整合素αvβ8、p38及ERK1/2在膽道閉鎖患兒肝臟中的表達(dá)及意義

高婷，詹江華，丁美云，衛(wèi)園園

整合素αvβ8、p38及ERK1/2在膽道閉鎖患兒肝臟中的表達(dá)及意義

高婷1，詹江華2△，丁美云1，衛(wèi)園園1

摘要：目的研究轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF）-β1通路相關(guān)調(diào)節(jié)蛋白整合素αvβ8、p38及細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2 （ERK1/2）蛋白在膽道閉鎖（BA）患兒肝臟中的表達(dá)情況及在肝纖維化進(jìn)程中的作用。方法選取天津市兒童醫(yī)院普外科收治的BA患兒15例為Kasai組，膽管擴(kuò)張癥患兒10例為膽擴(kuò)組；天津市第一中心醫(yī)院小兒器官移植科行Kasai手術(shù)后因肝功能衰竭行肝移植的BA患兒10例為肝移植組。取患兒肝右葉前緣標(biāo)本，行HE染色觀(guān)察肝纖維化程度，行免疫組化染色檢測(cè)αvβ8、p38及ERK1/2在肝組織中的表達(dá)情況。結(jié)果HE染色示，膽擴(kuò)組偶見(jiàn)纖維細(xì)胞增生；Kasai組匯管區(qū)增寬，纖維組織增生、橋接纖維化現(xiàn)象普遍，可見(jiàn)假小葉形成；移植組匯管區(qū)明顯增寬，纖維組織增生較重，廣泛橋接纖維組織形成，假小葉明顯。免疫組化染色示，膽擴(kuò)組αvβ8和ERK1/2表達(dá)為弱陽(yáng)性，p38為陰性表達(dá)；Kasai組αvβ8、p38及ERK1/2蛋白均在肝細(xì)胞胞質(zhì)、匯管區(qū)膽管上皮細(xì)胞胞質(zhì)及血管內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)中強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)；肝移植組αvβ8、p38及ERK1/2蛋白皆為強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。Kasai組和肝移植組αvβ8、p38及ERK1/2表達(dá)水平明顯高于膽擴(kuò)組（均P＜0.05），Kasai組與肝移植組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論αvβ8、p38及ERK1/2表達(dá)在BA肝纖維化過(guò)程中明顯增高，αvβ8、p38及ERK1/2可能參與并促進(jìn)BA肝纖維進(jìn)程。

關(guān)鍵詞：膽道閉鎖；肝硬化；p38絲裂原活化蛋白激酶類(lèi)；絲裂原活化蛋白激酶1；肝纖維化；αvβ8；p38；ERK1/2

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81570471）；天津市衛(wèi)生行業(yè)重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目（14KG129）；天津市衛(wèi)生局科技基金資助項(xiàng)目（2014KR09）

作者單位：1天津醫(yī)科大學(xué)研究生院（郵編300070）；2天津市兒童醫(yī)院，天津市兒科研究所

作者簡(jiǎn)介：高婷（1989），女，碩士在讀，主要從事小兒普外、膽道閉鎖方面的研究

△

通訊作者E-mail：zhanjianghuatj@163.com

1　資料與方法

1.1一般資料收集2014年1月—2016年3月間天津市兒童醫(yī)院普外科收治的BA患兒15例為Kasai組，男4例，女11例，日齡19～112 d，平均（63±28）d；膽管擴(kuò)張癥患兒10例為膽擴(kuò)組，男3例，女7例，日齡350～1 720 d，平均（820± 681）d；膽擴(kuò)組及Kasai組均行肝臟活檢分別確診為膽管擴(kuò)張癥及BA患兒，且均行Kasai手術(shù)。另收集2013年1月—2014年3月天津市第一中心醫(yī)院小兒器官移植科行Kasai手術(shù)后因肝功能衰竭行肝移植的BA患兒10例為肝移植組，男6例，女4例，日齡215～2 150 d，平均（1 030±499）d。實(shí)驗(yàn)用標(biāo)本取自患兒肝右葉前緣，用10%福爾馬林溶液固定8～24 h后，經(jīng)石蠟包埋儲(chǔ)存。本研究經(jīng)天津市兒童醫(yī)院及天津市第一中心醫(yī)院倫理委員會(huì)審查通過(guò)。

1.2主要試劑與儀器αvβ8抗體購(gòu)自北京博奧生物技術(shù)有限公司；p38、ERK1抗體、二抗（辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔聚合物）、3，3-二氨基聯(lián)苯胺（3，3-diaminobenzidine,DAB）顯色試劑盒均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；ERK2抗體購(gòu)自Santa Cruz Biotechnology,Inc。定量分析所采用的Image Pro Plus 5.0自動(dòng)分析系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Media Cybernetics公司。

