不同水平蛋白質(zhì)底物對豬結(jié)腸微生物體外發(fā)酵特性和菌體合成能力的影響

葛　婷　孫巍巍　朱偉云

(江蘇省消化道營養(yǎng)與動物健康重點實驗室，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)消化道微生物研究室，南京210095)

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不同水平蛋白質(zhì)底物對豬結(jié)腸微生物體外發(fā)酵特性和菌體合成能力的影響

葛婷孫巍巍朱偉云*

(江蘇省消化道營養(yǎng)與動物健康重點實驗室，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)消化道微生物研究室，南京210095)

摘要：本試驗旨在體外條件下，探究不同水平蛋白質(zhì)底物對豬結(jié)腸微生物發(fā)酵特性的影響，了解豬結(jié)腸微生物對蛋白質(zhì)的利用規(guī)律。以成年豬結(jié)腸內(nèi)容物為微生物接種物，在結(jié)腸微生物發(fā)酵液中分別添加0(C組)、0.10(L組)、0.25 g/L(H組)酪蛋白水解物，厭氧發(fā)酵不同時間點(3、6、9、12、18、24 h)，分別測定累積產(chǎn)氣量、pH及微生物蛋白、氨態(tài)氮、揮發(fā)性脂肪酸濃度。結(jié)果顯示：1)發(fā)酵3、6 h時，L組和H組pH顯著低于C組(P<0.05)。2)L組和H組累積產(chǎn)氣量均高于C組。3)L組和H組各時間點微生物蛋白濃度均顯著高于C組(P<0.05)，6 h時H組又顯著高于L組(P<0.05)。3)L組和H組各時間點氨態(tài)氮濃度均顯著高于C組(P<0.05)。4)短鏈脂肪酸和支鏈脂肪酸濃度隨著發(fā)酵時間延長而增加，同時隨著蛋白質(zhì)水平增加而增加。由此可見，蛋白質(zhì)底物的添加促進了腸道微生物菌體合成，但是過多的蛋白質(zhì)底物水平并不能進一步提高微生物蛋白濃度；隨著蛋白質(zhì)水平增加，腸道微生物發(fā)酵特性進一步提高。

關(guān)鍵詞：蛋白質(zhì)水平；豬；結(jié)腸微生物；發(fā)酵特性；菌體合成能力

現(xiàn)代化養(yǎng)豬模式常因為糞尿及氣體等排泄物的排放造成環(huán)境污染問題，這一現(xiàn)象已引起社會廣泛關(guān)注。豬排泄物中含氮化合物的排放一方面浪費飼糧中氮源，另一方面形成污染源，其中含氮氣體的釋放會影響豬及飼養(yǎng)人員健康[1]。豬排泄物中的含氮化合物主要來源于飼糧中未消化的蛋白質(zhì)和內(nèi)源性含氮化合物。飼糧蛋白質(zhì)大部分在胃和小腸消化吸收。隨著飼糧中蛋白質(zhì)添加水平的增加，消化道中未被前腸消化吸收的蛋白質(zhì)經(jīng)過水解作用常以肽或氨基酸的形式進入大腸，被大腸中棲息的微生物發(fā)酵利用，合成微生物蛋白(microbial crude protein,MCP)，同時生成大量氣體及揮發(fā)性脂肪酸(volatile fatty acid,VFA)等代謝產(chǎn)物。

由于我國的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)飼料資源相對缺乏，國內(nèi)研究人員多關(guān)注飼糧中蛋白質(zhì)水平對生產(chǎn)性能的影響，飼糧蛋白質(zhì)水平不同程度降低后，對不同生長階段豬的生產(chǎn)性能沒有明顯降低，并且對均日增重、平均日采食量、料重比等指標有一定程度改善[2-4]。如前所述，飼糧中不同水平蛋白質(zhì)將影響進入大腸的未消化蛋白質(zhì)或含氮化合物的濃度，并且飼糧變化會迅速影響腸道微生物菌群[5]，使其代謝產(chǎn)物及菌體合成能力發(fā)生改變，而微生物菌群代謝產(chǎn)物又與宿主的生理健康狀況密切相關(guān)，因此使不同水平蛋白質(zhì)對腸道微生物發(fā)酵特性及代謝產(chǎn)物的影響值得關(guān)注，但是目前關(guān)于不同蛋白質(zhì)水平對豬大腸微生物發(fā)酵特性影響相關(guān)研究鮮有報道。本文擬在體外培養(yǎng)的條件下，研究不同蛋白質(zhì)水平對結(jié)腸微生物發(fā)酵能力、主要代謝產(chǎn)物以及合成菌體能力的影響，探討不同水平蛋白質(zhì)對結(jié)腸微生物發(fā)酵特性的影響，了解豬結(jié)腸微生物對蛋白質(zhì)的利用規(guī)律。

