利用90K基因芯片進(jìn)行小麥旗葉相關(guān)性狀的QTL定位

連俊方，張德強(qiáng)，武炳瑾，宋曉朋，馬文潔，周麗敏，馮 毅，孫道杰

(西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

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利用90K基因芯片進(jìn)行小麥旗葉相關(guān)性狀的QTL定位

連俊方，張德強(qiáng)，武炳瑾，宋曉朋，馬文潔，周麗敏，馮 毅，孫道杰

(西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

摘要：為了發(fā)掘影響小麥旗葉相關(guān)性狀的QTL，以小麥骨干親本周8425B與優(yōu)良品種小偃81構(gòu)建的包含102個(gè)家系的重組自交系(Recombinant inbred line,RIL)為材料，采用小麥90K SNP基因芯片技術(shù)和SSR標(biāo)記對其進(jìn)行分子標(biāo)記檢測，構(gòu)建含有全基因組SNP和SSR 標(biāo)記的高密度遺傳圖譜，并在4個(gè)環(huán)境下對小麥旗葉相關(guān)性狀QTL進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，所構(gòu)建圖譜含有6 949對多態(tài)性標(biāo)記，其中，SNP標(biāo)記6 910對，SSR標(biāo)記39對，覆蓋染色體總長度4 839.9 cM，標(biāo)記間平均距離0.7 cM；A、B和D染色體組分別有2 085、4 677和187對標(biāo)記，分別占總標(biāo)記數(shù)的30.0%、67.5%和2.7%，標(biāo)記間平均距離分別為1.0、0.6和0.8 cM。采用完備復(fù)合區(qū)間作圖法共檢測到22個(gè)旗葉性狀加性效應(yīng) QTL，10個(gè)旗葉長 QTL 分布于 2A、3B、4B、5A、6B和7B染色體上，解釋表型變異 7.900%～24.098%，除 Qfll2A-1能在2個(gè)環(huán)境中檢測到外，其余均為單環(huán)境QTL；4個(gè)旗葉寬 QTL分布于2A、3A和5B染色體上，解釋表型變異9.080%～16.540%，其中， Qflw2A-1在3個(gè)環(huán)境中均能檢測到，解釋表型變異12.483%～16.540%，為1個(gè)穩(wěn)定的主效QTL；8個(gè)旗葉面積 QTL 分布于2A、3B、4B、5A、6B和7A染色體上，解釋表型變異9.310%～30.498%，其中，3個(gè)QTL位于5A染色體上。此外，鑒定出3個(gè)分布于2A、5A和6B染色體上的 QTL富集區(qū)段。

關(guān)鍵詞：小麥；重組自交系；旗葉性狀；SNP；QTL

小麥旗葉對小麥的產(chǎn)量具有重要的影響[1]，在抽穗開花后對粒重的貢獻(xiàn)率超過30%，而在發(fā)育后期，旗葉的凈光合物質(zhì)幾乎全部運(yùn)輸?shù)阶蚜Ｖ腥2]。小麥旗葉的長、寬及葉面積等相關(guān)性狀與其產(chǎn)量具有顯著的正相關(guān)關(guān)系[3-7]。因此，對小麥旗葉相關(guān)性狀的研究將會(huì)對小麥產(chǎn)量育種提供理論指導(dǎo)。

目前，國內(nèi)外有關(guān)旗葉性狀的QTL研究已有諸多報(bào)道。常 鑫等[8]和趙 朋等[9]分別利用小偃81/西農(nóng)1376和春小麥寧春4號/寧春27構(gòu)建的重組自交系(Recombinant inbred line,RIL)群體，在多環(huán)境中檢測出位于不同染色體的多個(gè)控制旗葉長、寬和面積的QTL；閆 雪等[10]利用旱選10號和魯麥14構(gòu)建的包含150個(gè)家系的DH群體，分別在干旱脅迫與正常灌溉條件下檢測到多個(gè)控制旗葉長、寬和面積的QTL；Jia等[11]在5A染色體上發(fā)現(xiàn)一個(gè)控制旗葉寬的QTL；Xue等[12]利用以綿陽99-323 和 PH691為遺傳背景的近等基因系(NIL)衍生的次級F2群體將Jia等[11]發(fā)現(xiàn)的 Qflw.naw-5A精細(xì)定位并發(fā)現(xiàn)其與5A染色體上的 Fhb5緊密連鎖。然而，這些研究都是利用傳統(tǒng)的SSR等標(biāo)記構(gòu)建的低密度遺傳圖譜，標(biāo)記間距離大，檢測方法費(fèi)時(shí)、繁瑣，人工成本高，很難應(yīng)用于育種實(shí)踐。基因芯片技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[13-15]以及水稻[16-17]、大麥[18]等谷類作物的研究中。Zhang等[19]利用SNP基因芯片定位到控制水稻旗葉寬的主效QTL， Bertholdsson等[20]利用SNP基因芯片在大麥中發(fā)現(xiàn)5個(gè)影響光量子產(chǎn)量的QTL。近年來，基于Illumina 技術(shù)平臺(tái)開發(fā)了小麥9K和90K SNP基因芯片[21]。Wu等[22]利用9K SNP芯片和SSR標(biāo)記在燕大1817與北農(nóng)6號組成的RIL群體中定位出與旗葉性狀有關(guān)的QTL。然而目前利用90K芯片對旗葉相關(guān)性狀的QTL檢測還鮮見報(bào)道。

