卷柏總黃酮對支氣管哮喘大鼠氣道的影響*

黃妮雯， 宋盛仁， 杜　娟

(貴州醫(yī)科大學(xué)附院 呼吸內(nèi)科, 貴州 貴陽　550004)

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卷柏總黃酮對支氣管哮喘大鼠氣道的影響*

黃妮雯， 宋盛仁， 杜娟*

(貴州醫(yī)科大學(xué)附院 呼吸內(nèi)科, 貴州 貴陽550004)

[摘要]目的： 觀察卷柏總黃酮(TFST)對哮喘大鼠氣道炎癥的影響，并探討其可能機(jī)制。 方法： 將48只雄性SD大鼠隨機(jī)分為對照組、哮喘模型組、TFST組，哮喘組與TFST組腹腔注射及霧化吸入卵蛋白誘導(dǎo)大鼠哮喘發(fā)作，TFST組預(yù)先給予TFST干預(yù)，對照組給予生理鹽水；酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測各組肺泡灌洗液(BALF)中白細(xì)胞介素-5(IL-5)水平，并進(jìn)行炎性細(xì)胞計(jì)數(shù)，SABC免疫組織化學(xué)法檢測氣道上皮細(xì)胞信號轉(zhuǎn)錄因子與轉(zhuǎn)錄活化因子1(STAT1)的表達(dá)，并對各指標(biāo)的關(guān)系進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果： TFST組大鼠氣道炎癥病理改變較哮喘組減輕，BALF中IL-5水平、白細(xì)胞總數(shù)(WBC)、嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)(EOS)及支氣管上皮細(xì)胞STAT1表達(dá)水平低于哮喘組(P<0.01)； BALF中IL-5水平與氣管上皮細(xì)胞STAT1水平呈正相關(guān)(r=0.56，P<0.05)。結(jié)論： TFST可降低哮喘大鼠IL-5的表達(dá)和炎性細(xì)胞聚積，與抑制STAT1的表達(dá)有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]卷柏總黃酮； 哮喘； 炎癥； 信號轉(zhuǎn)錄因子與轉(zhuǎn)錄活化因子1； 白細(xì)胞介素-5

氣道慢性炎癥是哮喘基本的病理生理學(xué)特征之一[1]，而白細(xì)胞介素-5(IL-5)的過度表達(dá)和持續(xù)作用可導(dǎo)致氣道的慢性炎癥[2]。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子(signal transducer and activator of transcription ，STAT)家族可在多種類型的組織及細(xì)胞中表達(dá)[3]，且具有眾多生物學(xué)功能，哮喘時(shí)STAT表達(dá)水平或功能可能異常[4]。STAT成員之一STAT1在哮喘的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，哮喘支氣管上皮細(xì)胞STAT1上調(diào)，并可誘導(dǎo)產(chǎn)生多種細(xì)胞因子如IL-5、白細(xì)胞介素-6、粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)等，進(jìn)一步使氣道炎癥細(xì)胞聚集[5]。卷柏為蕨類卷柏科卷柏屬植物，卷柏總黃酮(total flavonoids ofSelaginellatamariscina, TFST)為其主要活性成分[6]，具有抗炎抗腫瘤、抑菌抗病毒等多種作用，并可用于哮喘的治療[7]，但其作用機(jī)制尚不清楚。本研究探討TFST在調(diào)控哮喘氣道炎癥中的作用及可能機(jī)制。

1材料與方法

1.1材料

卷柏總黃酮購于吉林天藥藥物研發(fā)有限公司植物化學(xué)研究室，卵蛋白購于美國 sigma公司，白介素5(IL-5)ELISA試劑盒、SABC免疫組化染色試劑盒購于碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2方法

1.2.1分組及造模健康雄性SD大鼠 48 只(貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，隨機(jī)均分為正常對照組、哮喘組及TFST組(每組16只)。哮喘組及TFST組大鼠腹腔注射含氫氧化鋁200 mg及卵蛋白100 mg的1 mL混合液致敏，之后兩周給予卵蛋白超聲霧化激發(fā)，每天1次；TFST組大鼠在每次激發(fā)前30 min，給予卷柏總黃酮混懸液800 mg/kg灌胃，連續(xù)2周；對照組大鼠腹腔注射及霧化吸入生理鹽水。于給藥后第14天處死各組大鼠，并檢測相應(yīng)指標(biāo)。

