惡性黑素瘤患者KIT基因突變分析

呂矯潔，孔蘊(yùn)毅，蔡　旭，周曉燕復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理科，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海200032

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惡性黑素瘤患者KIT基因突變分析

呂矯潔，孔蘊(yùn)毅，蔡旭，周曉燕
復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理科，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海200032

［摘要］背景與目的：KIT基因突變在惡性黑素瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。該研究旨在探討KIT基因在各種組織學(xué)類型惡性黑素瘤患者中的突變率和類型。方法：用聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增和直接測序方法檢測144例惡性黑素瘤患者腫瘤組織中KIT外顯子9、11、13和17的突變情況。結(jié)果：KIT基因在惡性黑素瘤患者中的總體突變率為9.0%（13/144）。在肢端型、黏膜型、慢性日光損傷型（chronic sun-induced damage，CSD）和非慢性日光損傷型（non-chronic sun-induced damage，non-CSD）惡性黑素瘤組織中，KIT基因的突變率分別為7.7%（4/52）、20.0%（7/35）、14.3%（1/7）和2.8%（1/36）；13例KIT基因突變中，有1例位于第9外顯子，9例位于第11外顯子，3例位于第13外顯子。第11外顯子L576P為最常見的突變類型。結(jié)論：KIT基因突變在惡性黑素瘤患者中最常見于第11外顯子，它可能是惡性黑素瘤治療藥物作用的潛在靶點。

［關(guān)鍵詞］KIT；基因突變；惡性黑素瘤

惡性黑素瘤是皮膚最常見的致命惡性腫瘤，其發(fā)病率在過去的幾十年中增長迅速［1］?；谄浣馄蕦W(xué)位置和陽光照射的程度，惡性黑素瘤分為4個亞型：肢端型、黏膜型、慢性日光損傷型（chronic sun-induced damage，CSD）和非慢性日光損傷型（non-chronic sun-induced damage，non-CSD）［2］。肢端惡性黑素瘤是皮膚惡性黑素瘤一種獨特類型，見于無毛發(fā)被覆部位的肢端皮膚，即手掌、足底和甲床。它在白色人種中，僅占所有皮膚惡性黑素瘤的1%～7%，然而它在黑色皮膚人種和亞洲黃色人種中最為普遍［3］。Chi等［4］統(tǒng)計的數(shù)據(jù)顯示，肢端惡性黑素瘤是中國人最常見的類型，約占所有惡性黑素瘤的41.8%，而黏膜惡性黑素瘤占第2位，為22.6%。

與皮膚受紫外線暴露導(dǎo)致的惡性黑素瘤不同，肢端惡性黑素瘤和黏膜惡性黑素瘤的BRAF的突變率較低，卻更容易發(fā)生KIT的突變［5］。KIT（CD117）是干細(xì)胞因子編碼酪氨酸激酶受體，在黑素細(xì)胞的發(fā)展、轉(zhuǎn)移和增殖中起重要作用［6］。它是數(shù)個小分子抑制劑如伊馬替尼、舒尼替尼的作用靶點，這些藥物已經(jīng)用于臨床，并且能明顯提高具有KIT基因突變的胃腸道間質(zhì)瘤患者的生存率。有研究表明，伊馬替尼顯著延長了在轉(zhuǎn)移性惡性黑素瘤中表達(dá)KIT基因突變患者的生存期［7］。然而，關(guān)于KIT在各類型惡性黑素瘤中的基因突變的大規(guī)模研究很少，因此，本研究收集了復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院收治的144例惡性黑素瘤患者的組織標(biāo)本，進(jìn)行了KIT基因突變檢測，以期發(fā)現(xiàn)其與西方白種人所存在的差異。

1　資料和方法

1.1研究對象

收集復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院2009—2014年間住院和門診惡性黑素瘤患者的病灶組織蠟塊144例，均經(jīng)HE染色和病理診斷證實。144例患者分別為肢端型、黏膜型、CSD和non-CSD惡性黑素瘤52、35、7和36例，其余14例為原發(fā)灶不明確無法分類者。

1.2基因突變的篩查

參照文獻(xiàn)［8］，按照試劑盒說明書提取基因組DNA（QIAamp DNA mini kit），采用直接測序方法檢測KIT基因第9、11、13和17外顯子突變情況，引物序列及退火溫度見表1。反應(yīng)條件為：94℃反應(yīng)7min；94℃反應(yīng)30s；每種引物在其相關(guān)的退火溫度下進(jìn)行30s；在72℃30s中進(jìn)行35個周期；72℃5min。聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）產(chǎn)物通過2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定并用PCR純化試劑盒（QIA quick PCR purification kit）純化后，所有純化產(chǎn)物均在ABI3730XL測序儀上行雙向測序驗證。所有陽性標(biāo)本需經(jīng)2次獨立實驗重復(fù)證實。

