抑郁癥大鼠海馬-杏仁核pMAP-2表達(dá)改變及人參皂苷Rb1的干預(yù)作用

劉繼剛，袁楊，臧蔚，劉昊△

實(shí)驗(yàn)研究

抑郁癥大鼠海馬-杏仁核pMAP-2表達(dá)改變及人參皂苷Rb1的干預(yù)作用

劉繼剛1，袁楊2，臧蔚2，劉昊2△

摘要：目的觀察人參皂苷Rb1對(duì)抑郁大鼠海馬-杏仁核組織磷酸化微管相關(guān)蛋白-2（pMAP-2）的影響。方法將30只健康SPF級(jí)成年雄性Wistar大鼠隨機(jī)均分為對(duì)照組、模型組和治療組。采用慢性不可預(yù)見性溫和應(yīng)激（CUMS）結(jié)合孤養(yǎng)建立抑郁癥大鼠模型（模型組），治療組在造模的同時(shí)灌胃給予人參皂苷Rb1（藥液含原生藥1 g/mL，劑量1 mL/100 g體質(zhì)量，1次/d）；對(duì)照組除每天抓取1次外，不作其他處理，持續(xù)22 d。采用Western blot法檢測(cè)海馬、杏仁核組織微管相關(guān)蛋白-2（MAP-2）及pMAP-2蛋白表達(dá)，Real-time PCR檢測(cè)pMAP-2 mRNA表達(dá)。結(jié)果模型組大鼠海馬和杏仁核組織pMAP-2蛋白和mRNA表達(dá)水平以及pMAP-2/MAP-2比值均明顯低于對(duì)照組（均P<0.05），治療組pMAP-2蛋白和mRNA表達(dá)水平以及pMAP-2/MAP-2比值較模型組明顯升高，但仍低于對(duì)照組（均P<0.05）。結(jié)論人參皂苷Rb1可能通過抑制MAP-2磷酸化水平來發(fā)揮抗抑郁作用。

關(guān)鍵詞：人參皂苷；抑郁癥；海馬；杏仁核；微管相關(guān)蛋白；磷酸化微管相關(guān)蛋白-2

隨著生活壓力增大和應(yīng)激事件的不斷增多，抑郁癥（depression）等精神性疾病的發(fā)病率呈現(xiàn)增高趨勢(shì)［1］。反復(fù)的應(yīng)激是導(dǎo)致抑郁癥發(fā)生的根本原因，但抑郁癥的具體發(fā)病機(jī)制尚未明確。研究發(fā)現(xiàn)，抑郁癥患者海馬、杏仁核等部位存在體積縮小的現(xiàn)象［2-3］，這可能與這些部位細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白磷酸化有關(guān)［4］。人參是我國傳統(tǒng)名貴藥材，具有補(bǔ)氣、安神、生津、益智等作用。研究表明，人參皂苷（Ginsenoside）活性成分Rb1具有明顯的抗抑郁作用［5-6］，但其具體作用機(jī)制尚未明確。本研究通過建立應(yīng)激性抑郁癥大鼠模型，觀察人參皂苷Rb1對(duì)大鼠海馬、杏仁核磷酸化微管相關(guān)蛋白-2（pMAP-2）的影響，以探討人參皂苷Rb1抗抑郁癥的可能機(jī)制。

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81201048）

作者單位：1遵化市人民醫(yī)院口腔科（郵編064200）；2華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

作者簡介：劉繼剛（1962），男，主治醫(yī)師，主要從事應(yīng)激性疾病發(fā)生機(jī)制研究

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通訊作者E-mail:liuhao938@163.com

1　材料與方法

1.1動(dòng)物與試劑健康SPF級(jí)成年雄性Wistar大鼠30只，體質(zhì)量180～210 g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK京2009-0004，由華北理工大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后用于實(shí)驗(yàn)。兔微管相關(guān)蛋白-2（MAP-2）多克隆抗體和兔pMAP-2多克隆抗體購自Santz Cruz公司，Western blot相關(guān)試劑購自武漢博士德生物工程有限公司，Real-time PCR試劑盒購自TaKaRa公司。人參皂苷Rb1購自中國藥品生物制品檢定所。其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2實(shí)驗(yàn)分組和抑郁癥模型的建立適應(yīng)性飼養(yǎng)結(jié)束后，采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為對(duì)照組、模型組和治療組，每組10只。采用慢性不可預(yù)見性溫和應(yīng)激（CUMS）結(jié)合孤養(yǎng)的方法建立抑郁癥模型大鼠，應(yīng)激包括夾尾1 min、黑白顛倒、天敵聲音3 min、冰水強(qiáng)迫游泳15 min、熱水強(qiáng)迫游泳15 min、潮濕墊料、鼠籠傾斜等11種。每天給予1種應(yīng)激，造模共持續(xù)22 d，具體方法參見文獻(xiàn)［3］。治療組大鼠在造模同時(shí)通過灌胃給予人參皂苷Rb1，每日1次（藥液含原生藥1 g/ mL，劑量：1 mL/100 g體質(zhì)量）。對(duì)照組除每天抓取1次外，不作其他處理。

