異種源性脫細(xì)胞神經(jīng)支架修復(fù)坐骨神經(jīng)損傷后再生的可行性*

陳少紅季婉青侯博

異種源性脫細(xì)胞神經(jīng)支架修復(fù)坐骨神經(jīng)損傷后再生的可行性*

陳少紅①季婉青②侯博③

【摘要】目的：評(píng)價(jià)異種脫細(xì)胞神經(jīng)支架修復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)損傷的療效。方法：以兔源性脛神經(jīng)為原材料，通過(guò)萃取技術(shù)制備脫細(xì)胞神經(jīng)支架；HE染色、甲苯胺藍(lán)染色、免疫組化（IHC）、掃描電鏡（SEM）、透射電鏡（TEM）檢測(cè)技術(shù)評(píng)價(jià)脫細(xì)胞效果；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)部分采用坐骨神經(jīng)離斷模型，按照移植物的不同，將SD大鼠隨機(jī)分為兩組：異種神經(jīng)支架移植組（實(shí)驗(yàn)組）、自體神經(jīng)移植組（對(duì)照組），術(shù)后12周內(nèi)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)大鼠外周血中CD3+、CD4+、CD8+淋巴細(xì)胞含量，以判定機(jī)體免疫系統(tǒng)情況；通過(guò)神經(jīng)功能測(cè)定及形態(tài)學(xué)手段評(píng)價(jià)10 mm缺損神經(jīng)的修復(fù)效果。結(jié)果：支架內(nèi)的細(xì)胞和髓鞘成分能夠徹底去除，基底膜管狀結(jié)構(gòu)保留較為完整。術(shù)后1、4、12周時(shí)間點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)組大鼠外周血CD3+、CD4+、CD8+淋巴細(xì)胞含量與對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。4周及12周后，兩組坐骨神經(jīng)功能指數(shù)（SFI）比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；實(shí)驗(yàn)組移植物內(nèi)的再生軸突數(shù)量、再生髓鞘厚度方面與對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論：異種神經(jīng)脫細(xì)胞支架干預(yù)10 mm大鼠坐骨神經(jīng)缺損，并不會(huì)引起機(jī)體系統(tǒng)性排斥反應(yīng)，同時(shí)能夠有效促進(jìn)損傷神經(jīng)再生。

【關(guān)鍵詞】異種； 細(xì)胞外基質(zhì)； 支架； 神經(jīng)再生； 免疫排斥反應(yīng)

First-author’s address：Clinic Department of the People’s Government of Guangdong Province，Guangzhou 510030，China

外周神經(jīng)損傷后，自體神經(jīng)移植是治療的“金標(biāo)準(zhǔn)”［1］，但因其來(lái)源匱乏，需要二次手術(shù)以及尺寸難以匹配等問(wèn)題，極大地限制該種治療的臨床應(yīng)用和推廣［2］。因此探尋一種安全、有效且易獲取的神經(jīng)替代物就顯得尤為重要。異種神經(jīng)脫細(xì)胞支架來(lái)源于其他物種的細(xì)胞外基質(zhì)，除了具有天然細(xì)胞基質(zhì)的性質(zhì)外，最大的優(yōu)點(diǎn)是該類支架取材方便，支架的尺寸大小可任意選取［3］。但基于物種間的差異，該類材料的安全性及有效性仍需進(jìn)一步探討。本實(shí)驗(yàn)中，筆者利用兔的脛神經(jīng)制取脫細(xì)胞神經(jīng)支架，嘗試修補(bǔ)大鼠10 mm坐骨神經(jīng)缺損。術(shù)后12周內(nèi)評(píng)估神經(jīng)修復(fù)效果，以期尋找一種較為理想的神經(jīng)修補(bǔ)材料。