表1　用于測序的引物Tab.1　The primers used for sequencing

2　結(jié)　果

2.1144例惡性黑素瘤患者中各組織學(xué)類型KIT基因突變率（表2）

KIT基因在144例惡性黑素瘤患者中總體突變率為9.0%。其在肢端型、黏膜型、CSD和non-CSD惡性黑素瘤中突變率分別為7.7%（4/52）、20.0%（7/35）、14.3%（1/7）和2.8%（1/36）。在肢端型，KIT基因在第11、13外顯子突變率分別為75.0%（3/4）和25.0%（1/4）。而在黏膜型，KIT基因在第9、11和13外顯子突變率為14.3%（1/7）、71.4%（5/7）和14.3%（1/7）。在CSD和non-CSD惡性黑素瘤中，各有1例突變，分別位于第11外顯子和第13外顯子。在所有KIT基因突變中，無一例位于第17外顯子。

2.2KIT基因突變類型

檢測到的13例基因突變中，1例突變位于KIT基因第9外顯子，為鳥嘌呤（G）-腺嘌呤（A）的突變，密碼子GTT變?yōu)锳TT，為V489I突變，使得纈氨酸被異亮氨酸取代。9例突變位于KIT基因第11外顯子，其中L576P（圖1）共3例，為胸腺嘧啶（T）-胞嘧啶（C）的突變，密碼子CTT突變?yōu)镃CT，該突變導(dǎo)致膜旁結(jié)構(gòu)域第576位亮氨酸被脯氨酸取代；V559G（圖2）和V559D（圖3）各1例：V559G為胸腺嘧啶（T）-鳥嘌呤（G）的突變，密碼子GTT突為GGT，使纈氨酸被甘氨酸取代；V559D為胸腺嘧啶（T）-腺嘌呤（A）的突變，密碼子GTT突變?yōu)镚AT，使纈氨酸被天冬氨酸取代；其余4例分別為587密碼子AAC＞AAT（同義）且587-588密碼子間插入CAC AAA TGG GAG TTT CCC AGA，可導(dǎo)致形成587-588insHKWEFPR；578-579密碼子間插入GTT CCT TAT，可導(dǎo)致578-579insVPY；580-581密碼子間插入27個堿基，可導(dǎo)致形成580-581insNPTQLPYDH；557-559密碼子雜合性缺失并插入TTT，可導(dǎo)致形成557-559delWKVinsF。3例突變位于KIT基因第13外顯子，其中2例為K642E（圖4），為腺嘌呤（A）-鳥嘌呤（G）的突變，密碼子AAA突變?yōu)镚AA，使賴氨酸被谷氨酸取代；1例為T632I，為胞嘧啶（C）-胸腺嘧啶（T）的突變，密碼子ACA突變?yōu)锳TA，使蘇氨酸被異亮氨酸取代。

表2　各組織學(xué)類型中KIT基因突變Tab.2　Genetic mutations of KIT in melanoma subtypes

圖1　L576P突變Fig.1　L576P mutation

圖2　V559G突變Fig.2　V559G mutation

圖3　V559D突變Fig.3　V559D mutation

圖4　K642E突變Fig.4　K642E mutation

3　討　論

中國人與西方白種人在惡性黑素瘤的發(fā)病上存在顯著差異。在我國惡性黑素瘤患者中，以肢端型和黏膜型為主，而在西方白種人則以CSD為主，這可能與紫外線照射以及基因水平不同有關(guān)。Chi等［4］在中國人522例的大樣本研究中報道，肢端型占41.8%（218/522），黏膜型占22.6%（118/522），而Kong等［7］研究也發(fā)現(xiàn)中國人肢端型占38.4%（193/502），黏膜型占33.3%（167/502），與以往來自日本和中國臺灣省的報道數(shù)據(jù)基本一致［9-11］。在本報道中，肢端型占36.1%（52/144），黏膜型占24.3%（35/144），這兩種組織學(xué)類型占我國惡性黑素瘤一半以上，且確診時臨床分期較晚，預(yù)后差，是我國惡性黑素瘤致死的主要原因。

本組研究中，KIT基因突變在黏膜型和CSD中發(fā)生率較高，而在肢端型及non-CSD中發(fā)生率相對較低。本組CSD的KIT突變率為14.3%（1/7），而Kong等［7］報道中CSD的KIT突變率達(dá)到20.7%（6/29），這可能與本組研究中CSD病例數(shù)樣本量相對較少有關(guān)。