1材料與方法

1.1底物、培養(yǎng)基和接種物的制備

底物：酪蛋白水解物(casein enzymatic hydrolysate)(北京索來寶科技有限公司，酶水解酪素C8210)；培養(yǎng)基：參照Longland等[6]方法配制培養(yǎng)基，去掉其中含氮化合物。厭氧分裝至已裝有底物的發(fā)酵瓶中，每瓶95 mL；結(jié)腸微生物接種液：5頭杜×長×大商品豬屠宰采結(jié)腸食糜，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)1∶5(w/v)稀釋，混勻，4層無菌紗布過濾至血清瓶，接種至上述培養(yǎng)基中，每瓶5 mL。發(fā)酵體系為100 mL。

1.2試驗設(shè)計

試驗在結(jié)腸微生物發(fā)酵液中分別添加0(C組)、0.10(L組)、0.25 g/L(H組)酪蛋白水解物，每組20個發(fā)酵瓶(每個發(fā)酵瓶為1個重復(fù))。接種后將發(fā)酵瓶迅速置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵24 h。

1.3測定指標及方法

每組中4個重復(fù)在發(fā)酵3、6、9、12、18、24 h時，參照Theodorou等[7]方法，使用Reading Pressure Technique(RPT)裝置測定產(chǎn)氣量，并在24 h發(fā)酵終點采樣，另外16個重復(fù)在0、3、9、12 h每組每個時間點冰浴終止發(fā)酵4個重復(fù)，采樣測定pH及MCP、氨態(tài)氮(ammonia nitrogen,NH3-N)、VFA濃度。參照馬艷艷等[8]方法，用pH計(德國,Schott)測定pH；取1 mL發(fā)酵液加入1 mL 0.2 mol/L鹽酸保存，用靛酚方法測定氨態(tài)氮濃度[9]；參照Makkar等[10]，用NanoDrop2000c分光光度計(spectrophotometer)(美國,Thermo Fisher)測定MCP濃度。參照Mao等[11]，取1 mL發(fā)酵液加入200 μL偏磷酸巴豆酸混合液保存，用GC-14B氣相色譜儀(gas chromatograph,GC)(日本島津)測定VFA濃度。

1.4統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2013初步處理，用SPSS 20.0單因子方差分析(one-way ANOVA)進行差異顯著性分析，P<0.05為差異顯著。

2結(jié)果與分析

2.1不同蛋白質(zhì)水平對豬結(jié)腸微生物發(fā)酵液中pH影響

由表1可見，發(fā)酵期間，對照組(C組)在發(fā)酵期間pH基本保持不變，蛋白質(zhì)底物添加組(H組和L組)的發(fā)酵液中pH整體呈現(xiàn)先下降后增長的趨勢，在3、6 h顯著低于對照組(P<0.05)，12 h時均上升，其中L組顯著高于C組和H組(P<0.05)，至24 h時，H組和L組pH上升至對照組水平，3組之間無顯著差異(P>0.05)。

表1　體外發(fā)酵中各時間點pH變化Table 1　Changes of pH at each time point during in vitro fermentation

同行數(shù)據(jù)肩標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。表2、表3同。

In the same row, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as Table 2 and Table 3.

