基于RNA-seq技術(shù)開發(fā)中間偃麥草基因組特異分子標(biāo)記

崔 雨,鮑印廣,王洪剛,2,李興鋒,2

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)作物生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東泰安 271018; 2.國家小麥改良中心泰安分中心,山東泰安 271018)

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基于RNA-seq技術(shù)開發(fā)中間偃麥草基因組特異分子標(biāo)記

崔 雨1,鮑印廣1,王洪剛1,2,李興鋒1,2

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)作物生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東泰安 271018; 2.國家小麥改良中心泰安分中心,山東泰安 271018)

摘要：中間偃麥草(Thinopyrum intermedium,2n=6x=42,JJJSJSStSt或EeEeEbEbStSt)是小麥遺傳改良的重要近緣植物，高抗銹病、白粉病等病害，耐逆性強(qiáng)。開發(fā)中間偃麥草基因組特異分子標(biāo)記對(duì)于加快其優(yōu)異基因向普通小麥中的轉(zhuǎn)移和利用具有重要意義。為建立快速準(zhǔn)確開發(fā)中間偃麥草基因組特異分子標(biāo)記的新體系，首先利用RNA-seq技術(shù)對(duì)中間偃麥草及其基因組供體二倍體長穗偃麥草、百薩偃麥草、假鵝觀草的苗期葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，然后根據(jù)測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)EST-SSR引物，對(duì)普通小麥、中間偃麥草及其基因組供體材料進(jìn)行DNA擴(kuò)增分析，從中篩選鑒定中間偃麥草基因組特異標(biāo)記。結(jié)果表明，在所合成的200對(duì)EST-SSR引物中，有75對(duì)引物(37.5%)在中間偃麥草、二倍體長穗偃麥草、百薩偃麥草和假鵝觀草中具有特異擴(kuò)增，引物多態(tài)率較高。說明利用RNA-seq技術(shù)開發(fā)EST-SSR引物可以高效地用于篩選中間偃麥草基因組特異分子標(biāo)記，這一技術(shù)體系也可應(yīng)用于其他作物及其近緣物種的特異分子標(biāo)記開發(fā)。

關(guān)鍵詞：中間偃麥草；小麥；RNA-seq；特異分子標(biāo)記

中間偃麥草為多年生野生草本植物，是小麥重要的近緣植物之一，其先后被劃入小麥屬(Triticum)、冰草屬(Agropyron)、偃麥草屬(Elytrigia)和類麥屬(Thinopyrum)。盡管后來顏 濟(jì)和楊俊良[1]將其歸入毛麥屬(Trichopyrum)，但是因?yàn)榱?xí)慣的原因，中間偃麥草的名稱一直被延用下來。吉萬全等[2]認(rèn)為，中間偃麥草染色體組有兩個(gè)親緣關(guān)系較近的染色體組，可能分別來源于二倍體長穗偃麥草(EeEe)和百薩偃麥草(EbEb)，另外一個(gè)染色體組與其他兩個(gè)染色體組親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，其原始親本供體可能是假鵝觀草(StSt)。Chen等[3]認(rèn)為中間偃麥草的染色體組為JJJSJSStSt，原始供體同樣可能為二倍體長穗偃麥草、百薩偃麥草和假鵝觀草。目前，一般將中間偃麥草染色體組構(gòu)成表示為EeEeEbEbStSt或者JJJSJSStSt[4]。

中間偃麥草對(duì)小麥的“三銹”、白粉病等病害免疫，對(duì)小麥黑穗病、葉枯病、根腐病和條紋花葉病等病害高抗，同時(shí)又是大麥黃矮病的良好抗源，且易與小麥雜交，因此它已成為小麥遺傳改良中具有重要利用價(jià)值的種質(zhì)資源。國內(nèi)外不同研究者利用普通小麥與中間偃麥草雜交，目前已創(chuàng)制出一批八倍體、異附加系、異代換系及易位系等小偃麥異染色體系，為小麥遺傳改良提供了豐富的種質(zhì)材料，并成功將中間偃麥草的多種優(yōu)異基因轉(zhuǎn)移到普通小麥遺傳背景當(dāng)中[5-7]。

