pH區(qū)帶逆流色譜法分離純化丹參中的丹酚酸B和迷迭香酸

李懷志，宮成玉，李云，楊鵬，李佳，王曉

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟(jì)南250355； 2. 煙臺出入境檢驗檢疫局，山東 煙臺 264000； 3. 濟(jì)南三峰生物工程有限責(zé)任公司，山東 濟(jì)南 250014； 4. 山東省中藥質(zhì)量控制技術(shù)重點(diǎn)實驗室，山東省分析測試中心，山東 濟(jì)南 250014)

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pH區(qū)帶逆流色譜法分離純化丹參中的丹酚酸B和迷迭香酸

李懷志1, 4，宮成玉2，李云1, 4，楊鵬3，李佳1，王曉4*

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟(jì)南250355； 2. 煙臺出入境檢驗檢疫局，山東 煙臺 264000； 3. 濟(jì)南三峰生物工程有限責(zé)任公司，山東 濟(jì)南 250014； 4. 山東省中藥質(zhì)量控制技術(shù)重點(diǎn)實驗室，山東省分析測試中心，山東 濟(jì)南 250014)

摘要：采用pH區(qū)帶精制逆流色譜技術(shù)(pH-ZRCCC)快速分離純化丹參中的丹酚酸B和迷迭香酸。以乙酸乙酯-水(1∶1, V/V)為溶劑體系，上相加入三氟乙酸，使?jié)舛冗_(dá)到10 mmol/L，作為固定相；下相加入氨水使?jié)舛冗_(dá)到20 mmol/L，作為流動相；設(shè)置主機(jī)轉(zhuǎn)速為850 r/min，流速為2.0 mL/min，檢測波長為280 nm，對樣品進(jìn)行分離制備。從500 mg丹參粗提物中一次分離得到386 mg丹酚酸B以及25 mg迷迭香酸，經(jīng)HPLC分析純度分別為96.3%和98.1%，各化合物通過電噴霧電離(ESI)譜和1H-NMR進(jìn)行了化學(xué)結(jié)構(gòu)鑒定。研究結(jié)果表明，pH-ZRCCC是一種快速、高效分離純化丹酚酸B和迷迭香酸的方法。

關(guān)鍵詞：pH區(qū)帶逆流色譜；丹酚酸B；迷迭香酸

丹參藥材來源于唇形科植物丹參(SalviamiltiorrhizaBge.)的干燥根和根莖，是臨床常用中藥，具有活血祛瘀、通經(jīng)止痛、清心除煩以及涼血消癰等功效[1]。丹酚酸B是丹參水溶性物質(zhì)中的主要成分，在丹參酚酸類成分中含量最高。現(xiàn)代藥理研究證實，丹酚酸B具有抗氧化、清除自由基、抑制血小板聚集、抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡、預(yù)防心腦血管疾病、抗動脈粥樣硬化以及抗肝損傷等活性[2-4]。迷迭香酸是丹參水溶性成分之一，是天然的抗氧化劑，有免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗菌和抗病毒等多種活性[5-6]。

傳統(tǒng)柱色譜對丹酚酸B和迷迭香酸的分離純化存在耗時長、易導(dǎo)致樣品的變性和回收率低等缺點(diǎn)，無法滿足高效快速制備純品的需求。pH區(qū)帶精制逆流色譜技術(shù)(pH-zone-refining counter-current chromatography, pH-ZRCCC)作為一種新型制備分離技術(shù)，基于高速逆流色譜發(fā)展起來。其利用待分離有機(jī)酸(堿)的酸(堿)解離常數(shù)及疏水性的不同進(jìn)行分離，通過添加保留酸(或堿)到溶劑體系的固定相中，同時洗脫堿(或酸)被加入到流動相中，使得不同的物質(zhì)被逐個洗脫出來，其洗脫過程中伴隨著pH值的改變，色譜圖形成按pH值的大小排列邊界陡峭的矩形平臺峰，平臺區(qū)內(nèi)的產(chǎn)物高度濃縮，而平臺峰的兩側(cè)是被濃縮的雜質(zhì)。相比傳統(tǒng)的逆流色譜分離，在保留其分離純度和分離效率高等優(yōu)點(diǎn)的基礎(chǔ)上，具有更大的樣品分離量，現(xiàn)已被廣泛用于天然產(chǎn)物有效成分的分離[7-11]。