1 材料與方法

1.1 材料 硫代甜菜堿10（SB-10），硫代甜菜堿16（SB-16），TritonX-200（均購(gòu)自Sigma aldrich公司），過(guò)氧乙酸（Adamas-Beta），α-MEM（Gibco）、南美血清（Gibco），一抗：層粘連蛋白（LN）抗體（Rabbit anti-Laminin Sigma aldrich L9393；1∶800），纖維粘連蛋白（FN）抗體（Rabbit anti-Fibronectin Abcam ab23751；1∶500），神經(jīng)絲蛋白-200（NF-200） 抗 體（Rabbit anti-neurofilament 200 Sigma aldrich N4142；1∶2000），anti-Rat CD3 PE（eBioscience 17-0030；1∶100），anti-Mou CD4 APC（invitrogen MR5105；1∶200），anti-Rat CD8a FITC（eBioscience 11-0084；1∶50），Alex flour 488 anti-rabbit（Jackson 711-545-152；1：1000），Alex flour 594 anti-rabbit （Jackson 111-585-003；1∶1500），Real Envision二抗檢測(cè)試劑盒（上?；蚬荆?；搖床（江蘇金壇），離心機(jī)（上海飛鴿），光學(xué)顯微鏡（Nikon-eclipse 80i，日本），透射電鏡（FEI TECNAI SPIRIT G2香港），掃描電鏡（FEI QUANTA 200，香港），冰凍切片機(jī)（Leica M750），解剖顯微鏡（Leica），超薄切片機(jī)（Leica）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 本研究所涉及新西蘭成年兔及SD大鼠均由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供［（使用許可證編號(hào)：SYXK（粵）2012-0083）］，并由中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。健康新西蘭成年兔3只，雌雄不限，體質(zhì)量3～3.5 kg，用于獲取制備脫細(xì)胞支架的原材料；健康成年SD大鼠30只，雌雄不限，體量250～280 g，利用完全隨機(jī)分組法將動(dòng)物分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組15只。手術(shù)過(guò)程于中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院神經(jīng)外科顱底實(shí)驗(yàn)室完成。

1.3 方法

1.3.1 兔源性脫細(xì)胞神經(jīng)支架的制備方案和檢測(cè)方法 分離兔兩側(cè)脛神經(jīng)，手術(shù)顯微鏡下剝離表面的脂肪組織和血管，游離神經(jīng)組織。按照下列步驟制備神經(jīng)支架：（1）去離子水中浸泡6 h，期間換液3次；（2）將神經(jīng)浸入125 mmol/L SB-10中，室溫震蕩12 h（90 r/min），去離子水漂洗3 h（0.5 h換液1次）；（3）0.14%TritonX 200和0.16 mmol/L SB-16混合溶液中室溫振蕩24 h，去離子水漂洗3 h（0.5 h換液1次）；（4）重復(fù)1～3步驟；（5）經(jīng)上述處理過(guò)的神經(jīng)于體積分?jǐn)?shù)0.1%的過(guò)氧乙酸消毒6 h，無(wú)菌蒸餾水充分漂洗后，置于無(wú)菌PBS中4 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 支架形態(tài)學(xué)檢測(cè) HE染色檢測(cè)脫細(xì)胞效果；LN（1∶800）、FN（1∶500）免疫組化染色證實(shí)支架的成分和結(jié)構(gòu)；甲苯胺藍(lán)染色及透射電鏡檢測(cè)髓鞘去除程度；掃描支架觀察支架內(nèi)部結(jié)構(gòu)；NF-200免疫染色顯示軸突去除情況。

1.3.3 外周血淋巴細(xì)胞亞群分析 術(shù)前及術(shù)后1、4、12周，兩組大鼠通過(guò)尾靜脈分別收集外周血500 μL于抗凝管中。按照以下步驟進(jìn)行流式檢測(cè)：（1）新鮮抗凝血，按1∶10的比例向抗凝管中加入紅細(xì)胞裂解液，輕輕吹打混勻，1100 r/min離心4 min后棄上清。繼以Buffer溶液重懸。（2）按合適濃度加入抗體（CD3-PE；1∶50、CD4-APC；1∶200、CD8-FITC；1∶50），避光孵育30 min。（3）每樣品管加入1.5～2 mL Buffer溶液，1100 r/min離心4 min后棄去上清。（4）每樣品管加入300 μL Buffer溶液重懸，上機(jī)檢測(cè)（BD FACS Calibur流式細(xì)胞儀）。1.3.4 造模方法 大鼠麻醉后（戊巴比妥鈉；腹腔注射），暴露右側(cè)坐骨神經(jīng)，造成10 mm長(zhǎng)的神經(jīng)缺損。（1）實(shí)驗(yàn)組：在解剖顯微鏡下（25倍視野），利用8-0尼龍線將支架與宿主的神經(jīng)外膜縫合。（2）對(duì)照組：相同解剖位置切取10 mm長(zhǎng)的坐骨神經(jīng)后，將其翻轉(zhuǎn)后再吻合于原處，術(shù)后青霉素肌肉注射于手術(shù)切口周圍，預(yù)防感染。所有動(dòng)物均在標(biāo)準(zhǔn)條件下飼養(yǎng)。