小麥遠(yuǎn)緣雜交后代材料遺傳組成的精確鑒定是對(duì)其優(yōu)異基因進(jìn)行開發(fā)利用的前提，分子標(biāo)記的發(fā)展為小麥異源種質(zhì)系的鑒定提供了新的輔助選擇技術(shù)，大大提高了小麥異染色體系特別是小片段易位系的選擇效率，為更好地轉(zhuǎn)移和利用小麥近緣物種有利基因提供了便利[8]。目前一些新技術(shù)的應(yīng)用加快了小麥近緣植物分子標(biāo)記開發(fā)的進(jìn)程，如陳世強(qiáng)等[9]基于SLAF-seq技術(shù)開發(fā)出一批長穗偃麥草染色體特異分子標(biāo)記，代 程等[10]由冰草轉(zhuǎn)錄組EST序列開發(fā)了130個(gè)冰草6P特異標(biāo)記?；诟咄繙y(cè)序的RNA-Seq可以快速獲得大量表達(dá)基因序列，高效應(yīng)用于分子標(biāo)記開發(fā)、功能基因發(fā)掘、分子機(jī)理研究以及轉(zhuǎn)錄組比較等方面[11-15]。鑒于目前開發(fā)或篩選的中間偃麥草特異分子標(biāo)記多態(tài)率較低、數(shù)量有限且定位復(fù)雜，無法滿足中間偃麥草研究的需求，因此大批量開發(fā)中間偃麥草基因組(Ee、Eb、St)特異標(biāo)記對(duì)于豐富中間偃麥草標(biāo)記數(shù)目、明確標(biāo)記的基因組來源、鑒定小偃麥遺傳組成和分析偃麥草屬內(nèi)系統(tǒng)關(guān)系等有重要意義。本研究利用RNA-seq技術(shù)獲得中間偃麥草及其基因組供體二倍體長穗偃麥草、百薩偃麥草和假鵝觀草的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，擬開發(fā)一批特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性高的中間偃麥草基因組EST-SSR標(biāo)記，旨在為高效地開發(fā)中間偃麥草基因組特異分子標(biāo)記建立新的技術(shù)體系，為小偃麥新種質(zhì)的鑒定和中間偃麥草優(yōu)異基因的進(jìn)一步利用奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

供試材料包括中間偃麥草(Thinopyrumintermedium,2n=6x=42,EeEeEbEbStSt或JJJSJSStSt)、二倍體長穗偃麥草(Th.elongatum,2n=2x=14,EeEe)、假鵝觀草(Pseudoroegneriastrigosa,2n=2x=14,StSt)、百薩偃麥草(Th.bessarabicum,2n=2x=14,EbEb)及普通小麥(TriticumaestivumL.,6n=2x=42,AABBDD)中國春和煙農(nóng)15。其中，中間偃麥草引自原中國科學(xué)院西北植物研究所，由李振聲院士提供；假鵝觀草引自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，由李立會(huì)研究員提供；百薩偃麥草引自南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，由亓增軍教授提供；其余材料均由國家小麥改良中心泰安分中心保存。

1.2RNA-seq及引物設(shè)計(jì)

所用的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)均由中間偃麥草、二倍體長穗偃麥草、假鵝觀草和百薩偃麥草苗期葉片總RNA經(jīng)IlluminaHiSeqTM2000平臺(tái)測(cè)序獲得。用Trinity將測(cè)序序列進(jìn)行拼接，以此作為后續(xù)分析的參考序列，取每條基因中最長的轉(zhuǎn)錄本作為unigene。采用MISA(1.0版，默認(rèn)參數(shù))對(duì)unigene進(jìn)行序列分析，搜索SSR位點(diǎn)，所檢測(cè)SSR位點(diǎn)包括單核苷酸重復(fù)、二核苷酸重復(fù)、三核苷酸重復(fù)、四核苷酸重復(fù)、五核苷酸重復(fù)和六核苷酸重復(fù)6類，判斷標(biāo)準(zhǔn)為單核苷酸重復(fù)不少于10次，二核苷酸重復(fù)不少于6次，三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重復(fù)不少于5次。找出SSR位點(diǎn)之后，采用Primer 3(2.3.5版)進(jìn)行SSR引物批量設(shè)計(jì)，主要參數(shù)設(shè)置如下：產(chǎn)物大小100～280 bp，引物長度18～27 bp，GC含量40%～65%，退火溫度57～63 ℃，上下游引物Tm值相差小于5 ℃。