目前，pH-ZRCCC已經(jīng)用于丹酚酸B的分離制備[12]，具有分離速度快和進(jìn)樣量大等優(yōu)點(diǎn)，但是所得的丹酚酸B和迷迭香酸的純度不夠高。本實驗根據(jù)丹酚酸B的極性較大的特點(diǎn)，選用乙酸乙酯-水體系，為丹酚酸B和迷迭香酸(結(jié)構(gòu)見圖1)的分離制備提供一種更簡便高效、分離純度更高的方法。

圖1　丹酚酸B和迷迭香酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1　Chemical structures of salvianolic acid B and rosmarinic acid

1實驗部分

1.1儀器、試劑與材料

TBE300A高速逆流色譜儀(上海同田生化技術(shù)有限公司)，包括TBP5002泵、8823B紫外檢測儀、3057-11便攜式記錄儀；Waters 600-996高效液相色譜系統(tǒng)(二極管陣列PDA檢測器，美國Waters公司)；高速中藥粉碎機(jī)(瑞安市百信藥機(jī)器械廠)；Varian INOVA-400 Hz型核磁共振波譜儀 (美國Varian公司)；GF254硅膠板(青島海洋化工廠)。

高效液相色譜所用乙腈為色譜純(美國天地公司)，水為過濾蒸餾水；大孔樹脂(D101)和pH-ZRCCC分離用溶劑均為分析純(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，所用水為去離子水。

干燥的丹參根購自于萊蕪紫光生態(tài)園有限公司，由山東中醫(yī)藥大學(xué)李佳教授鑒定，確定是唇形科植物丹參SalviamiltiorrhizaBge.。

1.2樣品制備

取干燥的丹參150 g，粉碎，加300 mL二氯甲烷浸泡過夜，過濾，得丹參殘渣，晾干。以65%乙醇回流提取兩次，每次1.5 h，過濾。合并兩次濾液，減壓濃縮，濃縮液以2 mol/L鹽酸調(diào)pH值至2.08，冷藏沉降過夜。取上清液過大孔樹脂柱(m=165 g,V=232 mL)，出液淺色渾濁，以水洗滌至洗出液變清，再以50%的乙醇洗脫，以三氯化鐵溶液監(jiān)測，并接收丹酚酸B組分，減壓蒸干，得6.4 g丹參提取物，冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3兩相溶劑體系和樣品溶液的制備

pH-ZRCCC的溶劑系統(tǒng)為乙酸乙酯-水(1∶1,V/V)按比例置于分液漏斗中，震蕩后充分靜置使其分層。取上相加10 mmol/L的三氟乙酸，下相加20 mmol/L的氨水，超聲脫氣15 min備用。

取500 mg的丹參粗提物，用6 mL加了三氟乙酸的上相和6 mL未加氨水的下相溶解，作為樣品溶液。

1.4pH區(qū)帶逆流色譜分離過程

首先以20 mL/min的速度將已經(jīng)脫氣的固定相泵入HSCCC分離管，待整個分離管被固定相充滿后，開啟主機(jī)，緩慢調(diào)節(jié)速度控制器至850 r/min (正轉(zhuǎn))，此時，由進(jìn)樣閥注入樣品溶液，同時以2.0 mL/min的速度泵入流動相，并打開檢測器和記錄儀開始采集數(shù)據(jù)，于280 nm下檢測流出物，根據(jù)色譜圖，每10 mL為一管收集流出物，同時用pH計檢測每管的pH值。

1.5HPLC分析

用高效液相色譜法分析丹參粗提物和pH-ZRCCC分離所得的各化合物。色譜柱為Waters Symmetry RP18柱(250 mm×4.6 mm I.D., 5 μm)；檢測波長280 nm；流動相為乙腈-水(0.026%磷酸) (30∶70,V/V)等度洗脫；流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣體積20 μL。