1.4 術(shù)后神經(jīng)再生評(píng)價(jià) 術(shù)后1、2、4、12周對(duì)各組動(dòng)物進(jìn)行坐骨神經(jīng)功能指數(shù)（Sciatic nerve function index，SFI）評(píng)價(jià)：設(shè)計(jì)長(zhǎng)約1 m暗箱通道，鋪以記錄紙張，予大鼠雙側(cè)后腳涂墨水，驅(qū)趕其穿過(guò)通道，行走后，記錄紙上留有足印。每次取5～6對(duì)足印進(jìn)行以下測(cè)量：足印長(zhǎng)度（PLF）、足距寬度（TSF）、中間足趾寬度（ITF）；SFI=-38.3 PLF+109.5 TSF+13.3 ITF-8.8。SFI為0代表功能正常，-100代表功能完全喪失。12周后將移植物取出后行以下處理：40 g/L多聚甲醛溶液固定、脫水、包埋、切片（5 μm），NF-200（1∶2000）免疫組化觀察軸突生長(zhǎng)情況；2.5 mL/L戊二醛前固定，10 mL/L鋨酸后固定，下行脫水后環(huán)氧樹(shù)脂包埋、聚合、半薄切片行甲苯胺藍(lán)染或經(jīng)醋酸鈾-檸檬酸鉛雙染后行透射電鏡檢測(cè)，Imagine-pro plus 6.0軟件分析再髓鞘化神經(jīng)纖維的數(shù)量，髓鞘的厚度，軸突的直徑大小。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以（±s）表示，比較行重復(fù)測(cè)量資料的方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 手術(shù)傷口觀察 所有動(dòng)物一般狀況良好，手術(shù)側(cè)肢體均有不同程度的趾甲萎縮，腳墊出現(xiàn)潰瘍?cè)趯?shí)驗(yàn)組有2只，對(duì)照組有1只。術(shù)后12周，重新暴露手術(shù)區(qū)，移植物與周圍組織均有輕度粘連，兩組動(dòng)物均未發(fā)現(xiàn)有移植物皺縮或崩解。

2.2 支架形態(tài)學(xué)檢測(cè) HE染色顯示細(xì)胞核完全去除（圖1A）；甲苯胺藍(lán)染色及透射電鏡顯示致密的髓鞘結(jié)構(gòu)完全去除（圖1B、D）；超微結(jié)構(gòu)有輕微的變形，基底膜保留較為完整（箭頭所示）；掃描電鏡顯示支架內(nèi)部為多孔狀立體通道結(jié)構(gòu)（圖1C）；熒光免疫證實(shí)支架成分富含纖維粘連蛋白（圖1E）及層粘連蛋白（圖1F）；與正常神經(jīng)（圖1G）相比，支架內(nèi)部軸突神經(jīng)絲蛋白（圖1H）已經(jīng)完全去除。

2.3 外周淋巴細(xì)胞亞群分析結(jié)果 淋巴細(xì)胞亞群分析結(jié)果顯示，與術(shù)前相比，術(shù)后第1周，兩組大鼠外周血內(nèi)CD3+、CD4+淋巴細(xì)胞及CD4+/CD8+均有不同程度升高，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；術(shù)后第4周CD3+、CD4+淋巴細(xì)胞及CD4+/CD8+較之前有所下降；術(shù)后第12周，兩組大鼠上述變量基本降至術(shù)前水平，比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。術(shù)后1、4、12周時(shí)間點(diǎn)，兩組間大鼠外周血CD3、CD4+、CD8+淋巴細(xì)胞含量比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1～4。

