質(zhì)玉米，為玉米屬(ZeamaysL.)的一個亞種，是一種集果、蔬、飼、糧于一體的經(jīng)濟作物，具備嫩、脆、香、黏、甜的特點，素有“水果玉米”、“蔬菜玉米”之稱。甜玉米鮮穗可直接食用或用于加工，具有較高的營養(yǎng)價值，深受消費者青睞。我國甜玉米育種起步較晚，20世紀50年代從美國引進了一批甜玉米材料，開始了甜玉米育種的研究，但是因為一些原因研究中斷，之后于1968年成功培育出第一個甜玉米品種“北京白砂糖”[1]。20世紀80年代，中國農(nóng)業(yè)科學院作物研究所成功培育了一批甜玉米新品種，如“金穗1號”、“農(nóng)梅1號”、“甜玉2號”、“東甜2號”等[2]。20世紀90年代以來廣泛開展各項甜玉米育種項目，一定數(shù)量的新品種相繼問世[3]。但目前我國的甜玉米種質(zhì)資源仍較為匱乏，育種者對種質(zhì)資源了解程度不夠，對大量的種質(zhì)資源缺乏有效的鑒定、篩選和評價，從而導(dǎo)致甜玉米田間常規(guī)育種工作量大、組合組配盲目性高、育種效率比較低。

基于孤雌生殖誘導(dǎo)的單倍體技術(shù)可明顯縮短玉米選系時間，僅需2代即可獲得DH(Doubled Haploid)系。國內(nèi)外各大公司、科研院所和高等院校相繼開展了玉米DH育種，以加速玉米優(yōu)良自交系培育及新品種育成步伐，并應(yīng)用于玉米育種實踐。然而玉米DH育種受兩個因素所限制：一是難以獲得足夠數(shù)量的單倍體，即單倍體誘導(dǎo)率低，Stock6現(xiàn)僅為1.14%[4]；二是單倍體二倍化困難，即加倍率低，加倍率達10%以上尚很難實現(xiàn)[5-7]。目前關(guān)于普通玉米單倍體的人工化學加倍方法的研究較多[8-10]，其中秋水仙素對玉米種子、幼芽、花蕾、花粉和嫩枝都可產(chǎn)生誘變作用，應(yīng)用最為廣泛[11]。但關(guān)于采用單倍體技術(shù)選育甜玉米自交系，并應(yīng)用于甜玉米單倍體育種的相關(guān)研究卻罕見報道。鑒于此，本研究采用3個誘導(dǎo)系分別對東北地區(qū)推廣面積較大的“綠色先鋒”和“甜玉8號”以及吉林農(nóng)業(yè)大學特用玉米育種組選育的2個甜玉米雜交種進行雜交誘導(dǎo)，以獲得甜玉米單倍體，并通過設(shè)計4種秋水仙素化學加倍甜玉米單倍體的方式，進一步探討適宜的甜玉米單倍體加倍技術(shù)，通過對甜玉米單倍體育種的初步探索，以期為加快我國甜玉米育種的進程、提高甜玉米育種效率奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1供試材料

以3個單倍體誘導(dǎo)系TY1、TY2、TY3作父本，以東北地區(qū)推廣面積較大的甜玉米雜交種“綠色先鋒”和“甜玉8號”以及吉林農(nóng)業(yè)大學特用玉米育種組選育的甜玉米雜交種“吉甜188”、“吉甜99”為母本，進行雜交誘導(dǎo)。父母本名稱及血緣見表1。

表 1　甜玉米單倍體誘導(dǎo)所用父母本名稱及血緣Talbe 1　Names and consanguinities of the parents used in this study

1.2雜交誘導(dǎo)試驗

父母本于2013年12月種植于吉林農(nóng)業(yè)大學(三亞)作物育種基地，每個試驗材料種植2行，行距90 cm，密度為7.5萬株/hm2，采用隨機區(qū)組設(shè)計，3次重復(fù)。于母本吐絲后3～4 d進行雜交誘導(dǎo)，每個試驗材料10～20穗，收獲結(jié)實性好的果穗，自然風干后混合脫粒，進行單倍體的初步鑒定。根據(jù)Chase[12]提出的遺傳標記法對收獲的雜交種籽粒進行逐粒鑒定，即胚乳糊粉層呈現(xiàn)紫色標記、胚芽部位無色、胚面較小且凹陷較深的籽粒為準單倍體籽粒。根據(jù)雜交當代籽粒總粒數(shù)和準單倍體籽粒數(shù)，計算單倍體誘導(dǎo)率：

