蝦青素對人肺癌A549細胞裸鼠移植瘤放療敏感性的影響

吳春濤，苑威，劉鐵楠，張晉冀，李長仔，胡寶山

蝦青素對人肺癌A549細胞裸鼠移植瘤放療敏感性的影響

吳春濤1，苑威2，劉鐵楠3，張晉冀1，李長仔1，胡寶山1

摘要：目的探討蝦青素對人肺癌A549細胞裸鼠移植瘤放射治療敏感性的影響。方法20只BALB/c Nude裸鼠隨機均分為4組：對照組（小鼠灌胃10%DMSO的超純水），蝦青素組（小鼠灌胃10%DMSO的蝦青素懸液，劑量為50 mg/kg，每隔1 d給藥1次，共給藥7次），照射組（小鼠灌胃10%DMSO的超純水，腫瘤生長部位使用加速器局部照射，5 Gy/次，總劑量15 Gy）及聯(lián)合組（同時進行蝦青素灌胃和局部照射處理）。腫瘤最短直徑達到5 mm以上開始實驗，每隔1 d測量移植瘤長短直徑計算腫瘤體積并繪制移植瘤生長曲線，末次給藥后第2天處死小鼠，取腫瘤塊稱質量并將其制成石蠟切片。免疫組化方法檢測石蠟切片內腫瘤細胞增殖抗原Ki-67、磷酸化STAT3（p-STAT3）表達及細胞凋亡（Tunnel染色）情況。結果與對照組比較，蝦青素組、照射組及聯(lián)合組瘤體生長速度減慢（P<0.05），以聯(lián)合組瘤體生長速度最慢。對照組、蝦青素組、照射組和聯(lián)合組瘤體質量、Ki-67、p-STAT3表達水平均依次降低，抑瘤率、細胞凋亡率均依次升高，組間多重比較差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結論蝦青素能夠通過抑制p-STAT3表達增加肺癌A549細胞裸鼠移植瘤的放療敏感性。

關鍵詞：肺腫瘤；癌；輻射耐受性；放射療法；小鼠,裸；蝦青素；肺癌A549細胞

基金項目：中國煤炭工業(yè)協(xié)會指導性課題（MTKJ2014-286）

作者單位：1華北理工大學附屬醫(yī)院腫瘤外科（郵編063000），2藥學部，3心內科

作者簡介：吳春濤（1976），男，副主任醫(yī)師，醫(yī)學學士，主要從事腫瘤治療學方面的研究

肺癌是一類高發(fā)病率腫瘤，男性肺癌發(fā)病率和死亡率均占所有惡性腫瘤的第1位［1］。在肺癌的治療過程中，放射治療是一種重要的治療方法，不同分型的肺癌對放射治療的敏感性存在差異。蝦青素是一種天然的類胡蘿卜素，廣泛的存在于自然界中，有研究顯示其具有抗氧化、抗腫瘤、預防癌癥、增強免疫力、改善視力等作用［2-3］。研究表明，蝦青素能夠通過阻斷酪氨酸激酶1（Janus activedkinase，JAK1）/信號轉導和轉錄活化因子3（Signal transducers and activators of transcription，STAT3）通路來抑制非小細胞肺癌A549細胞增殖并促進其凋亡。此外，蝦青素能夠通過作用于JAK/STAT3信號通路來抑制口腔癌及克隆性結腸癌細胞增殖并促進其凋亡［4-5］，提示蝦青素能夠通過影響STAT3表達發(fā)揮體外抗腫瘤作用。STAT3是一種轉錄活化因子，通過與細胞中多種功能調節(jié)蛋白相互結合在癌癥的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的調控作用。研究顯示應用STAT3抑制劑能夠增加包括非小細胞肺癌A549細胞在內的多種肺癌細胞的放療敏感性［6-7］，而具有抑制STAT3表達且不良反應低的蝦青素是否能夠增加A549細胞放療敏感性尚少見報道。本研究通過建立裸鼠移植瘤模型，從動物水平觀察蝦青素對裸鼠肺癌A549細胞移植瘤放射治療的協(xié)同作用，為肺癌的臨床治療提供理論支持及實驗指導。

1　材料與方法

1.1材料與儀器肺癌A549細胞系購自中科院上海生命科學研究所；蝦青素購自日本Santa Cruz公司，每10 mg粉末溶解于100 μL DMSO后加入超純水配置濃度為10 g/L的蝦青素懸液備用；RPMI 1640培養(yǎng)基購自賽默飛世爾生物化學制品有限公司；胎牛血清購自美國GIBCO公司；Ki-67抗體購自美國Abcam公司，Tunnel檢測試劑盒購自瑞士羅氏公司；磷酸化STAT3（p-STAT3）抗體購自美國CST公司；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗購自北京中杉金橋生物技術有限公司；細胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司。