1.3組織學(xué)檢測(cè)將蠟塊標(biāo)本連續(xù)4 μm切片，分別進(jìn)行HE染色及免疫組化染色。（1）HE染色。病理切片經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度乙醇水洗，浸染蘇木素5 min，酸化伊紅乙醇液浸染2 min，常規(guī)梯度乙醇脫水，透明劑浸泡至透明，中性樹(shù)膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察肝組織細(xì)胞發(fā)育、肝纖維化程度。（2）免疫組化染色。病理切片常規(guī)脫蠟至水，經(jīng)枸櫞酸鹽緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)15 min，冷卻至室溫，PBS沖洗5 min×3次，于3%H2O2，37℃中孵育10 min，PBS沖洗5 min×3次，滴加一抗（αvβ8、p38、ERK1、ERK2均為1∶200），于冰箱中4℃過(guò)夜，取出置于室溫，PBS洗5 min×3次，加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗于37℃下孵育30 min，PBS洗5 min×3次，DAB顯色5 min，充分水洗，蘇木素液染核，常規(guī)脫水、透明、中性樹(shù)膠封片，在低倍鏡（×100）下觀(guān)察切片染色（棕色）區(qū)域，高倍鏡（×400）下辨別不同陽(yáng)性細(xì)胞及其表達(dá)情況。

1.4免疫組化結(jié)果判斷參照文獻(xiàn)［5］免疫組化陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)。（1）定性分析。高倍鏡下計(jì)算100個(gè)細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比，無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞為0分，≤10%為1分，11%～50%為2分，＞50%為3分。再根據(jù)染色強(qiáng)度定為無(wú)棕黃色0分、淡棕黃色1分、棕黃色2分、棕褐色3分。兩項(xiàng)評(píng)分相加判定結(jié)果：0分為陰性，1～2分為弱陽(yáng)性，3～4分為陽(yáng)性，5～6分為強(qiáng)陽(yáng)性。（2）半定量分析。于每張切片陽(yáng)性部位處讀取任意5個(gè)視野，用同一計(jì)算機(jī)成像系統(tǒng)留取100倍顯微鏡下圖片，Image pro-plus 5.0分析圖片計(jì)算αvβ8、p38、ERK1/2蛋白的平均光密度值（AOD），AOD=肝組織陽(yáng)性細(xì)胞光密度總和/陽(yáng)性細(xì)胞所占面積。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，正態(tài)分布的計(jì)量資料用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較滿(mǎn)足方差齊性采用Bonferroni法，方差非齊性采用Tamhane’s法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1HE染色結(jié)果膽擴(kuò)組偶見(jiàn)纖維細(xì)胞增生；Kasai組匯管區(qū)增寬，纖維組織增生、橋接纖維化現(xiàn)象普遍，可見(jiàn)假小葉形成；肝移植組匯管區(qū)增寬，纖維組織增生較重，廣泛橋接纖維組織較重，假小葉明顯，見(jiàn)圖1。

2.2免疫組化定性分析結(jié)果 （1）αvβ8蛋白。在3組肝細(xì)胞、匯管區(qū)膽管上皮細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中均有表達(dá)，在膽擴(kuò)組呈弱陽(yáng)性表達(dá)，在Kasai組和肝移植組呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，見(jiàn)圖2A～C。（2）p38蛋白。在膽擴(kuò)組匯管區(qū)膽管上皮細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞呈陰性表達(dá)，在Kasai組及肝移植組肝細(xì)胞、匯管區(qū)膽管上皮細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)中強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，見(jiàn)圖2D～F。（3）ERK1/2蛋白。在膽擴(kuò)組僅在血管內(nèi)皮細(xì)胞、肝竇周?chē)?xì)胞胞質(zhì)中有弱陽(yáng)性表達(dá)，在Kasai組及肝移植組不僅在血管內(nèi)皮細(xì)胞、肝竇周?chē)?xì)胞胞質(zhì)中強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，還在膽管上皮細(xì)胞及肝細(xì)胞中呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，見(jiàn)圖3。

2.3免疫組化半定量分析結(jié)果Kasai組和肝移植組αvβ8、p38和ERK1/2蛋白表達(dá)水平均高于膽擴(kuò)組（均P＜0.05），Kasai組與肝移植組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表1。

Tab.1　Comparison of αvβ8,p38 protein and ERK1/2 expressions in liver in three groups表1　3組肝組織αvβ8、p38和ERK1/2蛋白表達(dá)水平的比較　　（±s）