1.3引物篩選及PCR擴(kuò)增

根據(jù)中間偃麥草、二倍體長穗偃麥草、假鵝觀草和百薩偃麥草的EST-SSR數(shù)據(jù)，每個(gè)材料選取50對(duì)引物，共計(jì)200對(duì)，由上海生物工程公司合成。擴(kuò)增體系(10 μL)：模板DNA(33 ng·μL-1)3 μL、2×PowerTaqPCR MasterMix 5 μL、引物(5 μmol·L-1)2 μL。擴(kuò)增反應(yīng)在T100TM(BIO-RAD,USA)PCR儀上進(jìn)行。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)8%聚丙烯酰胺非變性凝膠電泳分離，銀染顯影，拍照分析。

2結(jié)果與分析

2.1轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及SSR檢測(cè)結(jié)果

高通量測(cè)序(IlluminaHiSeqTM2000)得到的原始數(shù)據(jù)及利用MISA對(duì)unigene進(jìn)行SSR檢測(cè)的結(jié)果見表1和圖1。

表1　RNA-seq的基本情況

A：中間偃麥草；B：二倍體長穗偃麥草；C：百薩偃麥草；D：假鵝觀草；Mono:單核苷酸重復(fù)；Di:二核苷酸重復(fù)；Tri:三核苷酸重復(fù)；Tetra:四核苷酸重復(fù)；Penta:五核苷酸重復(fù)；Hexa:六核苷酸重復(fù)

A:Th.intermedium; B:Th.elongatum; C:Th.bessarabicum; D:Ps.strigosa; Mono:Mononucleotide repeat; Di:Dinucleotide repeat; Tri:Trinucleotide repeat; Tetra:Tetranucleotide repeat; Penta:Pentanucleotide repeat; Hexa:Hexanucleotide repeat

圖1不同材料SSR基元的分布

Fig.1Distribution of SSR motifs in different materials

經(jīng)檢測(cè)，在中間偃麥草中搜索到6 033個(gè)SSR位點(diǎn)，分布在5 390條unigene中，561條unigene含有1個(gè)以上SSR，252條unigene含有復(fù)合SSRs，平均每6.55 kb有1個(gè)SSR；在二倍體長穗偃麥草中搜索到5 367個(gè)SSR位點(diǎn)，分布在4 831條unigene中，456條unigene含有1個(gè)以上SSR，194條unigene含有復(fù)合SSRs，平均每6.82 kb有1個(gè)SSR；在百薩偃麥草中搜索到7 232 個(gè)SSR位點(diǎn)，分布在6 299條unigene中，794條unigene含有1個(gè)以上SSR，317條unigene含有復(fù)合SSRs，平均每5.83 kb有1個(gè)SSR；在假鵝觀草中搜索到6 648個(gè)SSR位點(diǎn)，分布在5 830條unigene中，708條unigene含有1個(gè)以上SSR，301條unigene含有復(fù)合SSRs，平均每6.02 kb有1個(gè)SSR。

中間偃麥草、二倍體長穗偃麥草、百薩偃麥草和假鵝觀草等4個(gè)材料的SSR發(fā)生頻率(檢出SSR的unigene與總unigene數(shù)目之比)分別為8.6%、8.3%、11.6%和9.9%，SSR出現(xiàn)頻率(SSR數(shù)目與總unigene數(shù)目之比)分別為9.6%、9.3%、13.3%和11.3%，在本試驗(yàn)中百薩偃麥草及假鵝觀草的SSR檢測(cè)效率高于中間偃麥草和長穗偃麥草。從SSR基元類型上來看，三核苷酸重復(fù)比例最大，占50.0%左右；從SSR基元的重復(fù)次數(shù)上來看，重復(fù)5～8次的序列占比超過六成，其中二倍體長穗偃麥草達(dá)到74.0%。