圖1 異種來(lái)源的神經(jīng)支架形態(tài)學(xué)檢測(cè)

表1 兩組術(shù)前外周淋巴細(xì)胞亞群分析（±s）

表1 兩組術(shù)前外周淋巴細(xì)胞亞群分析（±s）

組別 CD3+（%） CD4+（%） CD8+（%） CD4+/CD8+實(shí)驗(yàn)組（n=15）72.55±3.11 56.42±4.23 42.01±3.19 1.54±0.27對(duì)照組（n=15）69.47±4.78 55.34±3.38 40.84±4.55 1.49±0.14 F值 0.68 1.33 0.21 11.46 P值 0.78 0.56 0.34 0.71

表2 兩組術(shù)后1周外周淋巴細(xì)胞亞群分析（±s）

表2 兩組術(shù)后1周外周淋巴細(xì)胞亞群分析（±s）

組別 CD3+（%） CD4+（%） CD8+（%） CD4+/CD8+實(shí)驗(yàn)組（n=15）79.32±4.12 61.42±6.13 35.75±3.19 2.14±0.41對(duì)照組（n=15）76.34±6.47 59.71±4.21 32.55±3.28 1.99±0.32 F值 0.77 0.91 1.56 7.32 P值 0.19 0.27 0.73 0.44

表3 兩組術(shù)后4周外周淋巴細(xì)胞亞群分析（±s）

表3 兩組術(shù)后4周外周淋巴細(xì)胞亞群分析（±s）

組別 CD3+（%） CD4+（%） CD8+（%） CD4+/CD8+實(shí)驗(yàn)組（n=15）73.33±2.23 55.41±3.73 40.13±5.56 1.63±0.23對(duì)照組（n=15）74.57±4.55 53.34±6.22 42.27±3.98 1.53±0.39 F值 0.79 1.49 1.21 9.88 P值 0.69 0.81 0.18 0.38

表4 兩組術(shù)后12周外周淋巴細(xì)胞亞群分析（±s）

表4 兩組術(shù)后12周外周淋巴細(xì)胞亞群分析（±s）

組別 CD3+（%） CD4+（%） CD8+（%） CD4+/CD8+實(shí)驗(yàn)組（n=15）69.19±5.67 57.45±5.61 39.01±3.19 1.48±0.38對(duì)照組（n=15）67.77±2.84 53.57±6.11 41.73±3.36 1.55±0.22 F值 1.67 0.56 0.33 5.21 P值 0.30 0.47 0.55 0.18

2.4 功能評(píng)價(jià) 12周恢復(fù)期內(nèi)，兩組大鼠均有不同程度的功能恢復(fù)。術(shù)后第1周，各組SFI值均在-98左右，2周后兩組均有不同程度升高；4周及12周后，實(shí)驗(yàn)組SFI分別為（-90.6±2.8）、（-82.6±1.4），對(duì)照組分別為（-87.7±3.5）、（-77.8±1.5），兩組4周及12周SFI值比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)圖2。

圖2 術(shù)后12周內(nèi)兩組SFI評(píng)價(jià)

2.5 軸突及髓鞘再生評(píng)價(jià) 術(shù)后12周，重新暴露手術(shù)區(qū)，移植物與周圍組織均有輕度粘連（圖3A）；實(shí)驗(yàn)組移植物內(nèi)有NF-200陽(yáng)性軸突通過(guò)（圖3B），軸突呈現(xiàn)極性排列，與支架縱行絲狀結(jié)構(gòu)伴行，與遠(yuǎn)端神經(jīng)內(nèi)軸突形成聯(lián)系，但離遠(yuǎn)端縫線1.5 cm處遠(yuǎn)處，軸突數(shù)量變少，直徑變細(xì)（圖3C）。甲苯胺藍(lán)染色及TEM評(píng)價(jià)（圖4）：實(shí)驗(yàn)組移植物內(nèi) 再生軸突數(shù)量（圖4C、D、E）每一個(gè)高倍鏡視野（1000倍）下為（80±7）個(gè)，但與對(duì)照組（80±5）個(gè)（圖4A、B、E）比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；移植物內(nèi)再生髓鞘厚度方面（圖4F），實(shí)驗(yàn)組為（0.53±0.12）μm，與對(duì)照組（0.52±0.08）μm比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖3 NF-200熒光染色顯示實(shí)驗(yàn)組軸突再生情況（術(shù)后12周內(nèi)）

