木瓜內(nèi)生真菌乙酸乙酯萃取部位胃粘膜保護(hù)作用實(shí)驗(yàn)研究

鄢榮榜　盧巧巧　賀海波　王心怡　張永峰　覃慧林　汪鋆植

(1. 三峽大學(xué) 生物與制藥學(xué)院, 湖北 宜昌　443002; 2. 湖北航天杜勒制藥有限公司, 湖北 宜昌　443100; 3. 三峽大學(xué) 醫(yī)學(xué)院, 湖北 宜昌　443002)

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木瓜內(nèi)生真菌乙酸乙酯萃取部位胃粘膜保護(hù)作用實(shí)驗(yàn)研究

鄢榮榜1，2盧巧巧3賀海波1王心怡3張永峰1覃慧林1汪鋆植1

(1. 三峽大學(xué) 生物與制藥學(xué)院, 湖北 宜昌443002; 2. 湖北航天杜勒制藥有限公司, 湖北 宜昌443100; 3. 三峽大學(xué) 醫(yī)學(xué)院, 湖北 宜昌443002)

摘要：研究了木瓜內(nèi)生真菌乙酸乙酯萃取部位胃粘膜保護(hù)作用及可能的機(jī)制．將昆明小鼠完全隨機(jī)分為空白組、模型組、木瓜內(nèi)生真菌乙酸乙酯萃取部位(50、100 mg/kg)及奧美拉唑(20 mg/kg)組，給藥組小鼠分別灌胃給予相應(yīng)藥物，每天1次，連續(xù)5 d，末次給藥1 h后，除空白組外，各組小鼠分別安10 ml/kg灌胃給予阿司匹林的乙醇溶液(15 mg阿司匹林溶解于10 ml 80%乙醇中)，4 h后取胃，延胃大彎剖開，除去胃內(nèi)容物，觀察胃粘膜外觀形態(tài)，并計(jì)算胃潰瘍發(fā)生率、胃潰瘍指數(shù)及胃潰瘍抑制率；刮取胃粘膜，勻漿后，取上清，用試劑盒檢測(cè)胃粘膜中H+/K+-ATPase、COX-2和PGE2活性；取胃粘膜組織，經(jīng)HE染色后進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)觀察．木瓜內(nèi)生真菌乙酸乙酯萃取部位能明顯降低胃粘膜中H+/K+-ATPase、COX-2活性，升高PGE2活性，改善胃粘膜組織形態(tài)，促進(jìn)潰瘍愈合(P<0.05或P<0.01)．結(jié)果表明木瓜內(nèi)生真菌乙酸乙酯萃取部位對(duì)胃粘膜損傷有較好的保護(hù)作用，其作用機(jī)制與其抑制胃粘膜COX-2、H+/K+-ATPase活性和增強(qiáng)PGE2活性有關(guān)，然而是木瓜內(nèi)生真菌乙酸乙酯萃取部位中的何種有效部位/成分起作用及確切的作用機(jī)制目前正在進(jìn)一步研究中．

關(guān)鍵詞：木瓜內(nèi)生真菌；胃粘膜保護(hù)作用；H+/K+-ATPase；COX-2；PGE2

木瓜Chaenomelesspeciosa(sweet)Nakaion為我國(guó)傳統(tǒng)的中藥，同時(shí)也是民間應(yīng)用廣泛的食材．具有平肝舒筋、和胃化濕之功效，主要用于風(fēng)濕痹痛、消化不良和胃腸炎等治療[1]．我們前期研究發(fā)現(xiàn)其乙酸乙酯部位和木瓜三萜均具有較好的胃粘膜保護(hù)作用[2-4]．本研究擬在此基礎(chǔ)上，從其內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物來(lái)研究其對(duì)胃粘膜的保護(hù)作用．