2.2不同蛋白質(zhì)水平對結(jié)腸微生物體外發(fā)酵累積產(chǎn)氣量的影響

由圖1可見，在各個時間點，H組、L組累積產(chǎn)氣量均高于C組，C組在12 h以后產(chǎn)氣量不再增加，而H組與L組體外發(fā)酵產(chǎn)氣量趨勢基本一致，在發(fā)酵0～9 h之間產(chǎn)氣量快速增加，之后緩慢增加，H組累積產(chǎn)氣量從發(fā)酵6 h開始明顯高于L組，終止發(fā)酵時H組累積產(chǎn)氣量為(106.38±1.31) mL，高于L組的(104.13±2.51) mL。

圖1　體外發(fā)酵期間累積產(chǎn)氣量Fig.1　Cumulative gas production of in vitro fermentation

2.3不同蛋白質(zhì)水平對豬結(jié)腸微生物發(fā)酵液MCP濃度的影響

由表2可見，在各個時間點，H組、L組發(fā)酵液中MCP濃度顯著高于C組(P<0.05)，其中在6 h時H組MCP濃度又顯著高于L組(P<0.05)?？傮w上，H組和L組在0～12 h 之間緩慢上升，12～24 h基本保持不變。

2.4不同蛋白質(zhì)水平對豬結(jié)腸微生物發(fā)酵液氨態(tài)氮濃度的影響

由表3可見，H組和L組發(fā)酵液中的氨態(tài)氮濃度隨著發(fā)酵的進行持續(xù)增加，并且，發(fā)酵液中氨態(tài)氮濃度隨著酪蛋白添加水平顯著增加，即在發(fā)酵3、6、12、24 h，H組顯著高于L組(P<0.05)，均顯著高于對照組(P<0.05)。

表2　體外發(fā)酵期間MCP濃度變化Table 2　Changes of MCP concentration during in vitro fermentation　μg/mL

表3　體外發(fā)酵期間氨態(tài)氮濃度變化Table 3　Changes of NH3-N concentration during in vitro fermentation　mmol/L

2.5不同蛋白質(zhì)水平對豬結(jié)腸微生物發(fā)酵液VFA濃度的影響

從表4可見，不同蛋白質(zhì)水平對結(jié)腸微生物發(fā)酵液中總揮發(fā)性脂肪酸(total volatile fatty acids，TVFA)、總支鏈脂肪酸(total branched-chain fatty acid,TBCFA)及乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、異丁酸、異戊酸濃度均有一定影響。TVFA：發(fā)酵3 h時各組TVFA濃度沒有顯著差異(P>0.05)，6 h開始3組之間TVFA濃度差異顯著(P<0.05)，H組>L組>C組。乙酸：H組乙酸濃度在發(fā)酵3 h時顯著高于L組和C組(P<0.05)，其他時間點3組之間差異顯著(P<0.05)，H組>L組>C組。丙酸：發(fā)酵3 h時H組和L組丙酸濃度顯著高于C組(P<0.05)，6、12 h時3組之間丙酸濃度差異顯著(P<0.05)，H組>L組>C組；24 h時H組和L組丙酸濃度顯著高于C組(P<0.05)。丁酸：發(fā)酵3 h時H組和L組丁酸濃度顯著高于C組(P<0.05)，6、12、24 h時3組之間丁酸濃度差異顯著(P<0.05)，H組>L組>C組。異丁酸：發(fā)酵3 h時異丁酸濃度在3組之間無顯著差異(P>0.05)，6和24 h時3組之間差異顯著(P<0.05)，H組>L組>C組，12 h時H組和L組異丁酸濃度顯著高于C組(P<0.05)；異戊酸：3組之間異戊酸濃度在發(fā)酵0～24 h中均有差異顯著(P<0.05)，H組>L組>C組。TBCFA：發(fā)酵3 h時H組TBCFA濃度顯著高于C組(P<0.05)，但與L組無顯著差異(P>0.05)，6、12、24 h時3組之間TBCFA濃度差異顯著(P<0.05)，H組>L組>C組。

表4　體外發(fā)酵期間各時間點VFA濃度變化Table 4　Changes of VFA concentration at each time point during in vitro fermentation　mmol/L

同項目下同列數(shù)據(jù)肩標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

In the same column and item, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05).