圖4 術(shù)后12周甲苯胺藍(lán)及投射電鏡下觀察大鼠移植物內(nèi)軸突再生情況

3 討論

近年來(lái)，組織工程技術(shù)在神經(jīng)修復(fù)領(lǐng)域的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，脫細(xì)胞神經(jīng)支架的研究也逐步走向臨床階段，雖然其促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)的效果受到諸多學(xué)者的認(rèn)可，但是來(lái)源匱乏直接影響其日后在臨床上的應(yīng)用［4-5］。同種異體神經(jīng)支架一般來(lái)源于截肢的肢體或者尸體，和自體移植相比有諸多優(yōu)勢(shì)，但是由于某些社會(huì)習(xí)俗和宗教因素的影響，原材料的獲取受到很大限制，因此需要尋找一種更加方便、有效的神經(jīng)替代物。

去細(xì)胞支架來(lái)源于天然外周神經(jīng)組織，經(jīng)過(guò)處理，去除大部分抗原成分比如細(xì)胞和髓鞘成分，而保留完整的細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)（ECM），研究表明ECM能夠?yàn)樵鲋车难┩霞?xì)胞（SC）提供黏附和導(dǎo)向支持，這對(duì)后續(xù)形成bunger帶至關(guān)重要，同時(shí)也為軸突再生鋪平道路［6-9］；另一方面研究認(rèn)為ECM富含很多蛋白，像膠原蛋白（CollagenⅠ及Ⅳ型），纖維粘連蛋白（Fibronectin，F(xiàn)N），層粘連蛋白（Laminin，LN）等。這些成分通過(guò)影響軸突的再生速度和方向來(lái)左右神經(jīng)再生的效果［10-11］。通過(guò)處理及后期檢測(cè)，筆者制備的去細(xì)胞神經(jīng)支架細(xì)胞及髓鞘成分完全去除，基底膜結(jié)構(gòu)保存完整，富含LN、FN成分。

對(duì)異種移植物的應(yīng)用最大的憂慮就是其生物安全性。理論上來(lái)說(shuō)，利用萃取方法可以完全去除抗原成分，但實(shí)際上操作起來(lái)異常困難。有實(shí)驗(yàn)表明通過(guò)常見(jiàn)的萃取技術(shù)制備的去細(xì)胞支架依然可以檢測(cè)到300 bp殘余的DNA［12-13］，但此殘余量理論上不足以導(dǎo)致嚴(yán)重的排斥反應(yīng)，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，實(shí)際DNA殘余量遠(yuǎn)低于上述水平［14］。另外有觀點(diǎn)認(rèn)為在哺乳動(dòng)物各物種間，ECM氨基酸的組成順序具有高度一致性［15-16］，這也是異種ECM不會(huì)引發(fā)排斥反應(yīng)的重要原因之一；ECM成分所誘導(dǎo)的宿主淋巴細(xì)胞反應(yīng)通過(guò)Th1和Th2這兩種途徑，前者和促炎因子有關(guān)，介導(dǎo)組織免疫排斥；后者抑制炎癥的產(chǎn)生，介導(dǎo)免疫耐受。有實(shí)驗(yàn)證明異種細(xì)胞外基質(zhì)成分所涉及到的反應(yīng)僅限于Th2途徑［17］。這些理論是異種脫細(xì)胞支架體內(nèi)應(yīng)用的強(qiáng)有力支持。在未給予免疫抑制劑的情況下，本實(shí)驗(yàn)中所有動(dòng)物均沒(méi)有發(fā)現(xiàn)全身性免疫排斥反應(yīng)。雖然移植術(shù)后1周時(shí)，實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物外周血CD4/CD8比例有所提高，但考慮為手術(shù)切口局部炎癥反應(yīng)造成。動(dòng)態(tài)分析在第4周和12周，該比例逐漸下降至術(shù)前水平。這些變化同時(shí)發(fā)生在對(duì)照組中，兩組結(jié)果比較差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），這證實(shí)兔源性異種神經(jīng)支架移植到體內(nèi)并未干擾大鼠機(jī)體的免疫系統(tǒng)。