1材料與儀器

1.1木瓜內(nèi)生真菌

木瓜內(nèi)生真菌分離自資丘木瓜的果皮部分，木瓜樣品采集于湖北省長(zhǎng)陽(yáng)縣榔坪鎮(zhèn)．

1.2培養(yǎng)基

馬鈴薯固體培養(yǎng)基(PDA)：200 g去皮馬鈴薯?yè)v碎后，煎煮30 min，過(guò)濾，取濾液分別加入20 g葡萄糖，20 g瓊脂，用蒸餾水定容至1 000 mL，然后在1.25×105Pa壓力下，滅菌20 min，即得．

1.3動(dòng)物

75只體重為18～22 g的雄性SPF級(jí)昆明小鼠(購(gòu)自三峽大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，動(dòng)物生產(chǎn)許可證：SCXK(鄂)2011-0012．每籠5只，分開飼養(yǎng)，小鼠在動(dòng)物中心屏障系統(tǒng)適應(yīng)環(huán)境3天后開始進(jìn)行實(shí)驗(yàn)．

1.4試劑

阿司匹林腸溶片(中國(guó)北京拜耳醫(yī)藥保健有限公司)；無(wú)水乙醇(國(guó)藥集團(tuán)藥業(yè)股份有限公司)，H+/K+-ATPase試劑盒(南京建成生物制品研究所)，COX-2 ELISA試劑盒(上海嵐派生物科技有限公司)，PGE2 ELISA試劑盒(深圳達(dá)科為生物技術(shù)有限公司)，其它試劑均為市售分析純．

1.5儀器

電子分析天平(上海天平儀器廠)，Vortex-Genie 2型渦旋振蕩器(美國(guó)奧然科技有限公司)，酶標(biāo)儀(瑞士Tecan公司)，脫水機(jī)(德國(guó)Leica公司)，切片機(jī)(奧地利Leica公司)，圖像采集系統(tǒng)(德國(guó)Leica公司)，倒置顯微鏡(日本Olympus公司)．

2方法

2.1木瓜內(nèi)生真菌乙酸乙酯萃取部位的制備

將采集的資丘木瓜依次用5%NaClO溶液和75%酒精表面消毒5 min后，取木瓜果皮接種于PDA培養(yǎng)基中，置于28℃恒溫箱中培養(yǎng)．待菌絲長(zhǎng)出后，挑取尖端菌絲移至新的PDA培養(yǎng)基上，經(jīng)幾次純化后得到內(nèi)生真菌并轉(zhuǎn)接到試管斜面，進(jìn)行活化，然后選取活化的菌株，接種到含PDA的固體平板上，當(dāng)菌落生長(zhǎng)到Φ大約6 cm，接種至裝量為200 mL/500 mL的液體PDA培養(yǎng)基三角瓶中，置旋轉(zhuǎn)式搖床于28℃，120 rpm條件下，培養(yǎng)2～3 d，即得種子液，然后將PDA液體培養(yǎng)基分裝于500 mL三角瓶中，裝液量為200 mL，發(fā)酵200瓶，于121℃、1.25×105Pa下滅菌30 min，然后將種子液按5%的接種量接入已滅菌好的PDA液體培養(yǎng)基中，在溫度為28℃，轉(zhuǎn)速為120轉(zhuǎn)/分的搖床中培養(yǎng)20 d，發(fā)酵液用紗布過(guò)濾后，分為上清液和菌絲體．將菌絲體干燥、粉碎后，用95%乙醇回流提取3次，每次2 h，將提取液和發(fā)酵后的上清液合并，減壓濃縮得總浸膏，然后將其依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，取乙酸乙酯萃取液濃縮成浸膏，得到木瓜內(nèi)生真菌乙酸乙酯萃取部位．使用前用0.5%羧甲基纖維鈉溶液(0.5%CMC-Na)配成相應(yīng)濃度的混懸液，備用．