1.2實驗動物SPF級BALB/c Nude裸鼠30只，6～8周齡，體質量18～20 g，購自北京維通利華實驗動物有限公司，飼養(yǎng)于華北理工大學實驗動物中心。

1.3細胞培養(yǎng)肺癌A549細胞培養(yǎng)條件為RPMI 1640培養(yǎng)基內加入10%胎牛血清和青霉素100 U/mL、鏈霉素100 mg/L，細胞培養(yǎng)于37℃含5%CO2的培養(yǎng)箱內，選取對數(shù)生長期的細胞進行裸鼠接種實驗。

1.4裸鼠移植瘤模型建立選取對數(shù)生長期的肺癌A549細胞，用0.25%胰酶消化后，使用含10%胎牛血清的培養(yǎng)基終止消化，收集細胞懸液到15 mL離心管內，以離心半徑25 cm，1 500 r/min，離心5 min。棄上清后加入200 μL磷酸鹽緩沖液（PBS）制成單細胞懸液，臺盼藍計數(shù)活細胞數(shù)占95%以上。調整細胞懸液濃度為5×107/mL，于裸鼠左前腋下及右前腋下接種，每只小鼠接種100 μL細胞懸液，共接種5只小鼠，接種1周左右開始形成腫瘤，3只小鼠腫瘤接種成功。接種后1個月將形成腫瘤的小鼠處死，取出腫瘤組織，去除包膜用剪刀剪成約100 mm3大小的瘤塊，用穿刺針將瘤塊接種至新的25只裸鼠左前腋下，待腫瘤最短直徑＞5 mm后開始進行實驗，本次造模22只裸鼠腫瘤接種成功，取20只腫瘤組織大小均勻的小鼠進行實驗。

1.5實驗分組20只BALB/c裸鼠采用隨機數(shù)字表法均分為4組（n=5）。對照組，灌胃10%DMSO的超純水；蝦青素組，灌胃蝦青素懸液，給藥劑量為50 mg/kg，每隔1 d給藥1次，共7次；照射組，每只小鼠灌胃含10%DMSO的超純水，同時用直線加速器進行局部照射腫瘤，每次照射劑量為5 Gy，每隔3 d照射1次，照射總劑量為15 Gy；聯(lián)合組，同時給予蝦青素組和照射組的處理方法。

1.6移植瘤生長情況每隔1天測量移植瘤裸鼠體質量，游標卡尺測量腫瘤最長直徑（a）及最短直徑（b），按照公式V= a×b2/2計算移植瘤體積并繪制生長曲線。給藥結束后第2天脫臼處死小鼠，分離瘤塊，稱質量后計算抑瘤率=（對照組瘤質量-處理組瘤質量）/對照組瘤質量。

1.7免疫組化實驗檢測Ki-67、p-STAT3表達水平及肺癌細胞凋亡率將獲取的腫瘤組織迅速放入4%中性甲醛內，固定24 h以上做脫水、浸蠟處理后進行瘤塊石蠟包埋，5 μm厚連續(xù)切片。增殖細胞表面抗原Ki-67及p-STAT3抗體染色步驟如下：常規(guī)脫蠟水化處理后進行抗原修復、內源性辣根過氧化物酶滅活，抗原封閉后，分別加入Ki-67抗體（1∶800）和p-STAT3抗體（1∶500），4℃隔夜孵育，洗去多余未結合的抗體，加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗，室溫孵育30 min，DAB顯色后進行常規(guī)水化透明步驟，加入封片劑封片后顯微鏡下觀察結果。細胞凋亡采用Tunnel染色參照試劑盒標準步驟進行，染色結束后進行水化透明封片處理后觀察結果。任意讀取5個視野，計數(shù)鏡下100個細胞內陽性細胞數(shù)目，計算陽性細胞百分率即細胞凋亡率。

1.8統(tǒng)計學方法采用SPSS 19.0對數(shù)據(jù)進行處理，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間均數(shù)比較采用方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1蝦青素對裸鼠移植瘤放療后瘤體生長速度的影響未做任何處理的對照組瘤體生長速度很快，與對照組比較，蝦青素組、照射組及聯(lián)合組瘤體生長速度減慢，以聯(lián)合組瘤體生長速度最慢，經(jīng)放療和蝦青素同時處理后的聯(lián)合組瘤體幾乎未增長，見圖1。

2.2蝦青素對裸鼠移植瘤放療后瘤體質量的影響對照組、蝦青素組、照射組和聯(lián)合組瘤體質量依次降低，抑瘤率依次升高，組間多重比較差異均有統(tǒng)計學意義，見表1。