1.3Western blot檢測(cè)海馬、杏仁核MAP-2和pMAP-2蛋白表達(dá)每組各取5只大鼠，麻醉后斷頭取腦，冰上快速分離海馬和杏仁核，加適量RIPA裂解液完全裂解后，4℃12 000 r/min離心10 min，收集上清液?？捡R斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白濃度，按照40 μg蛋白量上樣，進(jìn)行10%SDS-PAGE電泳，2 h 后PVDF膜電轉(zhuǎn)?。?80 mA，1.5 h），5%牛血清白蛋白室溫封閉1 h，PBST漂洗后，加MAP-2一抗（1∶500），4℃孵育過夜，加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗IgG（1∶2 000）37℃孵育1 h，ECL顯色。同上述方法進(jìn)行pMAP-2和內(nèi)參照β-actin的Westen blot分析。以目的條帶與內(nèi)參照的光密度比值表示蛋白表達(dá)。

1.4Real-time PCR檢測(cè)pMAP-2 mRNA表達(dá)每組各取5只大鼠，麻醉后斷頭取腦，在冰上快速分離海馬和杏仁核組織，提取總RNA。定量后取1 μg RNA，按照試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和 PCR擴(kuò)增。引物序列：正義 5′-TGGCTTTCTCATCTCCATCC-3′，反義5′-CTCACTGCCCCAT TAGTGC-3′，產(chǎn)物大小357 bp。PCR擴(kuò)增條件：94℃4 min；94℃30 s，55℃30 s，72℃25 s，35個(gè)循環(huán)；72℃10 min。按照公式△Ct=Ct（目的基因）-Ct（管家基因）、△△Ct=△Ct（實(shí)驗(yàn)組）-△Ct（對(duì)照組）計(jì)算2-△△C t（pMAP-2 mRNA水平）。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2　結(jié)果

2.1海馬、杏仁核組織中MAP-2和pMAP-2蛋白表達(dá)水平模型組海馬和杏仁核組織pMAP-2蛋白和pMAP-2/MAP-2比值均明顯低于對(duì)照組，治療組較模型組升高，但仍低于對(duì)照組（均P＜0.05），見圖1、表1。

Fig.1　Expressions of pMAP-2 and MAP-2 protein detected by Western blot assay圖1　Western blot檢測(cè)海馬和杏仁核MAP-2、pMAP-2蛋白表達(dá)

2.2大鼠海馬、杏仁核組織中pMAP-2 mRNA的表達(dá)模型組大鼠海馬和杏仁核pMAP-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯低于對(duì)照組，治療組較模型組升高，但仍低于對(duì)照組（均P＜0.05），見表2。

Tab.1　Comparison of MAP-2 and pMAP-2 protein expressions in three groups表13組大鼠海馬、杏仁核組織MAP-2和pMAP-2蛋白表達(dá)水平比較?。╪=5，±s）

Tab.1　Comparison of MAP-2 and pMAP-2 protein expressions in three groups表13組大鼠海馬、杏仁核組織MAP-2和pMAP-2蛋白表達(dá)水平比較　（n=5，±s）

＊P＜0.05；a與對(duì)照組比較，b與模型組比較，P<0.05

組別對(duì)照組模型組治療組F pMAP-2海馬0.94±0.11 0.18±0.02a0.43±0.05ab7.68＊杏仁核1.17±0.09 0.62±0.07a1.01±0.06ab11.35＊MAP-2海馬1.05±0.12 1.18±0.20a0.71±0.08ab8.77＊杏仁核1.12±0.15 1.02±0.12a1.03±0.08a6.49＊pMAP-2/MAP-2海馬0.90±0.11 0.15±0.03a0.61±0.04ab14.92＊杏仁核1.04±0.10 0.61±0.04a0.98±0.09ab8.53＊