本研究以利用周8425B和小偃81構(gòu)建的包含102個(gè)家系的RIL群體為研究材料，采用小麥90K SNP基因芯片技術(shù)和SSR標(biāo)記對其進(jìn)行分子標(biāo)記檢測，構(gòu)建含有全基因組SNP和SSR 標(biāo)記的高密度遺傳圖譜，并在4個(gè)環(huán)境下對小麥旗葉相關(guān)性狀QTL進(jìn)行檢測，以期為小麥旗葉長、寬和面積等數(shù)量性狀的基因定位、分子標(biāo)記開發(fā)、功能基因的精細(xì)定位以及株型育種提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

供試材料為周8425B(母本，是由周口市農(nóng)科院育成的高產(chǎn)、抗病新種質(zhì))與小偃81(父本，為李振聲院士育成的高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗病、半冬性、多穗型中熟品種)雜交后經(jīng)單粒傳法得到的含 102個(gè)家系的 F8～F9代RIL群體，由西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院王 輝教授課題組創(chuàng)制并保存。

1.2田間種植和性狀調(diào)查

2013-2014年度和2014-2015年度將RIL群體及其親本種植于陜西楊凌和河南安陽兩地。兩年均采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，每個(gè)株系種植2行，2次重復(fù)，行長2 m，行距0.25 m，株距3 cm。田間管理按照當(dāng)?shù)卮筇锷a(chǎn)管理標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。于小麥開花后20 d(灌漿期)測定其旗葉長、寬，每個(gè)株系隨機(jī)抽取6株進(jìn)行測量，數(shù)據(jù)讀取至小數(shù)點(diǎn)后兩位，然后取其均值作為該品系旗葉長、寬值，旗葉面積采用宋荷仙等[23]的方法，旗葉面積=葉長×葉寬×0.83。

1.3DNA 的提取和分子標(biāo)記檢測

采用CTAB法[24]提取102個(gè)RIL家系及其親本DNA，將其保存在TE中，用分光光度計(jì)定量，并將樣品用TE調(diào)到標(biāo)準(zhǔn)濃度50 ng·μL-1，然后用0.8%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。樣品電泳主帶清晰，大小在10 kb以上，沒有明顯降解，總量 1 μg 以上，A260/A280=1.7～2.1，為合格樣品。

SNP標(biāo)記由北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司利用 Illumina SNP Genotyping技術(shù)測試平臺(tái)，使用微珠芯片技術(shù)(BeadArray)進(jìn)行檢測，其多態(tài)性使用 Genomestudio v1.0 軟件進(jìn)行分析。

SSR引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列信息從GrainGene 2.0(http://wheat.pw.usda.gov/GG2/index.shtml)獲得，利用兩親本進(jìn)行多態(tài)性標(biāo)記篩選，用多態(tài)性引物在RIL群體中進(jìn)行檢測。

1.4遺傳連鎖圖的構(gòu)建和QTL定位

利用軟件QTL IciMapping 4.0和QTL Mapchart 2.1構(gòu)建分子標(biāo)記的連鎖圖。利用IBM SPSS statistics 對表型數(shù)據(jù)進(jìn)行偏峰度及相關(guān)性分析。在此基礎(chǔ)上，結(jié)合表型數(shù)據(jù)，使用QTL IciMapping 4.0軟件，采用完備區(qū)間作圖法(ICIM-ADD)[25]進(jìn)行QTL檢測，其中，LOD閾值為2.5，掃描步長為1 cM，逐步回歸進(jìn)入的概率(PIN)為0.001，缺失表型不用于QTL作圖(表型缺失的基因型數(shù)據(jù)仍會(huì)使用)。QTL 的命名參考 McIntosh等[26]的方法，按照性狀及染色體位置進(jìn)行命名，旗葉長命名為Qfll，旗葉寬命名為Qflw，旗葉面積命名為Qfla，如 Qfll3A-1表示位于3A染色體上控制旗葉長且位于第一個(gè)標(biāo)記區(qū)間的QTL。