本研究報道的黏膜型惡性黑素瘤KIT基因突變比例與文獻(xiàn)報道比例相似，而肢端型則略低于文獻(xiàn)報道。KIT在黏膜型惡性黑素瘤患者中的突變率為20.0%（7/35），與Curtin等［12］的21.1%（8/38），Torres-Cabala等［13］的17.3%（9/52）、Carvajal等［14］的18.3%（17/93）、Abysheva等［15］的16.7%（8/48）、Beadling等［5］的15.6%（7/45）、Antonescu等［16］的15.0%（3/20）和Satzger等［17］的16.2%（6/37）數(shù)據(jù)結(jié)果相似，而高于Kong等［7］的9.6%（16/167）。這可能與所檢測樣本量的大小及來源于不同解剖部位有關(guān)。有待于進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，并且按口腔黏膜、消化道黏膜等不同部位來分類檢測。本次檢測發(fā)現(xiàn)，KIT基因突變在肢端型惡性黑素瘤患者中，突變率為7.7%（4/52），比Beadling等［5］的2 3.1%（3/1 3）、Yu n等［1 8］的21.4%（18/84）、Mazurenko等［19］28.6%（4/14）、Carvajal等［14］的25.0%（4/40）和Curtin等［12］的10.7%（3/28）數(shù)值低，這些差異可能和樣本量大小、人種差異等多方面的因素有關(guān)。在中國人惡性黑素瘤KIT突變的最大組報道中，Kong等［7］的突變陽性率也相對較低，為11.9%（23/193），且其研究結(jié)果表明，KIT基因突變與年齡、性別、分級、厚度以及原發(fā)灶有無潰瘍無顯著相關(guān)性，但存在KIT基因突變的惡性黑素瘤患者中位生存期（30個月）遠(yuǎn)低于不存在該突變的患者（53個月），并提出KIT基因突變可能是惡性黑素瘤的獨立預(yù)后不良因素。

本研究檢測到，KIT基因的突變包含第9、11、13和17外顯子。13例突變中，第9外顯子突變率為7.7%（1/13），第11外顯子突變率為69.2%（9/13），第13外顯子突變率為23.1%（3/13），第17外顯子突變率為0%（0/13），以第11外顯子突變?yōu)橹鳎渲蠰576P共3例，是最常見的突變類型。其次是第13號外顯子（3例），其中2例突變?yōu)镵642E。文獻(xiàn)報道的最常見KIT基因突變外顯子類型是第11號外顯子（如L576P、W557R、V559A和V559D），其次是第13號外顯子（如K642E）和第17號外顯子（如D816H）［5，13，18，20-22］，本研究結(jié)果與文獻(xiàn)報道相符。且有研究表明，L576P、K642E為伊馬替尼敏感型突變［14，23-24］，但確切結(jié)論尚需大樣本臨床試驗驗證。本組研究中所檢測到的其余突變對功能的影響未見報道。

綜上所述，本研究初步研究了本院收治的惡性黑素瘤患者中KIT基因突變情況，證實了黏膜型惡性黑素瘤及CSD兩種組織學(xué)類型中KIT突變率較高。在這些突變中，以第11外顯子突變?yōu)橹鳌＿@些研究將為針對KIT基因突變尤其是第11外顯子突變的靶向藥物在中國惡性黑素瘤患者中的應(yīng)用提供分子水平的依據(jù)。

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DOI：10.3969/j.issn.1007-3969.2016.05.008

中圖分類號：R735.9

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1007-3639（2016）05-0399-05

收稿日期：（2015-02-04修回日期：2016-01-17）

基金項目：上海市自然科學(xué)基金（12ZR1406600）；國家臨床重點專科建設(shè)項目。通信作者：孔蘊(yùn)毅E-mail：kyunyidb@126.com

Analysis of KIT gene mutation in melanoma patients

Lü Jiaojie， KONG Yunyi， CAI Xu， ZHOU Xiaoyan
（Department of Pathology， Fudan University Shanghai Cancer Center， Department of Oncology，Shanghai Medical College， Fudan University， Shanghai 200032， China）Correspondence to： KONG Yunyi E-mail： kyunyidb@126.com

［Abstract］Background and purpose： KIT mutation plays an important role during the pathogenesis of melanoma. This study was designed to investigate the mutation status of KIT in different subtypes of melanoma. Methods： A total number of 144 cases of melanoma were analyzed for KIT mutation （exon 9， 11， 13 and 17） by DNA sequencing using paraffin-embedded tissues. Results： The total incidence of KIT mutation in melanoma was 9.0% （13/144）. KIT mutations in acral melanoma， mucosal melanoma， melanoma on skin with chronic sun-induced damage （CSD） and melanoma on skin without chronic sun-induced damage （non-CSD） was 7.7% （4/52）， 20% （7/35）， 14.3% （1/7） and 2.8% （1/36）， respectively. Among 13 cases with KIT mutation， 1 mutation lay in exon 9， 9 lay in exon 11 and 3 in exon 13. L576P in exon 11 was the most common type of mutation. Conclusion： The most prevalent type of KIT mutation in patients lies in exon 11. KIT mutation could be the potential drug target in melanoma therapy.

［Key words］KIT； Gene mutation； Melanoma