2.2實(shí)驗(yàn)分組及胃潰瘍模型的建立

將實(shí)驗(yàn)小鼠按每組15只完全隨機(jī)分為空白組、胃潰瘍模型組、木瓜內(nèi)生真菌乙酸乙酯萃取部位(50、100 mg/kg)和奧美拉唑(20 mg/kg)組，給藥組灌胃給予相應(yīng)的藥物，空白組和胃潰瘍模型組則給予0.5%CMC-Na溶液，每天1次，連續(xù)5 d，末次給藥1 h后，除空白組外，各組小鼠分別安10 mL/kg灌胃給予阿司匹林的乙醇溶液(15 mg阿司匹林溶解于10 mL 80%乙醇中)，4 h后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)．

2.3檢測(cè)指標(biāo)

2.3.1潰瘍指數(shù)的測(cè)定

小鼠均頸椎脫臼處死，取胃，肉眼觀察胃黏膜外觀形態(tài)．按照我們已發(fā)表文章的方法[2]進(jìn)行潰瘍發(fā)生率、潰瘍指數(shù)和潰瘍抑制率的分析．

2.3.2胃粘膜組織中H+/K+-ATPase、COX-2和PGE2活性測(cè)定

完成胃粘膜損傷分析后，用載玻片刮取胃粘膜，稱量后，按1∶49加入0.9%氯化鈉溶液制成勻漿液，離心后，取上清液，按照試劑盒介紹的檢測(cè)方法測(cè)定H+/K+-ATPase、COX-2和PGE2活性．

2.3.3胃粘膜組織形態(tài)學(xué)觀察

取胃竇部分用多聚甲醛(4%)進(jìn)行固定后，用梯度乙醇脫水后，石蠟包埋，按片后4 μm進(jìn)行連續(xù)切片，然后進(jìn)行HE，在顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析．

2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3結(jié)果

3.1木瓜內(nèi)生真菌乙酸乙酯萃取部位對(duì)小鼠胃潰瘍的影響

由圖1可見，空白對(duì)照組小鼠胃粘膜呈現(xiàn)淡紅色，粘膜皺襞光滑，未見出血點(diǎn)；模型組可見彌散性出血點(diǎn)，腺胃部粘膜出現(xiàn)充血、水腫及糜爛點(diǎn)；木瓜內(nèi)生真菌乙酸乙酯萃取部位組均可抑制潰瘍形成．經(jīng)胃潰瘍指數(shù)分析，木瓜內(nèi)生真菌乙酸乙酯萃取部位(50、100 mg/kg)均可顯著減少胃潰瘍指數(shù)，而且隨著劑量的增加，其作用效果更為顯著；通過(guò)計(jì)算分析，木瓜內(nèi)生真菌乙酸乙酯萃取部位(50、100 mg/kg)對(duì)胃潰瘍抑制率分別為32.5%、50.3%、62.4%(見表1)．實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明木瓜內(nèi)生真菌乙酸乙酯萃取部位對(duì)乙醇和阿司匹林致小鼠胃潰瘍損傷具有較好的保護(hù)作用．

表1　木瓜內(nèi)生真菌乙酸乙酯萃取部位對(duì)小鼠胃潰瘍的影響±s)

與正常組比較#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較*P<0.05，**P<0.01．

3.2木瓜內(nèi)生真菌乙酸乙酯萃取部位對(duì)胃粘膜組織中H+/K+-ATPase、COX-2和PGE2活性的影響

由表2可見，模型組胃粘膜組織中H+/K+-ATPase和COX-2活性顯著升高，PGE2活性明顯降低，與正常組比較具有顯著性差異(P<0.01)；用木瓜內(nèi)生真菌乙酸乙酯萃取部位和奧美拉唑治療后，上述異常變化均得到了顯著改善(P<0.05，P<0.01)．