單倍體誘導(dǎo)率=(準單倍體籽粒數(shù)/誘導(dǎo)的總籽粒數(shù))×100%。

1.3加倍試驗

加倍藥劑為上海如吉生物試劑經(jīng)銷有限公司生產(chǎn)的秋水仙素原藥和2.5%二甲基亞砜(DMSO)。采取浸種法、浸芽法、浸根法、針刺生長點法4種處理方法，每種方法分3個質(zhì)量濃度梯度(0.1，0.3，和0.5 mg/mL)進行。

(1)浸種法。先將甜玉米種子清水浸泡10 h，然后用0.1，0.3，0.5 mg/mL秋水仙素溶液浸泡24 h，再用清水浸泡6.5 h，流水清洗1.5 h后播種。

(2)浸芽法。采用毛巾卷法催芽，當幼芽長約2 cm時用刀片將幼芽頂端胚芽鞘切掉1～2 mm，使之露出一個小口(但不要傷害到嫩芽)，將其在室溫下密閉浸泡在不同質(zhì)量濃度(0.1，0.3，0.5 mg/mL)的秋水仙素+2% DMSO溶液中，浸泡6.5 h，流水清洗1.5 h后播種在育苗盤中，待幼苗長到4～5片葉時移栽至大田。

(3)浸根法。將甜玉米單倍體種子在清水中浸泡6.5 h之后，置于27.5 ℃培養(yǎng)箱中催根，待幼苗長到2～3葉時，將其置于4 ℃冰箱中煉苗2～3 h，而后用自編的帶有小孔且上面覆有一層保濕濾紙的鐵絲網(wǎng)固定幼芽而將幼根浸泡于不同質(zhì)量濃度0.1，0.3，0.5 mg/mL的秋水仙素+2%DMSO溶液中，保持秋水仙素溶液漫過幼根生長點，浸泡6.5 h后，再用流水清洗1.5 h，然后移栽至大田。

(4)針刺生長點法。在田間長勢一致的甜單倍體幼苗長至6～7葉時，用微量移液器抽取5 μL的不同質(zhì)量濃度(0.1，0.3，0.5 mg/mL)秋水仙素+2%DMSO溶液注射于幼苗莖稈盾片節(jié)處的生長點。

加倍材料源于試驗1.2中雜交誘導(dǎo)產(chǎn)生的甜玉米單倍體，將準單倍體籽粒根據(jù)不同的秋水仙素加倍處理需求種植田間，去除非單倍體植株。田間觀察成活率、散粉率、結(jié)實率和藥害情況。以甜玉米單倍體植株是否散粉和結(jié)實來判斷其是否加倍成功。試驗于2014年5月在吉林農(nóng)業(yè)大學作物育種基地(長春)進行。成活率、散粉率、結(jié)實率采用以下公式進行計算：

成活率=(單倍體株數(shù)/單倍體籽粒數(shù))×100%；

散粉率=(散粉株數(shù)/單倍體總株數(shù))×100%；

結(jié)實率=(單倍體自交結(jié)實株數(shù)/單倍體總株數(shù))×100%。

1.4統(tǒng)計方法

利用Excel 2007和DPS 7.1軟件對試驗數(shù)據(jù)進行計算與分析[13]。

2結(jié)果與分析

2.1甜玉米雜交誘導(dǎo)試驗

2.1.1雜交誘導(dǎo)后誘導(dǎo)率的統(tǒng)計母本甜玉米雜交種經(jīng)父本誘導(dǎo)系雜交誘導(dǎo)后的誘導(dǎo)率見表2。由表2可知，單倍體誘導(dǎo)系TY1的平均誘導(dǎo)率最高，為7.99%；TY3的平均誘導(dǎo)率最低，為3.15%；3個單倍體誘導(dǎo)系間平均誘導(dǎo)率的差異達極顯著水平。表明單倍體誘導(dǎo)系TY1是一個較好的甜玉米單倍體誘導(dǎo)系。4個甜玉米雜交種經(jīng)誘導(dǎo)系誘導(dǎo)后，誘導(dǎo)率均值以“綠色先鋒”最高(7.57%)，極顯著高于“吉甜188”、“吉甜99”和“甜玉8號”；“吉甜188”和“吉甜99”間誘導(dǎo)率差異不顯著，但均極顯著高于“甜玉8號”。

表 2　3個誘導(dǎo)系誘導(dǎo)4個甜玉米雜交種的誘導(dǎo)率Talbe 2　Inducing rates of four sweet corn hybrids haploids by three haploid inducing lines　%

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

Note:Different lowercase letters indicate significant difference (P<0.05),while different uppercase letters indicate extremely significant difference (P<0.01).