2結(jié)果與分析

2.1遺傳圖譜構(gòu)建

在親本周8425B和小偃81中進(jìn)行標(biāo)記檢測，共篩選出8 650對多態(tài)性標(biāo)記，其中包含187對SSR標(biāo)記和8 463對SNP標(biāo)記。經(jīng)過連鎖分析，共有6 949對標(biāo)記構(gòu)建到圖譜中，其中包含6 910對SNP標(biāo)記和39對SSR標(biāo)記，覆蓋染色體總長度4 839.9 cM，標(biāo)記間平均距離0.7 cM。構(gòu)建的遺傳圖譜中，A 染色體組有2 085對標(biāo)記，占總標(biāo)記數(shù)的30.0%，全長2 074.1 cM，標(biāo)記間平均距離為1.0 cM；B染色體組多態(tài)性標(biāo)記最多，共4 677對，占標(biāo)記總數(shù)的67.3%，全長2 624.6 cM，標(biāo)記間平均距離僅為0.6 cM；D染色體組標(biāo)記數(shù)目最少，共187對，占標(biāo)記總數(shù)的2.7%，染色體覆蓋長度最短，全長僅有141.2 cM，標(biāo)記間平均距離0.8 cM。

2.2表型性狀變異分析

將2013-2014年度種植在陜西楊凌(E1)、河南安陽(E2)和2014-2015年度種植在陜西楊凌(E3)、河南安陽(E4)的各親本及RIL家系的表型性狀進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果(表1)表明，親本周8425B的旗葉長、寬和面積在多環(huán)境中表現(xiàn)均大于親本小偃81，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。RIL群體各環(huán)境下表現(xiàn)出明顯的超親遺傳，各家系3個(gè)性狀表型變異豐富，且呈現(xiàn)連續(xù)變異，偏、峰度絕對值基本都小于1，符合正態(tài)分布，表現(xiàn)為多基因控制的數(shù)量性狀遺傳的特點(diǎn)，適合做QTL分析。雖然2014-2015年度種植于安陽的旗葉面積的峰度稍大于1，但根據(jù)李慧慧等[27]數(shù)量性狀作圖的要求，表型性狀的非正態(tài)性分布并不影響QTL作圖。

表1　不同環(huán)境下RIL群體及其親本的旗葉長、寬和面積

2.3旗葉長、寬和面積的QTL分析

在4個(gè)環(huán)境中共檢測到22個(gè)旗葉長、寬和面積相關(guān)的QTL，分別位于2A、3A、3B、4B、5A、5B、6B、7A和7B染色體上，其中3個(gè)QTL在多個(gè)環(huán)境中均檢測到。A、B、D基因組分別含有10、12和0個(gè)QTL；第1至7同源群上分別檢測到0、3、4、2、6、5和2個(gè)QTL(表3，圖1)。

2.3.1旗葉長QTL

4個(gè)環(huán)境中共檢測到10個(gè)控制旗葉長的QTL，分別位于2A、3B、4B、5A、6B和7B染色體上，解釋表型變異7.900%～24.080%。除 Qfll2A-1外，其他QTL只能在1個(gè)環(huán)境中檢測到，說明旗葉長的遺傳基礎(chǔ)復(fù)雜且受環(huán)境的影響很大。 Qfll2A-1在E3和E4兩個(gè)環(huán)境中檢測到，位于標(biāo)記Tdurum_contig64391_231和RAC875_c58503_182之間，標(biāo)記間距離僅為0.5 cM。

2.3.2旗葉寬QTL

4個(gè)環(huán)境中共檢測到4個(gè)控制旗葉寬的QTL，分別位于2A、3A和5B染色體上，解釋表型變異9.080%～16.540%。其中， Qflw2A-2在E2、E3、E4多個(gè)環(huán)境中均檢測到，位于標(biāo)記RAC875_c58006_352和BS00094574_51之間，標(biāo)記間距離為1.0 cM。

2.3.3旗葉面積QTL

4個(gè)環(huán)境中共檢測到8個(gè)控制旗葉面積的QTL，分別位于2A、3B、4B、5A、6B和7A染色體上，解釋表型變異9.310%～30.498%。其中， Qfla4B-1在E3、E4中均檢測到，位于標(biāo)記RAC875_c18200_929和Excalibur_c47209_87之間，標(biāo)記間距離為0.5 cM。此外，在E2和E4中檢測到 Qfla5A-1、 Qfla5A-2和 Qfla5A-3均位于5A染色體200.0 cM附近。