表2　木瓜內(nèi)生真菌乙酸乙酯萃取部位對(duì)胃粘膜組織中H+/K+-ATPase、COX-2和PGE2活性的影響

與正常組比較#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較*P<0.05，**P<0.01．

3.3木瓜內(nèi)生真菌乙酸乙酯萃取部位對(duì)胃粘膜組織形態(tài)學(xué)的影響

由圖2可見，胃粘膜組織經(jīng)HE染色后，光鏡下觀察可見，正常組胃粘膜層次清楚，上皮完整，腺體排列整齊，無(wú)充血、糜爛現(xiàn)象．模型組胃粘膜可見充血擴(kuò)張及糜爛性出血，上皮細(xì)胞脫落，腺體排列紊亂，并可見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)．而木瓜內(nèi)生真菌乙酸乙酯萃取部位和奧美拉唑組胃粘膜未見明顯損傷，少見充血擴(kuò)張及炎性浸潤(rùn)．

A.正常組；B.模型組；C.木瓜內(nèi)生真菌乙酸乙酯萃取部位50mg/kg組；D.木瓜內(nèi)生真菌乙酸乙酯萃取部位100mg/kg組；E.奧美拉唑組圖2　木瓜內(nèi)生真菌乙酸乙酯萃取部位對(duì)小鼠胃粘膜組織形態(tài)學(xué)的影響

4討論

近20年來(lái)，隨著許多非感染性疾病，如心腦血管疾病、機(jī)體衰老等人口的老齡化疾病被相繼證實(shí)與機(jī)體的炎癥反應(yīng)密切相關(guān)．近年來(lái)，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)阿司匹林等非甾體抗炎藥(NSAIDs)可有效降低胃癌、結(jié)腸癌等消化道腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)和預(yù)防心腦血管疾病，使得NSAIDs成為了世界上應(yīng)用最多的藥品之一，在中國(guó)其用量?jī)H次于抗感染藥物[5]．然而隨著其臨床應(yīng)用范圍的擴(kuò)大，NSAIDs相關(guān)性胃粘膜損傷的病例也越來(lái)越多．盡管臨床有鋁/鉍制劑、H2受體拮抗劑、胃泌素受體及質(zhì)子泵抑制劑可供選用，但往往由于存在療效不持久、停藥后容易復(fù)發(fā)、副反應(yīng)等缺點(diǎn)，使其臨床應(yīng)用受到了極大限制[6-8]．因此，尋找有效防治胃粘膜損傷的措施越來(lái)越引起人們的關(guān)注．木瓜是常用藥食同源藥材，在民間應(yīng)用極為廣泛．《本草綱目》記載該藥具有舒筋活絡(luò)、和胃化濕之功，可用于腰酸腿痛、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病的治療．我們前期計(jì)算分析和實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，其三萜類成分及其中的齊墩果酸在抗炎的同時(shí)，顯示出了較好的胃粘膜保護(hù)作用[2-4]．根據(jù)以上觀點(diǎn)，我們進(jìn)行了木瓜中內(nèi)生真菌乙酸乙酯萃取部位對(duì)胃粘膜損傷的保護(hù)作用研究．實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，木瓜內(nèi)生真菌乙酸乙酯萃取部位可顯著降低胃粘膜組織中H+/K+-ATPase、COX-2活性，升高PGE2活性，降低胃潰瘍發(fā)生率、胃潰瘍指數(shù)，升高潰瘍抑制率，改善胃粘膜組織形態(tài)學(xué)，表現(xiàn)出對(duì)小鼠胃黏膜損傷良好的保護(hù)作用．

現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)胃粘膜有著完善的防御體系，它由粘液-碳酸氫鹽-磷脂屏障、上皮細(xì)胞屏障和胃粘膜的微循環(huán)三級(jí)胃粘膜保護(hù)屏障組成．在該體系中，攻擊因子(H+、胃蛋白酶、H+/K+-ATPase、IL-6、IL-1β、TNF-α、COX-2)和防御因子(COX-1、TGF-β、PG、PGE2)維持著動(dòng)態(tài)平衡，當(dāng)攻擊因子強(qiáng)于防御因子是，胃粘膜表現(xiàn)為胃粘膜損傷[9-10]．防治胃粘膜損傷的根本目的是恢復(fù)攻擊因子和防御因子間的動(dòng)態(tài)平衡，恢復(fù)胃粘膜防御屏障正常功能．在實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)，胃潰瘍模型小鼠用木瓜內(nèi)生真菌乙酸乙酯萃取部位治療后，胃粘膜組織中H+/K+- ATPase、COX-2活性明顯降低，PGE2活性顯著降低，且具有明顯劑量依賴性，該結(jié)果也與其改善胃粘膜組織形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致．