1.2.2獲取大鼠支氣管肺泡灌洗液(bronchoalve-olar lavage fluid,BALF)用1%戊巴比妥鈉以33 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，打開胸腔后首先結(jié)扎右主支氣管并于大鼠氣管下部做橫切口,經(jīng)切口注入4 mL滅菌生理鹽水灌洗左肺15 s后回吸得到BALF。將獲取的BALF離心，用生理鹽水重懸加入血細(xì)胞計(jì)數(shù)器，在顯微鏡下計(jì)數(shù)WBC，按照各類細(xì)胞百分比計(jì)算嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)(EOS)。

1.2.3氣管壁及壁旁肺組織EOS浸潤密度取各組大鼠右肺中葉組織于多聚甲醛中固定后脫水、包埋、切片，行HE染色，400倍光鏡下觀察支氣管壁及其壁旁肺組織EOS的浸潤情況；隨機(jī)選取10個(gè)視野計(jì)數(shù)EOS，取各視野的平均值作為代表值。

1.2.4IL-5測定BALF離心后取其上清液,用ELISA測定IL-5水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.5STAT1表達(dá)采用鏈霉親和素-生物素復(fù)合物(SABC)法對氣道上皮細(xì)胞進(jìn)行STAT1免疫組織化學(xué)染色，按試劑盒說明書測定STAT1表達(dá)。細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)明顯的黃色顆粒為陽性細(xì)胞，陽性細(xì)胞數(shù)<10%為(-)，10%～<25%為(+)，25%～50%為(++)，>50%為(+++)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié)果

2.1一般情況

造模后，哮喘組大鼠均出現(xiàn)明顯煩躁、呼吸短促、腹肌快速抽搐、咳嗽等哮喘發(fā)作癥狀；TFST組大鼠發(fā)作程度明顯較哮喘組減輕，對照組大鼠無明顯哮喘發(fā)作癥狀。

2.2BALF中WBC及EOS數(shù)量、IL-5水平

TFST組BALF中IL-5水平及WBC及EOS數(shù)量低于哮喘組，而高于正常對照組。見表1。

表1　3組大鼠BALF中IL-5水平、炎性細(xì)胞水平

(1)與對照組比較，P<0.01；(2)與哮喘組比較，P<0.01

2.3氣管壁及壁旁肺組織EOS浸潤度

對照組、哮喘組及TFST組大鼠氣管壁及壁旁肺組織EOS的浸潤度分別為400倍光鏡下每個(gè)視野(7±2)、(29±6)、(18±2)個(gè)細(xì)胞，3組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，TFST組低于哮喘組。

2.4支氣管上皮細(xì)胞STAT1表達(dá)

TFST組較哮喘組STAT1的表達(dá)減少。見表2、圖1。

2.5各指標(biāo)間的相關(guān)性分析

大鼠氣管壁及壁旁肺組織中EOS計(jì)數(shù)與BALF中EOS計(jì)數(shù)呈正相關(guān)，在TFST組中r=0.87，P<0.01；在哮喘組r=0.80，P<0.01。BALF中IL-5水平與EOS計(jì)數(shù)呈正相關(guān)，在哮喘組中r=0.83，P<0.01；TFST組r=0.79，P<0.01。大鼠支氣管上皮細(xì)胞STATl表達(dá)與BALF中IL-5水平呈正相關(guān)， 哮喘組r= 0.79，P<0.01；TFST組r=0.56，P<0.05。

表2　3組大鼠支氣管上皮細(xì)胞STAT1表達(dá)陽性率

(1)為與對照組比較，P<0.01；(2)為與哮喘組比較，P<0.01

注：A為對照組大鼠，支氣管上皮完整，無明顯STAT1表達(dá)；B為哮喘組大鼠，支氣管上皮細(xì)胞受損，可見明顯STAT1表達(dá)；C 為TFST組大鼠，支氣管上皮細(xì)胞受損及STAT1表達(dá)較哮喘組減少圖1　三組大鼠支氣管上皮細(xì)胞STAT1表達(dá)(SABC，×200)Fig.1　STAT1 protein expression of bronchial epithelial cells in each group