2結(jié)果與討論

2.1HPLC條件優(yōu)化

最優(yōu)高效液相色譜條件旨在最短的分析時間內(nèi)相鄰的兩個峰有很好的分離度，考察以甲醇-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.1%乙酸水溶液、乙腈-0.02%乙酸水溶液和乙腈-0.03%磷酸水溶液作為HPLC流動相時丹參粗提物中各組分的分離效果。結(jié)果表明，當(dāng)采用乙腈-0.03%磷酸水溶液體系等度洗脫(30∶70,V/V)，流速設(shè)定為1.0 mL/min時，各成分能夠?qū)崿F(xiàn)基線分離，并檢測到粗提物中丹酚酸B的純度(峰面積比)為82%，分析結(jié)果見圖2a。利用優(yōu)化好的液相條件對分離的各組分進(jìn)行檢測，純度分別為96.3%和98.1%，分析結(jié)果見圖2b和圖2c。

圖2　丹參粗提物和pH-區(qū)帶逆流色譜分離組分的HPLC分析圖Fig.2　HPLC chromatogram of crude extract from Salvia miltiorrhiza Bge. and separated fractions by pH-ZRCCC

2.2pH區(qū)帶逆流色譜分離條件優(yōu)化

在pH區(qū)帶逆流色譜中，選擇合適的兩相溶劑系統(tǒng)是成功分離純化天然植物中活性成分的關(guān)鍵。本實驗根據(jù)酚酸類化合物的極性，選擇了乙酸乙酯-水(1∶1,V/V)溶劑系統(tǒng)，并考察了該溶劑系統(tǒng)在不同堿度流動相時，各化合物的分離情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在上相添加10 mmol/L三氟乙酸，下相添加10 mmol/L氨水的溶劑系統(tǒng)時，雖然實現(xiàn)了丹酚酸B和迷迭香酸的分離，但是所需要的洗脫時間太長 (見圖3a)。為了縮短分離時間，加快洗脫速度，我們嘗試將流動相的氨水濃度調(diào)高到15 mmol/L，測試后發(fā)現(xiàn)洗脫時間有一定程度的縮短，我們繼續(xù)增加氨水的濃度到20 mmol/L時，時間被大幅度縮短，并且不影響分離組分的純度。取丹參粗提物500 mg，采用乙酸乙酯-水(1∶1,V/V)，上相添加10 mmol/L三氟乙酸，下相添加20 mmol/L氨水溶劑系統(tǒng)進(jìn)行分離，丹酚酸B和迷迭香酸以不規(guī)則的矩形峰形式被洗脫出來，在102～235 min得到化合物1丹酚酸B 389 mg， 252～268 min得到化合物2迷迭香酸25 mg，雜質(zhì)和次要成分集中在矩形峰的兩側(cè)，固定相保留率為43%，分離效果見圖3b。

圖3　丹參粗提物的pH-ZRCCC色譜圖Fig.3　pH-ZRCCC chromatogram of crude extract from Salvia miltiorrhiza Bge.

2.3分離化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1，類白色粉末，ESI-MS,m/z719 [M+H]+;1H-NMR (CD3OD, 400 MHz) δ: 6.88 (1H, d,J=8.7 Hz, C5-H), 7.20 (1H, d,J= 8.4 Hz, C6-H), 7.42 (1H, d,J= 16.2 Hz, C7-H), 6.21 (1H, d,J= 16.3 Hz, C8-H), 6.55～6.61 (1H, m, C6′-H), 6.77 (1H, d,J= 3.6 Hz, C5′-H), 6.79 (1H, d,J= 1.9 Hz, C2′-H), 5.93 (1H, d,J= 4.6 Hz, C7′-H), 6.74 (1H, d,J= 2.6 Hz, C2″-H), 6.70 (1H, d,J= 8.7 Hz, C5″-H), 4.29 (1H, d,J= 4.7 Hz, C8″-H), 2.80 (1H, dd,J= 9.6, 14.3 Hz, C7″a-H),3.01(2H, dd,J= 4.5, 14.3 Hz, C7″b-H, C7?a-H), 3.09 (1H, dd,J= 4.1, 14.3 Hz, C7?b-H), 5.23 (2H, dd,J= 5.8, 12.9 Hz, C8″-H, C8?-H), 6.26～6.33 (1H, m, C6?-H), 6.56 (1H, d,J= 8.0 Hz, C5?-H), 6.54 (1H, d,J= 1.9 Hz, C2?-H), 6.66 (1H, dd,J= 2.1, 8.2 Hz, C6″-H)。以上數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)[13]報道一致，并且樣品色譜保留時間與丹酚酸B對照品一致，由此確定化合物1是丹酚酸B。