3討論

3.1不同蛋白質(zhì)水平對豬結(jié)腸微生物發(fā)酵能力的影響

微生物利用未經(jīng)宿主消化吸收的營養(yǎng)物質(zhì)產(chǎn)生代謝產(chǎn)物的同時會產(chǎn)生大量氣體。在發(fā)酵體系中，產(chǎn)氣量是評定微生物發(fā)酵能力的重要指標[12]，氣體產(chǎn)量的高低一方面取決于飼料可發(fā)酵成分的含量，另一方面取決于微生物的降解能力[13]。蛋白質(zhì)作為一種微生物可利用的底物，經(jīng)過前腸消化吸收后的蛋白質(zhì)主要以氨基酸的形式被利用，并且微生物可以快速利用氨基酸[14]，產(chǎn)氣量的不同，一定程度上反映微生物對蛋白質(zhì)利用情況的差異。Jha等[1]認為，降低飼糧中蛋白質(zhì)水平，增加粗纖維，可減少豬腸道氣體排放。本試驗結(jié)果與其觀點相似，隨著蛋白質(zhì)水平的升高，發(fā)酵體系中累積產(chǎn)氣量顯著增加，顯示在本試驗條件下，微生物的發(fā)酵能力隨著蛋白質(zhì)水平的升高而增加。

3.2不同蛋白質(zhì)水平對豬結(jié)腸微生物代謝產(chǎn)物的影響

進入結(jié)腸的蛋白質(zhì)在水解作用下以氨基酸的形式被微生物利用，一方面合成微生物自身增殖所需的蛋白質(zhì)，即MCP，另一方面代謝產(chǎn)生氣體，如氫氣(H2)、甲烷(CH4)、二氧化碳(CO2)、硫化氫(H2S)、VFA[包括短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids，SCFA)和支鏈脂肪酸(branched-chain fatty acids，BCFA)]，以及酚類、吲哚、胺類、硫化物、氨等物質(zhì)[15]，這些代謝產(chǎn)物廣泛參與機體的代謝[16]，共同作用使腸道內(nèi)環(huán)境發(fā)生改變[17]。

MCP濃度反映著微生物利用底物為自身合成蛋白質(zhì)的需要。本試驗結(jié)果顯示，添加外源的蛋白質(zhì)顯著增加MCP濃度，但是，除6 h外，在其他時間點，蛋白質(zhì)水平的增加并不能顯著增加發(fā)酵液中MCP濃度。這可能預(yù)示著，微生物利用氨基酸合成自身所需蛋白質(zhì)的能力有限，腸道中含氮化合物的增加并不能進一步促進微生物菌體的合成。此外，氨態(tài)氮濃度變化反映微生物對蛋白質(zhì)的降解能力的改變。Geypens等[18]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中蛋白質(zhì)的添加可顯著增加糞便中氨態(tài)氮濃度，本試驗結(jié)果與其觀點一致，在本試驗條件下，氨態(tài)氮濃度顯著受蛋白質(zhì)水平影響。

微生物利用宿主未消化吸收的營養(yǎng)物質(zhì)產(chǎn)生VFA，其中微生物利用碳水化合物及蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物(主要有天冬氨酸、丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸、賴氨酸、蘇氨酸)生成SCFA，會為人體提供約10%的熱量，并且其中丁酸與結(jié)腸上皮細胞的生理及代謝過程密切相關(guān)[19]。與SCFA不同，BCFA嚴格由微生物利用異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸生成，所以BCFA可以作為微生物利用蛋白質(zhì)的標記[20]。Le等[21]將飼糧蛋白質(zhì)水平從18%降至12%，顯著降低了豬糞樣中SCFA及BCFA濃度。Cho等[22]研究認為，飼糧蛋白質(zhì)水平升高會顯著增加豬糞樣中SCFA及BCFA濃度。本試驗結(jié)果與上述研究結(jié)果一致，隨著蛋白質(zhì)水平的升高，SCFA(乙酸、丙酸、丁酸、戊酸)和BCFA(異丁酸、異戊酸)的濃度在試驗不同時間點均有不同程度增加。

在本試驗條件下，結(jié)腸微生物發(fā)酵液中MCP濃度在發(fā)酵6 h時基本已達峰值，而氨態(tài)氮和VFA濃度則隨著時間及蛋白質(zhì)水平增加而增加，這可能預(yù)示，結(jié)腸微生物可以快速利用蛋白質(zhì)供自身需要并且其對蛋白質(zhì)利用的能力有限，本試驗添加0.10 g/L蛋白質(zhì)時MCP濃度基本已經(jīng)達到峰值，隨著發(fā)酵的進行，更多的蛋白質(zhì)會被微生物代謝產(chǎn)生氨態(tài)氮及VFA等代謝產(chǎn)物，并不會進一步促進MCP合成。