2.2EST-SSR標(biāo)記分析結(jié)果

在中間偃麥草、二倍體長穗偃麥草、假鵝觀草、百薩偃麥草的EST-SSR數(shù)據(jù)中分別選取50對(duì)引物，共計(jì)合成200對(duì)引物，然后利用中國春、煙農(nóng)15、中間偃麥草、二倍體長穗偃麥草、百薩偃麥草及假鵝觀草對(duì)新開發(fā)的引物進(jìn)行了多態(tài)性驗(yàn)證。具體結(jié)果如下。

2.2.1中間偃麥草EST-SSR的擴(kuò)增結(jié)果

利用50對(duì)基于中間偃麥草RNA-seq開發(fā)的EST-SSR引物對(duì)不同材料進(jìn)行擴(kuò)增，共有45對(duì)引物可以在不同材料中擴(kuò)增出清晰的條帶，其中，thinta47等21對(duì)引物在中國春、煙農(nóng)15和中間偃麥草中擴(kuò)增出相同條帶；thinta19在二倍體長穗偃麥草中擴(kuò)增出特異條帶；thinta48等23對(duì)引物在中國春、煙農(nóng)15和中間偃麥草間有多態(tài)性擴(kuò)增，可以作為中間偃麥草的特異引物加以利用，在這些特異引物中，thinta8等7對(duì)引物在中間偃麥草和百薩偃麥草間擴(kuò)增出相同條帶，thinta5等6對(duì)引物在中間偃麥草、二倍體長穗偃麥草、百薩偃麥草、假鵝觀草間擴(kuò)增出不同條帶。部分引物擴(kuò)增結(jié)果見圖2。

2.2.2二倍體長穗偃麥草EST-SSR的擴(kuò)增結(jié)果

利用50對(duì)基于二倍體長穗偃麥草RNA-seq開發(fā)的EST-SSR引物對(duì)不同材料進(jìn)行擴(kuò)增，共有49對(duì)引物可以在不同材料中擴(kuò)增出清晰的條帶，其中，thelo12等29對(duì)引物在中國春、煙農(nóng)15和二倍體長穗偃麥草中擴(kuò)增出相同條帶；thelo5和thelo37在百薩偃麥草中擴(kuò)增出特異條帶；thelo11等18對(duì)引物在中國春、煙農(nóng)15和二倍體長穗偃麥草間有多態(tài)性擴(kuò)增。部分引物擴(kuò)增結(jié)果見圖3。

M:DL2000；1：煙農(nóng)15；2：中國春；3：中間偃麥草；4：二倍體長穗偃麥草；5：百薩偃麥草；6；假鵝觀草。圖3～5同

M:DL2000; 1:Yannong 15; 2:Chinese Spring; 3:Th.intermedium; 4:Th.elongatum; 5:Th.bessarabicum; 6:Ps.strigosa. The same in fig.3-5

圖2部分中間偃麥草分子標(biāo)記在普通小麥和中間偃麥草及其基因組供體中的擴(kuò)增

Fig.2Amplication inT.aestivumL.,Th.intermediumand its genome donor with part molecular markers fromTh.intermedium

2.2.3百薩偃麥草EST-SSR的擴(kuò)增結(jié)果

利用50對(duì)基于百薩偃麥草RNA-seq開發(fā)的EST-SSR引物對(duì)不同材料進(jìn)行擴(kuò)增，共有31對(duì)引物可以在不同材料中擴(kuò)增出清晰的條帶，其中，thbes4等18對(duì)引物在中國春、煙農(nóng)15和百薩偃麥草中擴(kuò)增出相同條帶；thbes23和thbes42引物在二倍體長穗偃麥草和百薩偃麥草中擴(kuò)增出相近條帶；thbes33在假鵝觀草中擴(kuò)增出特異條帶；thbes37等10對(duì)引物在中國春、煙農(nóng)15和百薩偃麥草間有多態(tài)性擴(kuò)增，在這些特異引物中，thbes39等3對(duì)引物在中間偃麥草和百薩偃麥草間擴(kuò)增出相同條帶。部分引物擴(kuò)增結(jié)果見圖4。