3　討論

抑郁癥發(fā)病機(jī)制及治療研究成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)內(nèi)容［7］。由于受到倫理學(xué)限制，對(duì)抑郁癥的基礎(chǔ)研究往往通過建立抑郁癥動(dòng)物模型進(jìn)行，CUMS能模仿人類生活中遭遇的各種應(yīng)激。研究表明，CUMS應(yīng)激大鼠能較好地表現(xiàn)出抑郁癥的核心臨床癥狀，是被普遍接受的抑郁癥大鼠模型［8］。有學(xué)者對(duì)抑郁癥患者海馬等部位體積減少原因進(jìn)行研究，結(jié)果表明這可能與這些部位神經(jīng)凋亡增強(qiáng)以及神經(jīng)細(xì)胞骨架蛋白改變有關(guān)［4，9-10］。微管相關(guān)蛋白（microtubuleassociated proteins，MAPs）特別是MAP-2能調(diào)節(jié)微管的聚合狀態(tài)，在維持神經(jīng)元形態(tài)和突觸可塑性方面起主要作用［11］。本課題組既往研究表明，抑郁癥大鼠pMAP-2出現(xiàn)先降低后增高的現(xiàn)象［9］。本研究結(jié)果表明，抑郁癥大鼠海馬和杏仁核組織中的pMAP-2表達(dá)均較對(duì)照組顯著降低，可以推測(cè)在抑郁癥發(fā)病過程中，MAP-2的磷酸化是引起抑郁癥患者海馬、杏仁核體積縮小的一個(gè)重要因素。

祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)對(duì)抑郁癥有獨(dú)到認(rèn)識(shí)。中醫(yī)認(rèn)為，抑郁癥是情志不舒，肝氣郁結(jié)，漸致五臟不和、化火、生痰、瘀阻、耗氣、傷陰等而致，多采用疏肝理氣法對(duì)其進(jìn)行治療［12］。人參是一味名貴中藥，具有補(bǔ)氣、安神、生津、益智等作用。有研究表明，人參的活性成分人參皂苷Rb1具有明顯的抗抑郁作用［5-6］；孫秀萍等［13］研究亦表明，人參總皂苷能明顯減輕抑郁小鼠行為學(xué)癥狀，但其抗抑郁的具體作用機(jī)制仍不清楚。本研究結(jié)果表明，對(duì)抑郁癥模型大鼠給予人參皂苷Rb1干預(yù)后，大鼠海馬和杏仁核組織pMAP-2蛋白和mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯升高，提示人參皂苷Rb1可能通過抑制MAP-2磷酸化發(fā)揮抗抑郁作用，其具體機(jī)制有待于進(jìn)一步深入研究。

Tab.2　Result of pMAP-2 mRNA expressions in three groups表23組大鼠海馬、杏仁核組織pMAP-2 mRNA表達(dá)水平比較?。╪=5，±s）

Tab.2　Result of pMAP-2 mRNA expressions in three groups表23組大鼠海馬、杏仁核組織pMAP-2 mRNA表達(dá)水平比較?。╪=5，±s）

＊P＜0.05；a與對(duì)照組比較，b與模型組比較，P<0.05

組別對(duì)照組模型組治療組F海馬1.00±0.00 0.38±0.04a0.75±0.11ab9.57＊＊杏仁核1.00±0.00 0.27±0.05a0.50±0.04ab7.29＊

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（2015-11-04收稿2016-03-18修回）

（本文編輯陳麗潔）

中圖分類號(hào)：R285.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

DOI：10.11958/20150266

The change of phosphorylated MAP-2 in hippocampus/amygdala and the influence of ginsenoside Rb1 on it in depressive rat model

LIU Jigang1,YUAN Yang2,ZANG Yu2,LIU Hao2△
1 Department of Stomatology,Zunhua Peolple’s Hospital,Zunhua 064200;
2 Department of Neurology,Affiliated Hospital of North China University of Science and Technology
△Corresponding AuthorE-mail:liuhao938@163.com

Abstract:ObjectiveTo observe effects of ginsenoside Rb1 on phosphorylation of microtubule-associated protein 2 (pMAP-2)in hippocampus and amygdala of depressive model rats.MethodsThirty male Wistar rats were randomly divided into control group,model group and treatment group.The depression rat model was produced by giving chronic unpredicted mild stress(CUMS).Treatment group was given daily intragastric administration of ginsenoside RB1(1 g/mL crude drug,1 mL/100 g body weight)for 22 days during modeling.Western blot assay was used to detect expressions of MAP-2 and pMAP-2 protein,and real-time PCR was used to detect expressions of pMAP-2 mRNA respectively.Results The expressions of pMAP-2 protein and mRNA in hippocampus and amygdala were significantly lower in model group than those of control group(P<0.05).The expressions of pMAP-2 protein and mRNA were significantly higher in treatment group than those of model group(P<0.05).ConclusionGinsenoside Rb1 can play anti-depression role by inhibiting the phosphorylation of MAP-2 in rats.

Key words:Ginsenoside;depressive disorder;hippocampus;amygdala;microtubule-associated proteins;pMAP-2