2.1.2誘導(dǎo)率的方差分析及差異顯著性檢驗由表3可知，3個單倍體誘導(dǎo)系間、4個甜玉米雜交種間、不同誘導(dǎo)系對不同甜玉米雜交種的誘導(dǎo)率間差異均達極顯著水平，試驗中的區(qū)組間差異極顯著說明試驗設(shè)計達到了局部控制效果。

2.2甜玉米雜交種的加倍試驗

2.2.1不同加倍方法對甜玉米單倍體植株成活率的影響表4結(jié)果表明，采用不同的加倍處理方法時，隨著秋水仙素質(zhì)量濃度的增加，甜玉米單倍體植株的成活率整體均呈下降趨勢。其中浸根法中秋水仙素的適宜質(zhì)量濃度為 0.1 mg/mL (成活率為 74.5%)，針刺生長點法中秋水仙素的適宜質(zhì)量濃度為0.3 mg/mL(成活率為42.7%)。在每種質(zhì)量濃度下，浸芽法和針刺生長點法中的成活株數(shù)均較浸根法少，受害程度都較為嚴重，其中浸芽法在秋水仙素3種質(zhì)量濃度下的存活率分別僅為38.6%，38.6%和24.7%。

表 3　甜玉米雜交誘導(dǎo)率的方差分析Table 3　of Variance analysis of inducing rates of sweet corn

注：**表示差異達極顯著。

Note:** means extremely significant difference.

表 4　不同質(zhì)量濃度秋水仙素加倍處理時甜玉米單倍體的成活情況Table 4　Survival rates of sweet corn haploid plants at different colchicines concentrations

注：由于浸種后直接播種，故未統(tǒng)計浸種法的成活率。

Note:Due to direct sowing after dipping,there is no statistical survival rate for dipping seeds method.

2.2.2不同加倍方法對單倍體植株散粉和結(jié)實的影響不同質(zhì)量濃度秋水仙素加倍處理時甜玉米單倍體的散粉情況和結(jié)實情況見表5和表6。

表 5　不同質(zhì)量濃度秋水仙素加倍處理時甜玉米單倍體的散粉情況Table 5　Fertility rate of sweet corn haploid plants at different colchicines concentrations

表 6　不同質(zhì)量濃度秋水仙素加倍處理時甜玉米單倍體的結(jié)實情況Table 6　Seed rates of sweet corn haploids at different colchicine concentrations

由表5，6可知，在4種加倍方法中，浸種法的加倍效果最好，3種秋水仙素質(zhì)量濃度處理下的散粉率均超過10%，在秋水仙素質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL 時散粉率達到最高，為48.4%，此時結(jié)實率也最高，為15.2%。針刺生長點法在0.3 mg/mL秋水仙素處理下的散粉率為28.9%，結(jié)實率為11.1%；而浸根法和浸芽法的散粉率均低于10.8%，在秋水仙素質(zhì)量濃度為0.3和0.5 mg/mL時的結(jié)實率均在 1.2% 以下。由此可以看出，在散粉性和結(jié)實率方面，浸種法和針刺生長點法的加倍效果相對較好。

3討論

3.1甜玉米單倍體的誘導(dǎo)

雖然杜邦先鋒、孟山都等國際公司已經(jīng)大規(guī)模運用玉米DH育種技術(shù)實現(xiàn)了玉米種子的“工廠化”生產(chǎn)[14-15]，但在主要技術(shù)上仍存在嚴重缺陷。其中，單倍體誘導(dǎo)率低是限制玉米DH育種的瓶頸。吉林農(nóng)業(yè)大學以“吉高誘3號”為輪回親本，從中選育出誘導(dǎo)率在10%以上且遺傳標記明顯、花粉量大、持粉時間長、抗病性好的新型誘導(dǎo)系TY1～TY3。2013年，吉林農(nóng)業(yè)大學特用玉米育種組以玉米單倍體誘導(dǎo)系TY1～TY3為材料，研究了誘導(dǎo)系對不同甜玉米基因型材料的誘導(dǎo)效果，結(jié)果表明，TY1～TY3對甜玉米雜交種具有誘導(dǎo)產(chǎn)生單倍體的能力，該誘導(dǎo)系的育成，對甜玉米DH育種將有一定的促進作用。

從本試驗結(jié)果可以看出，3個供試誘導(dǎo)系對不同甜玉米雜交種的誘導(dǎo)率均存在極顯著差異，誘導(dǎo)率高的誘導(dǎo)系對不同遺傳背景材料的誘導(dǎo)率也顯著高于其他誘導(dǎo)系。因此，與普通玉米雜交種單倍體育種中選育高誘導(dǎo)率的誘導(dǎo)系相同，選育適合于甜玉米雜交種的高誘導(dǎo)率誘導(dǎo)系，對于提高甜玉米單倍體的育種效率非常重要。