Tab.1　Comparison of αvβ8,p38 protein and ERK1/2 expressions in liver in three groups表1　3組肝組織αvβ8、p38和ERK1/2蛋白表達(dá)水平的比較　　（±s）

＊P＜0.05；a與膽擴(kuò)組比較，P＜0.05

組別膽擴(kuò)組Kasai組肝移植組F n 10 15 10 αvβ8 0.106±0.009 0.147±0.023a0.147±0.012a21.397＊p38 0.103±0.005 0.134±0.018a0.151±0.016a23.121＊ERK1 0.113±0.011 0.133±0.019a0.143±0.018a5.633＊ERK2 0.118±0.018 0.147±0.017a0.156±0.009a10.412＊

3　討論

BA患兒肝臟以肝內(nèi)、外膽管梗阻，進(jìn)行性炎癥及肝纖維化為主要病理特征，早期行Kasai手術(shù)雖可以改善膽汁淤積，但不能使肝纖維化進(jìn)程終止［6］。在BA肝纖維化進(jìn)程中，TGF-β1信號(hào)通路蛋白在BA肝纖維化過(guò)程中起重要作用，TGF-β1信號(hào)通路激活后，誘導(dǎo)肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)Smad2/3磷酸化生成磷酸化-Smad2/3（p-Smad2/3），p-Smad2/3與Smad4形成絡(luò)合物，并移向細(xì)胞核，啟動(dòng)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的基因轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)肝纖維化進(jìn)程［2，5］。αvβ8及相關(guān)激酶作為T(mén)GF-β1信號(hào)通路的調(diào)節(jié)蛋白，在肝纖維化中的作用已有較多研究［3，7］，但其在BA患兒肝臟中的表達(dá)情況尚少見(jiàn)報(bào)道。

3.1αvβ8參與激活TGF-β1通路來(lái)促進(jìn)BA肝纖維化進(jìn)展αvβ8作為一種細(xì)胞黏附分子，通過(guò)與TGF-β1上特定的潛在相關(guān)肽-1（latencyassociated peptide-1，LAP-1）區(qū)域相結(jié)合，然后促進(jìn)膜型1-基質(zhì)金屬蛋白酶（membrane-type 1 matrix metalloproteinase，MT1-MMP）與TGF-β1上的LAP-1結(jié)合，進(jìn)而使MT1-MMP 與αvβ8-TGF-β1形成復(fù)合物，通過(guò)其相互作用，激活TGF-β1信號(hào)通路［8-9］。本研究中αvβ8蛋白在3組中均有陽(yáng)性表達(dá)，主要在肝細(xì)胞、匯管區(qū)膽管上皮細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，但在膽擴(kuò)組呈弱陽(yáng)性表達(dá)，在Kasai組及肝移植組呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)；Kasai組及肝移植組αvβ8蛋白表達(dá)水平較膽擴(kuò)組高。另外，膽擴(kuò)組偶見(jiàn)纖維細(xì)胞增生，而Kasai組和肝移植組纖維組織增生較重，提示αvβ8在肝纖維化過(guò)程中表達(dá)增多，可能參與BA肝纖維化進(jìn)程。本研究與Iordanskaia等［10-11］的研究結(jié)果一致。本研究中Kasai組αvβ8蛋白表達(dá)水平與肝移植組無(wú)明顯差異，這可能與肝移植組選材時(shí)所處的肝纖維化分級(jí)情況及樣本量有關(guān)。3.2p38、ERK1/2通過(guò)參與TGF-β1信號(hào)通路相關(guān)蛋白磷酸化及核易位過(guò)程促進(jìn)肝纖維化進(jìn)程p38、ERK1/2是絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號(hào)通路中的不同亞型，Jiang等［12］研究結(jié)果顯示p38、ERK1/2抑制劑通過(guò)阻斷Smad2/3磷酸化及p-Smad2/3與Smad4核易位，進(jìn)而阻斷Smad2/3/4復(fù)合物形成，導(dǎo)致PAI-1蛋白及mRNA表達(dá)降低，提示MAPK信號(hào)蛋白參與并促進(jìn)肝纖維化進(jìn)程，目前MAPK信號(hào)通路在BA患兒肝臟中的表達(dá)屬于較新的研究領(lǐng)域。本研究結(jié)果顯示，p38、ERK1/2在BA患兒肝臟中肝細(xì)胞胞質(zhì)、匯管區(qū)膽管上皮細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)等中強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，且其表達(dá)水平較對(duì)照組明顯增高，提示其可能在BA肝纖維化進(jìn)程中起重要作用；而Kasai組與肝移植組比較差異雖無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但在數(shù)值上較Kasai組高，提示p38、ERK1/2可能與肝纖維化嚴(yán)重程度有關(guān)，但尚需進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