圖3　部分二倍體長穗偃麥草分子標(biāo)記在普通小麥和中間偃麥草及其基因組供體中的擴(kuò)增

2.2.4假鵝觀草EST-SSR的擴(kuò)增結(jié)果

利用50對(duì)基于假鵝觀草RNA-seq開發(fā)的EST-SSR引物對(duì)不同材料進(jìn)行擴(kuò)增，共有40對(duì)引物可以在不同材料中擴(kuò)增出清晰的條帶，其中，psstr20等20對(duì)引物在中國春、煙農(nóng)15和假鵝觀草中擴(kuò)增出相同條帶；其中，psstr39引物在百薩偃麥草中擴(kuò)增出特異條帶；psstr32等19對(duì)引物在中國春、煙農(nóng)15和假鵝觀草間有多態(tài)性擴(kuò)增，在這些特異引物中，psstr17和psstr23引物在中間偃麥草和假鵝觀草間擴(kuò)增出相同條帶，psstr38和psstr44引物在百薩偃麥草中擴(kuò)增出特異條帶。部分引物擴(kuò)增情況見圖5。

圖4　部分百薩偃麥草分子標(biāo)記在普通小麥和中間偃麥草及其基因組供體中的擴(kuò)增

圖5　部分假鵝觀草分子標(biāo)記在普通小麥和中間偃麥草及其基因組供體中的擴(kuò)增

通過引物多態(tài)性驗(yàn)證，并利用中間偃麥草、二倍體長穗偃麥草、百薩偃麥草及假鵝觀草對(duì)多態(tài)性引物進(jìn)行基因組歸類統(tǒng)計(jì)，最終開發(fā)出的中間偃麥草、二倍體長穗偃麥草、百薩偃麥草、假鵝觀草基因組特異分子標(biāo)記數(shù)量依次為28個(gè)、19個(gè)、22個(gè)和20個(gè)。標(biāo)記序列見表2。

表2　各材料特異分子標(biāo)記名稱及序列

(續(xù)表2Continued table 2)