3.2甜玉米單倍體的加倍

Chase[16]提出用秋水仙素溶液注射普通玉米幼苗的盾片節(jié)進行加倍。Gayen等[17]采用浸種法，使普通玉米單倍體加倍率達到了18%。魏俊杰等[18]在6葉期和拔節(jié)期用不同質(zhì)量濃度的秋水仙素配以DMSO注射處理普通玉米莖尖生長點，發(fā)現(xiàn)在6葉期以0.5%秋水仙素配以2.0% DMSO的處理效果最好，加倍率高達32.3%。

本試驗結(jié)果表明：浸芽法和針刺生長點法對玉米植株傷害較嚴重，存活率均低于50%；浸種法(0.5 mg/mL秋水仙素) 和針刺生長點法(0.3 mg/mL 秋水仙素) 的散粉率較高(48.4%，28.9%)，相應(yīng)的結(jié)實率也較高(15.2%，11.1 %)，說明浸種法處理效果最好，針刺生長點法次之。綜上可知，浸種法和針刺生長點法對甜玉米單倍體的加倍效果較好，散粉率和結(jié)實率相對較高。

敬成俊等[19]研究表明，秋水仙素加倍作用是通過其與幼嫩組織正在分裂的細胞接觸，引起紡錘絲立刻縮減并且在結(jié)構(gòu)上也發(fā)生變化，細胞整齊地被阻止在分裂中期，從而使重組核具有加倍的染色體數(shù)。而且其還通過在植物組織中迅速擴散及使維管系統(tǒng)在植物體內(nèi)運轉(zhuǎn)，使植株組織加倍效果達到長效的目的。若將秋水仙素長期作用于植物組織，會破壞植物組織的正常生理環(huán)境，進而會使植物的生長發(fā)育產(chǎn)生異常表現(xiàn)。但由于處理方法不同，對植物所造成的傷害也可能不同。為了規(guī)避上述問題，本課題組提出在甜玉米單倍體的浸根法和浸芽法加倍處理中，應(yīng)該降低秋水仙素的質(zhì)量濃度以減小藥害，同時浸根法中應(yīng)該嘗試處理側(cè)根以使植株移栽到大田后能繼續(xù)吸收水分和營養(yǎng)物質(zhì)，而采用針刺生長點法時應(yīng)注意在注射完后，多澆水并做好田間管理以增加植株存活率。

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DOI：網(wǎng)絡(luò)出版時間:2016-06-0816:2110.13207/j.cnki.jnwafu.2016.07.014

[收稿日期]2014-11-19

[基金項目]國家星火計劃項目(2011GA660005)；吉林省財政廳科研育種項目(吉財2012002)；長春市科技支撐計劃項目(長科技合2011215號)

[作者簡介]姜龍(1988-)，男，吉林農(nóng)安人，博士，主要從事玉米種質(zhì)資源創(chuàng)新與DH育種研究。 E-mail:jianglong335@sina.com [通信作者]趙仁貴(1966-)，男，吉林松原人，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事特用玉米遺傳育種與新品種選育研究。 E-mail:zhaorengui@sina.com

[中圖分類號]S513.033

[文獻標志碼]A

[文章編號]1671-9387(2016)07-0095-06

Haploid inducing and doubling methods for sweet corn

JIANG Long1,NAN Nan2,WANG Xinqi1,LI Xiangyong1,JING Guixin1,XING Zheng1,ZHAO Rengui1

(1CollegeofAgronomy,JilinAgriculturalUniversity,Changchun,Jilin130118,China;2SchoolofLifeSciences,NortheastNormalUniversity,Changchun,Jilin130024,China)

Abstract:【Objective】 The possibility of applying inducing lines in breeding of sweet corn haploids and suitable methods for sweet corn haploids doubling were investigated to accelerate the breeding process and improve the breeding efficiency of sweet corn in China.【Method】 Three inducing lines and four hybrids were used to set four colchicine doubling methods.The results on improving inducing rate and doubling rate of sweet corn haploids were compared.【Result】 The inducing rates of three inducing lines were extremely significantly different with the highest value of 7.99% for TY1.The inducing rates of four sweet corn hybrids were also extremely significantly different with the highest values of 7.57% for Lüsexianfeng.Of the four haploid colchicine doubling treatments (dipping seeds,roots,buds and acupuncturing growing point),the plant survival rates of dipping buds method and acupuncturing growing point method were lower than 50%.Doubling frequencies of dipping seeds method at 0.5 mg/mL colchicine and acupuncturing growing point method at 0.3 mg/mL colchicine performed better,with the fertile plants rates of 48.4% and 28.9% and plants seeding rates of 15.2% and 11.1%,respectively.Dipping seeds method was the best followed by acupuncturing growing point method in chromosome doubling.【Conclusion】 Suitable inducing and doubling methods could improve sweet corn breeding efficiency.

Key words:sweet corn;haploid induction;haploid doubling;breeding efficiency

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