Fig.1　Astaxanthin slowed down the growth rates of transplanted tumor in nude mice after radiotherapy圖1　蝦青素降低裸鼠移植瘤的放療后瘤體生長速度

Tab.1　Astaxanthin decreased weight of transplanted tumor in nude mice after radiotherapy表1　蝦青素降低裸鼠移植瘤的放療后瘤體質量（n=5，±s）

Tab.1　Astaxanthin decreased weight of transplanted tumor in nude mice after radiotherapy表1　蝦青素降低裸鼠移植瘤的放療后瘤體質量（n=5，±s）

＊P＜0.05；a與對照組比較，b與蝦青素組比較，c與照射組比較，P＜0.05

組別對照組蝦青素組照射組聯(lián)合組F瘤體質量（g）1.53±0.07 1.29±0.10a0.82±0.09ab0.29±0.03abc48.435＊抑瘤率（%）-15.7±7.0 46.1±6.6b81.0±1.9bc126.400＊

2.3蝦青素對裸鼠移植瘤放療后癌細胞凋亡及p-STAT3表達的影響對照組、蝦青素組、照射組和聯(lián)合組Ki-67、p-STAT3表達水平均依次降低，細胞凋亡率依次升高，組間多重比較差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表2、圖2。

Tab.2　Effects of astaxanthin on expressions of Ki-67 and p-STAT3，and apoptotic rates of transplanted tumor in nude mice after radiotherapy表2　蝦青素對裸鼠移植瘤放療后Ki-67、p-STAT3表達及細胞凋亡率的影響　?。╪=5，%±s）

Tab.2　Effects of astaxanthin on expressions of Ki-67 and p-STAT3，and apoptotic rates of transplanted tumor in nude mice after radiotherapy表2　蝦青素對裸鼠移植瘤放療后Ki-67、p-STAT3表達及細胞凋亡率的影響　?。╪=5，%±s）

＊P＜0.05；a與對照組比較，b與蝦青素組比較，c與照射組比較，P＜0.05

組別對照組蝦青素組照射組聯(lián)合組F Ki-67 74.2±5.2 65.0±3.8a49.0±5.0ab35.2±4.1abc70.600＊p-STAT3 40.4±7.2 33.0±3.8a25.4±5.4ab5.0±2.2abc46.008＊細胞凋亡率0 13.2±4.4a51.4±7.9ab80.4±6.2abc221.166＊

Fig.2　Staining image of Ki-67，p-STAT3 in transplanted tumor after radiotherapy圖2　各組Ki-67、p-STAT3表達及Tunnel染色結果（Ki-67，×100；Tunnel，×400；p-STAT3，×100）

3　討論

放射治療是利用放射線包括X射線、電子線、中子束、質子束及其他粒子束等治療惡性腫瘤的一種重要方法，但是許多惡性腫瘤在放療后出現(xiàn)了不同程度的輻射耐受。非小細胞肺癌和小細胞肺癌的5年生存率分別為16%和6%，臨床治療肺癌預后差的主要原因是肺癌容易出現(xiàn)放療和化療的耐受性［7］，因此，如何提高肺癌的放療敏感性至關重要。有研究報道，腫瘤細胞對輻射的耐受性及敏感性與STAT3的激活有關，抑制STAT3信號通路能夠降低胰腺癌［8］、乳腺癌［9］、肺癌［6-7］、神經(jīng)膠質瘤［10］等多種腫瘤細胞的輻射耐受性，STAT3在介導腫瘤細胞輻射耐受過程中發(fā)揮重要作用。研究顯示氯硝柳胺和CK2抑制劑能夠通過抑制STAT3增加肺癌細胞的放療及化療敏感性，但是以上研究只限于體外肺癌細胞的研究，而無裸鼠移植瘤模型的體內實驗［6-7］。蝦青素能夠通過抑制STAT3信號通路發(fā)揮體外抗腫瘤作用，而其是否具有增加肺癌放療敏感性的作用尚不清楚。

本研究結果顯示，對照組裸鼠移植瘤生長迅速，蝦青素組移植瘤體積及質量均低于對照組，但是抑瘤率低于30%，未達到《現(xiàn)代腫瘤治療藥物學》中抗腫瘤藥物有效標準［11］，提示單純應用蝦青素進行體內抗腫瘤作用并不理想，這與既往報道的蝦青素能夠體內抑制肝癌細胞生長的結果并不一致［5］，提示蝦青素的抗腫瘤作用可能存在組織器官的差異性。本研究中聯(lián)合組瘤體幾乎未增長，在實驗結束之時無論是腫瘤體積還是腫瘤質量都遠低于其他3組，說明在放療同時給予裸鼠蝦青素干預能夠有效抑制肺癌生長。