材料Materials分子標(biāo)記Marker引物序列(5'→3')Primersequence(5'→3')分子標(biāo)記Marker引物序列(5'→3')Primersequence(5'→3')二倍體長穗thelo1F:CGCAACTCACAAGTGATGCCthelo22F:AGATCGACACCGGCAAAAGT偃麥草R:AACACGATAAAGGCAGGCCAR:CCGATGCTCTCACCACGTAATh.elongatumthelo3F:AGCCTCCAGAATGACCTTGCthelo23F:ACAATCGGGTCCAAACAGCTR:CATCATCTTCTTGCTGCCGCR:GAGAAGAACTCCGTGTCCCGthelo6F:CACGTGAGATTCCGCTGAGGthelo34F:GCCCAACTAGTGCACTCAGGR:AGTGGGACTTGTTGGTGAGCR:GCACGTTCCCTAGAAAGGCTthelo7F:GGAGATGATGCCGGTTCTGAthelo39F:TGCTGCTCCTTGCTCTGAAAR:ACATACAGAAGCACGGCACAR:ACTCTCGAGCCCTTCAAGGAthelo8F:ATGAACTGCATCGACTCGCTthelo41F:CCTCTCCCGACCTCTCTCTCR:GCAAAGGATAGAGGGGGCATR:GTGATCACCTCGTTGTTGCGthelo10F:CCTCCCATTCTTGAACGCCTthelo44F:CTTCACTTCGTCGTCCAGCTR:CTTCTTCCTCATGCGCATGCR:CGAGGAGCGTGATGACATGAthelo11F:CCATGATTGTCCGCCTACGAthelo45F:CACTCCACCACTCTGCTTCCR:AACCCCACAACGGAGATCACR:CCTTTCCCTCCATGTGACCCthelo14F:AATGGCCAAACGGGAGAGAGthelo50F:TTTGAGTCTTGGGTCAGGGCR:ACACTAAGCCGGCAATCACAR:TCTTGGTTCTGTGTCGTACCAthelo17F:CACGTCATCAGCTCCACTCAthinta19F:TGAGATGCTCCATGTGGTCTR:AGTTGTCTGGCAGGATGGTCR:GCGTGGTCAACTTGCAGAAGthelo18F:ATCCTCGCCTCTGTCTGCTAR:CGGGAACTTGGAGGCATTCT百薩偃麥草thbes17F:AGGCCCCACTCTCACACATAthinta9F:TGGCGAGGGAACAATCAGAGTh.bessarabicumR:TGCCTTAGCTGTACACTGGCR:CTGCCCCTCCTTTCTAGAAAAthbes19F:GGGCAATCACCACAAACAGGthinta16F:TGGCCTCAGAGCAAAACACAR:CGCAAAGGTTTTTCACTCGGTR:GGCTATCTTACAAGGAGGAGGTGthbes27F:GCACACGCAACGAACTTACAthinta45F:AAGCTGGTGCGGAACTCTTTR:TGGAGAAAGTTGGCATCTCCGR:GCAGAGATGAAAGTAGTACAAGCGthbes36F:CGACACCTGCGCAACATTACthinta46F:CTCCTCCTCCTCTCCTTGCTR:ATGGGTTGGCTGCAAGAAGAR:AGGAGGAGGGGCATGATGTthbes37F:ACGAAACACACGGGGGTATCthinta48F:CGCGGAAGAAATGCCGTATCR:TGCTAGGCACCTGCTAATCGR:CTCTCTCATCTTGGCGTGCAthbes38F:CGTATCCCACGCGCTTTGTAthinta49F:CTCACCGTTGCTCACTGGATR:GCTCATGCGACACAAATCCAR:CATCATCTTCTTGCTGCCGCthbes39F:GAGGAGAAGGTGGTGGAAGCpsstr38F:GACGGCAAGATTATGGCAGCR:AACCGGAGCCATAACCACTGR:CTACACCTGCGTCATCTCCCthbes40F:TGCACCAAGATGAGGAGCAGpsstr39F:GGGAGATGACGCAGGTGTAGR:TGGCATTGCTCTGGTGTCTTR:GGCTCTTGTCAGATCGTGCTthbes41F:AGCTGAACCAACGAGACCTGthelo5F:CCAGCTCAGCGGCAAACTAAR:TGCTGGTGTGGCCACATTATR:GCTTCTCCTTCACCTTCCCGthbes45F:TTATGGTTGGGGGTGATGCCthelo37F:GCTGGTCCATTGGTTTGCTGR:GCCCTTTTGTGAGAGCTGTTR:CTTCGGCCATCCCTCCGGthinta8F:TCATCCTCGAAGACGTGCTGpsstr44F:CGGCTTCGGTTCCTCTTTCTR:CTTCCCACCTCCGACGAAAAR:TCATGCCAGTTGTGAGGGAC假鵝觀草psstr2F:GGAAGGAAGCAAATCGCAGCpsstr23F:TCGCAGCGGTAGTTGTTCTTPs.strigosaR:AAAATCCCTTCCTCGTCCCGR:CGCCACTCGACTTAAACCCTpsstr4F:GTCCTTCCTCTCCGTTGGTGpsstr25F:AGGCGGACATACAAATGGCAR:GCCGTCACACCACACACAR:CTTTCCCTTCTTCTTCTTCCTCTCpsstr6F:CACCTATCCCCGTTCCGTTCpsstr26F:TGTGCACCTGTACTGTGTCGR:AGGCCTTCTTGTCGAAGTCGR:TAAACAATGCCACCGCGAAGpsstr9F:GGAGATCGTGGTACTCGCTGpsstr29F:AACGCAGATGCCCACATACAR:ATGGAGCAGTTGGTGGGATGR:TGTCTATCCCACCTACCCCApsstr11F:CTCCGGTCACCACCTTTTCTpsstr32F:AGGATCAGTGGCCACCTACTR:TGAACCTCCATTGCCTTGGTR:CCTCACAAGCCATGGGATGTpsstr13F:TTACTCTCTGCCACCACCCApsstr38F:GACGGCAAGATTATGGCAGCR:CAAAACGCCAGCCCTACAACR:CTACACCTGCGTCATCTCCCpsstr16F:CTCCTCCTAACAACAGGGCGpsstr43F:GTCCATACGTAGACACACAGCAR:CGCCATTTTATCTGCCTGCCR:AGCTACCACACGTATACGCGpsstr17F:GCAATTTCCGTTGGCCAGAGpsstr44F:CGGCTTCGGTTCCTCTTTCTR:TGGAAAACCAATTACTGCCAACAR:TCATGCCAGTTGTGAGGGACpsstr19F:ACTGACTCATGCTCTCTTCACApsstr47F:CGGCTTCGGTTCCTCTTTCTR:AGGTCCACCTGTTGTTGTCGR:GAGACCAAGGCCAGTGTTCApsstr22F:GCCACTCTGAATCCCGTCTCthbes33F:TACCACCGCCCAGCAAATAGR:TAGCACTGAATCGCCGGATGR:GAAGACGACGAGCGGTACTC