3.3不同蛋白質(zhì)水平對豬結(jié)腸微生物發(fā)酵液體系的影響

微生物對蛋白質(zhì)的發(fā)酵可改變腸腔中氨態(tài)氮、VFA及其他代謝產(chǎn)物的形成，最終改變腸腔內(nèi)環(huán)境。Pieper等[23]認為，在飼糧中增加蛋白質(zhì)水平，不改變糞樣pH。Russel等[24]也認為飼糧中蛋白質(zhì)水平不影響糞樣pH。在本研究中，發(fā)酵體系中pH先下降后(3、6 h)又恢復(fù)至對照組水平，這提示，蛋白質(zhì)的添加顯著影響微生物發(fā)酵，進而降低pH，影響腸道內(nèi)環(huán)境，但是隨著時間延長，發(fā)酵體系趨于穩(wěn)態(tài)，繼而穩(wěn)定環(huán)境，使pH恢復(fù)至正常水平。

4結(jié)論

① 蛋白質(zhì)的添加增加了結(jié)腸微生物的累積產(chǎn)氣量。

② 在體外發(fā)酵體系中，蛋白質(zhì)的添加提高了MCP合成能力，并且在蛋白質(zhì)水平為0.10 g/L時菌體合成能力達到峰值，但過量蛋白質(zhì)不能進一步提高MCP合成能力。

③ 在體外發(fā)酵體系中，蛋白質(zhì)的添加顯著影響氨態(tài)氮濃度和VFA濃度，并且其濃度隨著蛋白質(zhì)水平和發(fā)酵時間增加而增加。

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(責(zé)任編輯武海龍)

doi：10.3969/j.issn.1006-267x.2016.07.004

收稿日期：2016-01-21

基金項目：國家自然科學(xué)基金(31430082)；國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(973)(2013CB127300)；江蘇省自然科學(xué)基金(BK20130058)

作者簡介：葛婷(1989—)，女，陜西楊凌人，碩士研究生，從事消化道微生物相關(guān)研究。E-mail: 380498908@qq.com *通信作者：朱偉云，教授，博士生導(dǎo)師，E-mail: zhuweiyun@njau.edu.cn

中圖分類號：S816.17

文獻標識碼：A

文章編號：1006-267X(2016)07-1998-07

*Corresponding author, professor, E-mail: zhuweiyun@njau.edu.cn

Effects of Different Levels of Protein Substrates on Fermentation Characteristics and Microbial Protein Synthesis Ability of Porcine Colonic Microbiota

GE TingSUN WeiweiZHU Weiyun*

(Jiangsu Key Laboratory of Gastrointestinal Nutrition and Animal Health; Laboratory of Gastrointestinal Microbiology,College of Animal Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

Abstract:This study was conducted to evaluate the characteristics of porcine colonic microbial fermentation under different protein substrates levels by in vitro fermentation, aiming to determine the fermentation pattern of protein by porcine colon microbiota. Porcine colon digesta was used as microbial inoculum, 0 (group C), 0.10 (group L) and 0.25 g/L (group H) casein was added into microbial fermentation broth. At different time points (3, 6, 9, 12, 18 and 24 h), cumulative gas production, pH and concentrations of microbial crude protein, ammonia nitrogen and volatile fatty acid were determined. The results showed as follows: 1) at 3 and 5 h fermentation, the pH of group L and group H was significantly lower than that of group C (P<0.05). 2) The cumulative gas production of group L and group H was higher than that of group C. 3) The concentration of microbial crude protein of group L and group H was significantly higher than that of group C at different time points (P<0.05), and group H was significantly higher than group L at 6 h (P<0.05). 4) The concentration of ammonia nitrogen of group L and group H was significantly higher than that of group C at different time points (P<0.05). 4) The concentrations of short-chain fatty acids and branched-chain fatty acids increased with the fermentation time, and increased with the protein level. The results suggest that adding protein substrates promotes intestinal microbial synthesis, but excessive protein cannot further increase microbial crude protein concentration, the microbial fermentation increases with protein level increasing.[Chinese Journal of Animal Nutrition, 2016, 28(7)：1998-2004]

Key words:protein level; porcine; colonic microbial; fermentation characteristics; microbial synthesis ability