化合物2，白色粉末，ESI-MS,m/z361 [M+H]+;1H-NMR (CD3OD, 400 MHz) δ: 6.30 (1H, d,J= 15.6 Hz, C8-H), 6.89 (1H, dd,J= 1.8, 8.7 Hz, C5-H), 7.09 (1H, d,J= 1.8 Hz, C2-H), 7.66 (1H, d,J=15.6 Hz, C7-H), 2.93～3.09 (2H, m, C7′-H), 5.12 (1H, s, C8′-H), 6.60 (1H, d,J= 8.1 Hz, C6′-H), 6.69 (1H, d,J=7.9 Hz, C5′-H), 6.77～6.89 (2H, m, C6-H, C2′-H)。以上數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)報道一致，并且樣品色譜保留時間與迷迭香酸對照品一致，由此確定化合物2是迷迭香酸。

3結(jié)論

pH-ZRCCC在普通逆流色譜儀器的基礎(chǔ)上，以化合物不同的解離常數(shù)(Ka)和疏水性來實現(xiàn)制備分離，并且在分離制備有機(jī)酸和生物堿等化合物方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢。本文報道應(yīng)用pH-ZRCCC從丹參中分離丹酚酸B和迷迭香酸，通過增加流動相洗脫堿的濃度來加快洗脫速度，從而實現(xiàn)了pH區(qū)帶逆流色譜對丹酚酸B和迷迭香酸的快速分離，該法簡單易行，省時省力，并且純化效果明顯，具有較好的實際應(yīng)用價值。

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DOI:10.3976/j.issn.1002-4026.2016.03.003

收稿日期：2016-02-22

基金項目：山東省科技發(fā)展計劃(2014GZX219003)

作者簡介：李懷志(1991-)，女，碩士研究生，研究方向為天然產(chǎn)物與純化。 *通信作者，王曉(1971-)，男，研究員。Email: wangx@sdas.org

中圖分類號：R284.2

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1002-4026(2016)03-0013-05

Separation and purification of salvianolic acid B and rosmarinic acid fromSalviamiltiorrhizaBge. by pH-zone-refining counter-current chromatography

LI Huai-zhi1, 4，GONG Cheng-yu2, LI Yun1, 4, YANG Peng3, LI Jia1，WANG Xiao4*

( 1. School of Pharmacy, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China; 2. Yantai Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau, Yantai 264000, China; 3. Sanfeng Biological Engineering Technology Co. Ltd.,Jinan 250014, China; 4. Shandong Provincial Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Quality Control Technology, Shandong Analysis and Test Center, Jinan 250014, China)

Abstract∶We rapidly separated and purified salvianolic acid B and rosmarinic acid from Salvia miltiorrhiza Bge.by pH-zone-refining counter-current chromatography (pH-ZRCCC). The extraction conditions included solvent system of ethyl acetate-water (1∶1, V/V), upper stationary phase of 10 mmol/L trifluoroacetic acid, lower mobile phase of 20 mmol/L NH3H2O, rotation speed of 850 r/min, flow speed of 2.0 mL/min, and detection wavelength of 280 nm. Salvianolic acid B of 386 mg and rosmarinic acid of 25 mg were extracted from crude extract of 500 mg, whose purities were 96.3% and 98.1% through HPLC analysis. Their compound structures were identified by ESI-MS and1H-NMR. Experimental results show that pH-ZRCCC is a rapid and efficient method to separate and purify salvianolic acid B and rosmarinic acid.

Key words∶ pH-zone-refining counter-current chromatography; salvianolic acid B; rosmarinic acid

【中藥與天然活性產(chǎn)物】