3討 論

3.1基于RNA-seq開發(fā)中間偃麥草基因組特異標(biāo)記的特點(diǎn)

對(duì)同一物種EST序列進(jìn)行SSR搜索時(shí)，所得結(jié)果可能不同，如小麥的SSR出現(xiàn)頻率為3.2%[16]與4.1%[17]，這是由于不同軟件在搜索SSR時(shí)所采取的算法及標(biāo)準(zhǔn)不同，搜索到的結(jié)果存在差異；不同物種的SSR出現(xiàn)頻率也有很大差異，如黨參(16.1%)[18]較小麥高出幾倍。本研究中，中間偃麥草、二倍體長穗偃麥草、百薩偃麥草和假鵝觀草的SSR出現(xiàn)頻率(9.6%、9.3%、13.3%和11.3%)相比其他禾本科植物，非常適合大批量開發(fā)標(biāo)記。

利用通過高通量測(cè)序獲得的中間偃麥草及其基因組供體材料轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)出的200對(duì)引物中，共75對(duì)引物在中國春、煙農(nóng)15和中間偃麥草、二倍體長穗偃麥草、百薩偃麥草、假鵝觀草間具有多態(tài)性擴(kuò)增。僅計(jì)算由某材料轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)開發(fā)的引物在該材料中的多態(tài)率，所開發(fā)引物在中間偃麥草、二倍體長穗偃麥草、百薩偃麥草及假鵝觀草中的多態(tài)率分別達(dá)到46.0%、36.0%、20.0%和38.0%，多態(tài)率遠(yuǎn)高于根據(jù)谷類作物的共線性，利用小麥G-SSR引物1 255對(duì)、EST-SSR引物3 012對(duì)、STS引物 293 對(duì)、RAPD引物1 200個(gè)產(chǎn)生的多態(tài)性引物在中間偃麥草(7.6%)、二倍體長穗偃麥草(7.5%)、百薩偃麥草(7.5%)及假鵝觀草(5.9%)中的多態(tài)率(課題組前期試驗(yàn))。因此，基于RNA-seq開發(fā)EST-SSR具有多態(tài)率高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)。有35對(duì)引物在中國春和中間偃麥草等材料中沒有穩(wěn)定的擴(kuò)增產(chǎn)物，這可能由于采用部分單核苷酸重復(fù)序列設(shè)計(jì)引物、轉(zhuǎn)錄組EST拼接出現(xiàn)誤差等原因?qū)е隆?/p>

設(shè)計(jì)引物采用的序列直接關(guān)系引物擴(kuò)增多態(tài)率，中間偃麥草等材料和小麥存在較近的親緣關(guān)系，序列有一定的相似性，這會(huì)降低特異標(biāo)記的開發(fā)效率，本研究中，44.0%的引物在中國春、煙農(nóng)15和中間偃麥草等材料間具有相同的擴(kuò)增片段也印證了這一點(diǎn)。下一步可通過中間偃麥草與小麥EST序列比對(duì)，得到中間偃麥草的特異序列，由此設(shè)計(jì)出的引物應(yīng)該特異性更高、針對(duì)性更強(qiáng)，同時(shí)這些特異序列對(duì)于偃麥草的分子遺傳和進(jìn)化研究很有裨益。