綜上所述，木瓜內(nèi)生真菌乙酸乙酯萃取部位能降低胃粘膜組織中H+/K+- ATPase、COX-2活性，升高PGE2活性，降低胃潰瘍發(fā)生率、胃潰瘍指數(shù)，提高胃潰瘍抑制率及改善胃粘膜組織形態(tài)．其保護(hù)作用可能與抑制胃粘膜損傷攻擊因子H+/K+-ATPase、COX-2的活性及增強(qiáng)防御因子PGE2活性有關(guān)，然而是木瓜內(nèi)生真菌乙酸乙酯萃取部位中的何種有效部位/成分起作用及確切的作用機(jī)制目前正在進(jìn)一步研究中．

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[責(zé)任編輯周文凱]

收稿日期：2016-01-04

基金項(xiàng)目：湖北省民間藥物工程研究中心(2015ZY007)；三峽大學(xué)生物與制藥學(xué)院預(yù)研基金(No. Hy1402)

通信作者：賀海波(1972-)，男，副教授，博士，主要從事土家族藥物的活性評(píng)價(jià)及開發(fā)研究．E-mail：hehaibo252219@163.com.

DOI：10.13393/j.cnki.issn.1672-948X.2016.02.021

中圖分類號(hào)：R282.71

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1672-948X(2016)02-0092-05

Experimental Study of Protective Effect of Gastric Mucosa of Ethyl Acetate Part of Endophytic Fungi fromChaenomelesSpeciosa(sweet) Nakaion

Yan Rongbang1,2Lu Qiaoqiao3He Haibo1Wang Xinyi3Zhang Yongfeng1Qin Huilin1Wang Junzhi1

(1. College of Biology & Pharmacy, China Three Gorges Univ., Yichang 443000, China; 2. Hubei Aerospace Du Le Pharmaceutical Co., Ltd., Yichang 443100, China; 3. Medical College, China Three Gorges Univ., Yichang 443002, China)

AbstractTo investigate the protective effect of gastric mucosa of ethyl acetate part of endophytic fungi from Chaenomeles speciosa (sweet) Nakaion on gastric ulcer injury in mice, and to explore its possible mechanism, the experimental mice were randomly divided into control, model, ethyl acetate part of endophytic fungi from Chaenomeles speciosa (sweet) Nakaion (50 and 100) and omeprazole groups (20mg/kg), 15 mice each group. The gastric ulcers injury were generated by administration of the mixture of ethanol and aspirin which was made up of 10ml 80% ethanol and 15mg aspirin at the 4 hour after drugs on 5th day. The ulcer index, ulcer inhibition rate, histopathological changes, the H+/K+-ATPase, COX-2 and PGE2 activities in gastric mucosa were assessed. The ethyl acetate part of endophytic fungi from Chaenomeles speciosa (sweet) Nakaion (50,100mg/kg) might remarkably decrease H+/K+-ATPase, COX-2 activities, and increase PGE2 in gastric mucosa, ameliorate ulcer index, ulcer inhibition rate, histomorphology (P<0.05 and P<0.01). The ethyl acetate part of endophytic fungi from Chaenomeles speciosa (sweet) Nakaion possess a good protective effect on gastric mucosa injury in mice, inhibiting the activities of H+/K+-ATPase, COX-2, and enhancing PGE2 activity might be one of its molecular mechanisms; but its chemical composition and detailed active mechanisms of toxicity are under studying.

KeywordsEndophytic fungi from Chaenomeles speciosa (sweet) Nakaion;protective effect of gastric mucosa;H+/K+-ATPase;COX-2;PGE2