目前外周神經(jīng)支架有多種商業(yè)化產(chǎn)品，大部分為人工合成材料（PLGA，殼聚糖等）構(gòu)成。因缺乏生物活性，修復(fù)效果欠佳；形狀及尺寸較單一，很難保證個(gè)體化匹配［18］，臨床應(yīng)用價(jià)值還有待提高。脫細(xì)胞神經(jīng)支架可能能夠解決上述顧慮，但該類支架臨床應(yīng)用較少，縱然近年來(lái)很多數(shù)據(jù)證實(shí)其臨床應(yīng)用的價(jià)值［19-20］，但原材料的來(lái)源依然是個(gè)不容忽視的問(wèn)題，因此異種脫細(xì)胞神經(jīng)支架的價(jià)值就顯得更為突出。在本實(shí)驗(yàn)中，筆者使用兔來(lái)源的神經(jīng)支架修復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)缺損，取得較為理想的效果，這證實(shí)異種支架具有良好生物安全性及作用有效性。極有可能將來(lái)廣泛應(yīng)用到臨床。雖然其他物種間未測(cè)試，但是本研究結(jié)果為異種脫細(xì)胞材料的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)參考。

綜上所述，本研究認(rèn)為，兔源性脫細(xì)胞神經(jīng)支架修復(fù)大鼠10 mm長(zhǎng)的神經(jīng)缺損，能夠達(dá)到自體移植修復(fù)水平，同時(shí)并未引起明顯的全身性排斥反應(yīng)，表明具有較為安全的生物學(xué)特性，為異種脫細(xì)胞神經(jīng)移植物將來(lái)應(yīng)用到臨床提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

［1］ Piccoli M，Urbani L，Alvarezfallas M E，et al.Improvement of diaphragmatic performance through orthotopic application of decellularized extracellular matrix patch［J］.Biomaterials，2015，74（4）：245-255.

［2］ Gu X，Ding F，Yang Y，et al.Construction of tissue engineered nerve grafts and their application in peripheral nerve regeneration［J］.Prog Neurobiol，2011，93（2）：204-230.

［3］ Badylak S F.Xenogeneic extracellular matrix as a scaffold for tissue reconstruction［J］.Transpl Immunol，2004，12（3-4）：367-377.

［4］ Gilbert T W，Sellaro T L，Badylak S F.Decellularization of tissues and organs［J］.Biomaterials，2006，27（19）：3675-3683.

［5］ Zhu S，Liu J，Zheng C，et al.Analysis of human acellular nerve allograft reconstruction of 64 injured nerves in the hand and upper extremity：a 3 years follow-up study［J］.J Tissue Eng Regen Med，2016，21（4）2130.

［6］ Navarro X，Vivo M，Valero-Cabre A.Neural plasticity after peripheral nerve injury and regeneration［J］.Prog Neurobiol， 2007，82（4）：163-201.

［7］ Hoben G，Yan Y，Iyer N， et al.Comparison of acellular nerve allograft modification with Schwann cells or VEGF［J］.Hand （N Y），2015，10（3）：396-402.

［8］ Luckenbill-Edds L.Laminin and the mechanism of neuronal outgrowth［J］.Brain Res Brain Res Rev，1997，23（1-2）：1-27.

［9］ Gilbert T W，F(xiàn)reund J M，Badylak S F.Quantification of DNA in biologic scaffold materials［J］.J Surg Res，2009，152（1）：135-139.

［10］ 侯博，李文勝，秦峰，等.改良萃取法制備脫細(xì)胞神經(jīng)支架的去髓鞘效果評(píng)價(jià)［J］.中山大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)科學(xué)版），2012，33（3）：322-325.

［11］ Allman A J，Mcpherson T B，Badylak S F，et al.Xenogeneic extracellular matrix grafts elicit a TH2-restricted immune response［J］.Transplantation，2001，71（11）：1631-1640.