3.2中間偃麥草基因組特異標(biāo)記的應(yīng)用

利用7個(gè)中國春-百薩偃麥草染色體異附加系可以將本研究開發(fā)的22個(gè)百薩偃麥草特異標(biāo)記，分別定位于 1Eb到7Eb染色體上，同樣，可以將本研究中開發(fā)的其他材料的特異分子標(biāo)記定位到相關(guān)的染色體上，這項(xiàng)工作尚在進(jìn)行之中。下一步希望通過開發(fā)大量的引物并驗(yàn)證更多新特異分子標(biāo)記，使其覆蓋到Ee基組、Eb基組及St 基組每一條染色體上，建立Ee、Eb及St基組特異分子標(biāo)記體系。開發(fā)的中間偃麥草特異標(biāo)記可以應(yīng)用于鑒定小麥-中間偃麥草小片段易位系或漸滲系以及染色體物理作圖中。

本研究中有122對(duì)引物(61.0%)在中國春、煙農(nóng)15上有穩(wěn)定的擴(kuò)增位點(diǎn)，因而也可以作為小麥的分子標(biāo)記，這進(jìn)一步豐富了小麥的標(biāo)記基礎(chǔ)。另外，在特異引物中，有10對(duì)引物在中間偃麥草和百薩偃麥草間擴(kuò)增出相同特異條帶，有2對(duì)引物在中間偃麥草和假鵝觀草間擴(kuò)增出相同特異條帶；還有一些非特異引物在中間偃麥草與其基因組供體間或在二倍體長穗偃麥草、百薩偃麥草、假鵝觀草間擴(kuò)增出相同條帶。說明中間偃麥草、二倍體長穗偃麥草、百薩偃麥草、假鵝觀草間有較高的同源性，這對(duì)于研究偃麥草屬內(nèi)的物種親緣關(guān)系也有著一定幫助。

通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和分子標(biāo)記的驗(yàn)證，建立了高效開發(fā)中間偃麥草特異標(biāo)記的新方法，開發(fā)的標(biāo)記可應(yīng)用于小偃麥后代材料遺傳組成的鑒定，加速中間偃麥草優(yōu)異基因的轉(zhuǎn)移與利用。

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收稿日期：2015-12-15修回日期：2016-01-22

基金項(xiàng)目：山東省良種工程農(nóng)業(yè)生物資源利用項(xiàng)目

通訊作者：李興鋒(E-mail:lixf@sdau.edu.cn)

中圖分類號(hào)：S512.1；S330

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1009-1041(2016)06-0699-09

Development of Specific Molecular Markers forThinopyrumintermediumUsing RNA-seq Data

CUI Yu1,BAO Yinguang1,WANG Honggang1,2,LI Xingfeng1,2

(1.College of Agronomy,Shandong Agriculture University,Tai’an,Shandong 271018,China;2.Tai’an Sub-center of National Wheat Improvement Center,Tai’an,Shandong 271018,China)

Abstract:Thinopyrum intermedium,one of the important relatives of common wheat,has good tolerance to environmental stress and resistance to diseases such as rust and powdery mildew.Development of specific molecular markers is valuable for transformation and application of the favorable genes from Th.intermedium.In order to develop an efficient method of screening the specific molecular markers in Th.intermedium,the RNA-seq data of Th.intermedium and its genome donors,including Th.elongatum,Th.bessarabicum and Pseudoroegneria strigosa were used for developing EST-SSR markers.Two hundred pairs of EST-SSR primers were synthesized and verified through amplifying different DNA materials,and 75(37.5%) primers have specific amplification in Th.intermedium,Th.elongatum,Th.bessarabicum and Ps.strigosa with good polymorphism.The result indicates that developing EST-SSR primers from RNA-seq would be efficient in screening specific molecular markers of Th.intermedium,which can be used in developing specific molecular markers for other crops and their related species.

Key words:Thinopyrum intermedium; Wheat; RNA-seq; Specific molecular markers

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-05-30

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20160530.1535.006.html

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