Ki-67是一種增殖細胞相關的核抗原，可以通過對Ki-67檢測判斷腫瘤細胞的增殖活性，腫瘤細胞增殖旺盛則Ki-67表達水平高。本研究結果顯示，與對照組比較，蝦青素組、照射組及聯(lián)合組Ki-67表達水平不同程度下調，以聯(lián)合組Ki-67表達水平最低，提示放療同時給予蝦青素干預能夠有效降低腫瘤細胞增殖。脫氧核苷酸末端轉移酶（Terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT）介導的dUTP缺口末端標記（TdT-mediated dUTP nick-end labeling，Tunnel）技術是目前原位檢測細胞凋亡最敏感、快速、特異的方法。本研究采用Tunnel技術檢測細胞凋亡率，結果顯示，對照組腫瘤細胞幾乎沒有凋亡發(fā)生，蝦青素組、照射組及聯(lián)合組細胞凋亡率均高于對照組，以聯(lián)合組細胞凋亡率最高，說明放療同時給予蝦青素能夠增加腫瘤細胞凋亡。

為驗證蝦青素是否通過抑制STAT3信號通路來增加肺癌放療敏感性，本研究對腫瘤組織活化狀態(tài)的STAT3——p-STAT3的表達進行檢測，結果顯示，p-STAT3在對照組中表達水平較高，蝦青素組、照射組及聯(lián)合組p-STAT3表達均較對照組降低，以聯(lián)合組p-STAT3表達水平最低，提示蝦青素可能通過下調p-STAT3表達起到增加放療敏感性的作用，與之前多項研究結果一致［6-7］。

綜上所述，蝦青素能夠通過調控p-STAT3表達水平來增加肺癌A549細胞裸鼠移植瘤放療敏感性，下一步需要深入研究蝦青素對p-STAT3上游及下游信號分子的調控作用。

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（2015-11-25收稿2016-03-22修回）

（本文編輯陳麗潔）

中圖分類號：R730.52，R730.55

文獻標志碼：A

DOI：10.11958/20150340

Astaxanthin enhanced radiotherapy sensitivity of human lung cancer A549 cells transplanted in nude mice

WU Chuntao1,YUAN Wei2,LIU Tienan3,ZHANG Jinji1,LI Changzai1,HU Baoshan1
1 Department of Oncological Surgery,2 Department of Pharmaceutical,3 Department of Cardiology,North China University of Science and Technology Affiliated Hospital,Tangshan 063000,China

Abstract:ObjectiveTo observe the effect of astaxanthin on radiotherapy sensitivity of lung cancer A549 cells transplanted in nude mice.MethodsTwenty BALB/c nude mice were divided into four groups:control group(mice were gavaged with pure water containing with 10%DMSO),astaxanthin group(mice were gavaged with astaxanthin suspension containing with 10%DMSO,astaxanthin was given to mice with the dose of 50 mg/kg on the first day,and every other day in the following days with a total of 7 times),radiotherapy group(mice were gavaged with pure water containing with 10% DMSO,the tumor site was given local radiotherapy with a dose of 5 Gy per time and the total dose was 15 Gy)and combination group(mice were given 50 mg/kg astaxanthin and radiotherapy with 15 Gy total irradiated dose).When the minor axis of the tumor reached 5 mm we began experiment.Tumor growth curve was measured by detecting the line of apsides every other day.Mice were killed on the second day after the last time of astaxanthin administration.Weights of tumor were measured by a balance and then tumor mass was processed into paraffin sections.Expressions of proliferating tumor cell antigen Ki-67,phosphorylated-signal transducers and activators of transcription(p-STAT3),and cell apoptosis (measured by terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick-end labeling,Tunnel)were detected by immunohistochemistry.ResultsCompared with control group,the transplanted tumor growth rate slowed down in other three groups(P<0.05),and tumor growth was the most slowly in the combination group.Tumor weight,Ki-67 and p-STAT3 expressions were decreased gradually in turn in control group,astaxanthin group,radiotherapy group and combination group. The anti-tumor rate and percentage of cell apoptosis were increased gradually in turn.There was significant difference between groups by multiple comparison statistics(P<0.05).ConclusionAstaxanthin enhances radiotherapy sensitivity of human lung cancer A549 cells in nude mice by down-regulating the expression of p-STAT3.

Key words:lung neoplasms;carcinoma;radiation tolerance;radiotherapy;mice,nude;Astaxanthin;lung cancer A549 cell