［12］ Isaacs J，Browne T.Overcoming short gaps in peripheral nerve repair：conduits and human acellular nerve allograft［J］.Hand （N Y），2014，9（2）：131-137.

［13］ Junka R，Yu X.Novel acellular scaffold made from decellularized schwann cell sheets for peripheral nerve regeneration［J］.Regen Eng Transl Med，2015，1（1）：22-31.

［14］ Hu M，Xiao H，Niu Y， et al.Long-term follow-up of the repair of the multiple-branch facial nerve defect using acellular nerve allograft［J］.J Oral Maxillofac Surg，2016，74（1）：211-218.

［15］ Boecker A H，van Neerven S G，Scheffel J，et al.Predifferentiation of mesenchymal stromal cells in combination with a microstructured nerve guide supports peripheral nerve regeneration in the rat sciatic nerve model［J］.Eur J Neurosci，2016，43（3）：404-416.

［16］ Grochmal J，Midha R.Recent advances in stem cell-mediated peripheral nerve repair［J］.Cells Tissues Organs，2014，200 （1）：13-22.

［17］ Hsu S H，Chan S H， Chiang C M，et al.Peripheral nerve regeneration using a microporous polylactic acid asymmetric conduit in a rabbit long-gap sciatic nerve transection model［J］.Biomaterials，2011，32（15）：3764-3775.

［18］ Zhe Z，Jun D，Yang Z，et al.Bladder acellular matrix grafts seeded with adipose-derived stem cells and incubated intraperitoneally promote the regeneration of bladder smooth muscle and nerve in a rat model of bladder augmentation［J］.Stem Cells Dev，2016，25（5）：405-414.

［19］ Zhang Y，Zhang H，Katiella K，et al.Chemically extracted acellular allogeneic nerve graft combined with ciliary neurotrophic factor promotes sciatic nerve repair［J］.Neural Regen Res，2014，9（14）：1358-1364.

［20］ Junka R，Yu X.Novel Acellular scaffold made from decellularized schwann cell sheets for peripheral nerve regeneration［J］.Regen Eng Transl Med，2015，1（1）：22-31.

①?gòu)V東省人民政府機(jī)關(guān)門診部 廣東 廣州 510030

②廣州市婦女兒童醫(yī)療中心

③中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.20.007

收稿日期：（2016-06-01） （本文編輯：蔡元元）

*基金項(xiàng)目：廣東省自然科學(xué)基金（2014A030313189，2014A030310408）；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2014A020211013，2015A020212016，2016A020214007）

通信作者：侯博

The Feasibility of Xenogeneic Acellular Nerve Scaffold to Repair Rat Sciatic Nerve Defect Regeneration/CHEN Shao-hong，JI Wan-qing，HOU Bo.//Medical Innovation of China，2016，13 （20）：027-032

【Abstract】Objective：To evaluate remodeling effect of xenogeneic acellular nerve scaffold in a rat sciatic nerve defect model.Method：Scaffolds derived from rabbit tibial nerves were processed by extractive method，and results were monitored by HE，toluidine blue，immunohistochemistry， SEM，TEM.SD rats were randomly divided into two groups：xenogeneic acellular nerve scaffold group（experimental group） and autograft （control group）group.During 12 weeks postoperatively，the amount of CD3+，CD4+，CD8+in blood were measured to evaluate the systematic immunologic function.Regenerative results were determined by SFI test，and histological examination.Result：Cell component and myelin sheath were completely removed and intact basal lumina tubes were persistent.During observation，all animals had no sign of immunological rejection systematically，grafts bridged well without any disintegration.In the experimental group，the amount of CD3+，CD4+，CD8+in blood were not different with the control groups at 1，4，12 weeks postoperatively（P＞0.05）.Statistical analysis revealed that experimental group had no statistically significant differences between the experimental group and control group on aspect of SFI at 4，12 weeks（P＞0.05）.There had no statistically significant differences between the experimental group and control group on axon number and myelin sheath depth（P＞0.05）.Conclusion：Xenogeneic acellular nerve scaffold may be a promising approach in repairing peripheral nerve defect.

【Key words】Xenogeneic； Extracellular matrix； Scaffold； Nerve regeneration； Immunological rejection