綜上所述，αvβ8、p38和ERK1/2表達(dá)在BA肝纖維化過(guò)程中明顯增高，αvβ8通過(guò)激活TGF-β1信號(hào)通路，進(jìn)而促進(jìn)肝纖維化進(jìn)程；p38、ERK1/2通過(guò)影響TGF-β1信號(hào)通路蛋白磷酸化及核易位來(lái)促進(jìn)肝纖維化進(jìn)程。

（圖1～3見(jiàn)插頁(yè)）

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（2016-04-27收稿2016-05-12修回）

（本文編輯陳麗潔）

中圖分類(lèi)號(hào)：R726.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

DOI：10.11958/20160362

The expression and significance of integrin αvβ8,p38 and ERK1/2 in the liver of children with biliary atresia

GAO Ting1，ZHAN Jianghua2△，DING Meiyun1，Wei Yuanyuan1
1 The Graduate School of Tianjin Medical University,Tianjin 300070,China;
2 Tianjin Children’s Hospital,Tianjin Pediatrics Institute△Corresponding AuthorE-mail：zhanjianghuatj@163.com

Abstract：ObjectiveTo investigate the expression and significance of integrin αvβ8,p38 and extracellular signalregulated protein kinase 1/2(ERK1/2)proteins,which are TGF-β1 pathway related regulatory protein,in liver fibrosis of children with biliary atresia(BA).MethodsFifteen cases of BA(Kasai group)and 10 cases of congenital biliary dilatation (CBD group)were collected in Tianjin Children’s Hospital.And liver biopsy specimens were collected in Tianjin first central hospital,including 10 cases of BA children who underwent liver transplantation due to liver failure after Kasai operation (liver transplantation group).The specimens of front part of the right lobe of the liver were taken for HE and immunohistochemistry(IHC)staining.The expressions of αvβ8,p38 and ERK1/2 in liver were observed by IHC staining in three groups of liver tissues.ResultsHE staining showed fibroblast hyperplasia occasionally in CBD group,portal area expansion,fibrous tissue proliferation and wide spread bridging fibrosis with few pseudo lobules in Kasai group.In transplantation group,portal area was widened,the degree of fibrosis was severe and bridging fibrosis generally formed resulted in pseudo lobules widely.Imunohistochemistry showed that the expressions of αvβ8 and ERK1/2 were weakly positive,and the expression of p38 was negative in CBD group.In Kasai group,the expressions of αvβ8,p38 and ERK1/2 proteins were all strongly positive in liver cytoplasm,biliary epithelial cells and vascular endothelial cell cytoplasm.In liver transplantation group the expressions of αvβ8,p38 and ERK1/2 proteins were all strongly positive.The semi-quantitative analysis showed that the expressions levels of αvβ8,p38 and ERK1/2 were significantly higher in Kasai and liver transplantation groups than those of CBD group(P<0.05).There were no significant differences in expression levels of αvβ 8,p38 and ERK1/2 between Kasai group and transplantation group(P>0.05).ConclusionThe expressions of αvβ8,p38 and ERK1/2 are gradually increased in liver of BA with the process of fibrosis,which indicate that they may be involved inthe process of BA liver fibrosis.

Key words:biliary atresia;liver cirrhosis;p38 mitogen-activated protein kinases;mitogen-activated protein kinase 1; liver fibrosis;αvβ8;p38;ERK1/2膽道閉鎖（biliary atresia，BA）是嬰幼兒期最嚴(yán)重的肝膽系統(tǒng)疾病之一，主要以肝內(nèi)外膽管進(jìn)行性炎癥、纖維性梗阻及膽汁淤積為特點(diǎn)，導(dǎo)致進(jìn)行性肝纖維化和肝硬化，如不及時(shí)治療，常在1歲左右死亡［1］。目前BA的主要治療方法為早期行肝門(mén)-空腸吻合術(shù)（Kasai手術(shù)），但肝纖維化進(jìn)程并不隨著 Kasai手術(shù)而停止。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1 （transforming growth factor-β1，TGF-β1）通路與肝纖維化進(jìn)程密切相關(guān)，而整合素αvβ8、p38及細(xì)胞外調(diào)節(jié) 蛋白 激 酶 1/2（extracellular regulated protein kinases1/2，ERK1/2）對(duì) TGF-β1通路的激活及Smad2/3蛋白磷酸化等起重要作用［2-4］。但以上3種蛋白在BA肝組織中的表達(dá)情況尚不明確，本文旨在檢測(cè)αvβ8、p38及ERK1/2在BA肝組織中的表達(dá)情況，并探討其在BA肝纖維化中的作用機(jī)制。