3討論

氣道慢性炎癥在哮喘發(fā)生發(fā)展中起至關(guān)重要的作用,所以抑制氣道炎癥歷來為控制哮喘的關(guān)鍵。卷柏屬植物在中國資源豐富并且分布廣泛,其主要活性成分為TFST[8-9]。民間用其治療慢性支氣管炎及哮喘等氣道慢性炎癥，但對于其作用機(jī)制缺乏相應(yīng)的科學(xué)研究。本研究旨在探討TFST對于哮喘大鼠氣道炎癥的影響及可能的機(jī)制。

研究表明，IL-5的過度表達(dá)可持續(xù)活化骨髓嗜酸性祖細(xì)胞，使EOS產(chǎn)生增多,而EOS在氣道蓄積可導(dǎo)致慢性氣道炎癥[10]。STAT蛋白家族對信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響主要通過細(xì)胞因子介導(dǎo)， 細(xì)胞因子可通過 JAK/STAT途徑激活 STAT的表達(dá)而誘發(fā)炎癥疾病的發(fā)生[11]。與哮喘關(guān)系最緊密的STAT家族成員為STAT1，其在哮喘氣道慢性非特異性炎癥的發(fā)生中起重要作用[12]。存在慢性氣道炎癥時(shí), 支氣管上皮細(xì)胞STAT1的選擇性活化及過度表達(dá)，進(jìn)一步使其合成及分泌多種細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子又反過來誘發(fā)炎癥細(xì)胞活化，使其釋放炎癥介質(zhì)并促進(jìn)炎癥細(xì)胞的趨化[13]。為探討TFST對哮喘氣道炎癥的影響，以及氣道上皮細(xì)胞STAT1的表達(dá)及與IL-5的相關(guān)性，本研究建立了標(biāo)準(zhǔn)的大鼠哮喘模型，用TFST灌胃干預(yù)，結(jié)果表明予TFST干預(yù)后大鼠BALF中EOS及炎性細(xì)胞總數(shù)較哮喘模型大鼠明顯減少；BALF中IL-5水平也明顯降低，EOS和IL-5呈正相關(guān)，說明TFST具有調(diào)控哮喘大鼠氣道炎癥的作用，且能降低大鼠氣道上皮細(xì)胞 STAT1的表達(dá)，提示TFST有可能是通過抑制 STAT1的表達(dá)來抑制哮喘時(shí)細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，從而控制哮喘的病理變化。

TFST對哮喘大鼠氣道炎癥有明顯的抑制作用，可以減少IL-5的表達(dá)和炎性細(xì)胞聚積，與降低 STAT1的表達(dá)有關(guān)。

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(2016-04-12收稿，2016-06-04修回)

中文編輯： 周凌； 英文編輯： 趙毅

*通信作者E-mail:dujuan0888@tom.com

[中圖分類號]R562.25

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號]1000-2707(2016)07-0797-03

DOI:10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.07.013

Effect of Total Flavonoids ofSelaginellatamariscinaon Airway of Asthmatic Rats

HUANG Niwen, SONG Shengren, DU Juan

(DepartmentofInternalMedicine,theAffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004，Guizhou，China)

[Abstract]Objective: To investigate the total flavonoids of Selaginella tamariscinaon (TFST) on airway inflammation and the expression of STAT1 protein in bronchial epithelium of asthma rats. Methods： 48 male rats were randomly divided into control group, bronchial asthma model group and TFST group. The asthma model of rats was set up with nebulization aspiration and intraperitoneal injection of ovalbumin (OVA).The TFST group was given TFST protection interventions in advance. Using ELISA for each group of bronchoalveolar lavage fluid (BALF) of interleukin-5 (IL-5) concentrations were measured and to detect the number of inflammatory cells in BALF. STAT1 protein expression in airway epithelial cells was determined by SABC immunohistochemistry method. Results： The pathological changes of airway inflammation in TFST group were significantly reduced, of which level of IL-5, WBC counts and EOS counts in BALF were significantly decreased compared with that in the asthma model group (P<0.01).The STAT1 protein expression in bronchial epithelium and the concentration of IL-5 in BALF were obviously increased in bronchial asthma model group，and positively related. The expression of STAT1 in TFST group was significantly lower than those in asthma model group. Conclusion: TFST can inhibit the IL-5 of asthmatic rats and accumulation of inflammatory cells, the mechanism may involve in inhibiting the expression of STAT1.

[Key words]total flavonoids of Selaginella tamariscinaon； asthma； inflammation；signal transducer and activator of transcription; interluekin-5

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-07-17網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160717.1318.040.html