表2　不同環(huán)境中旗葉長、寬和面積的QTL定位結(jié)果

3討 論

3.1QTL定位結(jié)果一致性

數(shù)量性狀受多基因控制，且受環(huán)境影響較大，即使相同群體不同年份檢測出的QTL也存在較大差異。目前已有利用SSR標(biāo)記和9K芯片對旗葉性狀的QTL定位的研究，但由于遺傳圖譜密度小，定位出的QTL標(biāo)記間距離大，存在的假陽性QTL多，很難應(yīng)用于育種實(shí)踐。然而，利用90K基因芯片對小麥旗葉性狀進(jìn)行QTL的發(fā)掘卻很少有學(xué)者進(jìn)行研究。本研究利用90K SNP芯片構(gòu)建遺傳圖譜，所用標(biāo)記和前人研究所用標(biāo)記不同，很難用于比較是否為同一QTL，但仍具有一定的參考價(jià)值。

Qfla3B2-1是位于小麥3B染色體上控制旗葉面積的QTL，Wu等[22]和常 鑫等[8]也在該染色體上檢測出控制旗葉長的QTL，但位置相距較遠(yuǎn)，應(yīng)該不是同一QTL。在4B染色體上檢測到控制旗葉長的 Qfll4B-1，F(xiàn)an等[28]在4B染色體上發(fā)現(xiàn)3個(gè)旗葉長QTL，但由于所用標(biāo)記不同，不能確定是否存在相同QTL。位于5B染色體上的 Qfll5B-1與Fan等[28]在5B染色體上發(fā)現(xiàn)旗葉長相關(guān)QTL的表型貢獻(xiàn)率都較低，不是主效QTL。在3個(gè)環(huán)境中均檢測到位于6B染色體上的旗葉長QTL，其中3個(gè)QTL都在200.0 cM附近的位置，該區(qū)段應(yīng)該為1個(gè)控制旗葉長的染色體簇，趙 朋等[9]也在該染色體上發(fā)現(xiàn)旗葉長QTL。在2A染色體的RAC875_c58006_352和BS00094574_51標(biāo)記之間檢測到1個(gè)旗葉寬QTL，在3個(gè)環(huán)境中均穩(wěn)定表達(dá)，解釋表型變異13.389%～16.540%，是1個(gè)主效QTL。 Qflw5B-1為在5B上控制旗葉寬的QTL，F(xiàn)an等[28]和Jia等[11]也在同一染色體上發(fā)現(xiàn)旗葉寬QTL。 Qfla4B-1為在4B染色體上136.0 cM位置控制旗葉面積的QTL，在2個(gè)環(huán)境中均穩(wěn)定表達(dá)，表型貢獻(xiàn)率為14.071%～16.396%，說明這是1個(gè)穩(wěn)定的主效QTL，F(xiàn)an等[28]也在4B染色體上檢測出旗葉面積QTL，但臨近的標(biāo)記不同，不能確定是否為同一位點(diǎn)。在5A染色體200.0 cM附近存在3個(gè)控制旗葉面積的QTL，Wu等[22]在5A上200.0 cM處也檢測出1個(gè)旗葉面積QTL，且在多環(huán)境中均能檢測到，預(yù)測該位點(diǎn)存在穩(wěn)定表達(dá)的QTL，但是否為同一位點(diǎn)還很難判斷。本研究發(fā)現(xiàn)的旗葉面積 Qfla6B-1與Fan等[28]在6B染色體上發(fā)現(xiàn)旗葉面積QTL均為微效QTL。位于7A染色體上的 Qfla7A-1與常 鑫等[8]發(fā)現(xiàn)旗葉面積QTL在7A上的位置相近，預(yù)測該位置附近存在影響旗葉面積的基因。 Qfll2A-1為在2A染色體上Tdurum_contig64391_231與RAC875_c58503_182標(biāo)記之間存在的1個(gè)控制旗葉長的QTL，該位點(diǎn)在E2和E4兩個(gè)環(huán)境中均能檢測出來，是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的位點(diǎn)，標(biāo)記間距離僅為0.5 cM，但目前只在一個(gè)群體檢測出來，需要在多個(gè)群體中進(jìn)一步驗(yàn)證，以期能夠早日應(yīng)用于育種實(shí)踐。

3.2QTL聚集區(qū)及一因多效QTL

本研究在2A、5A和6B染色體上檢測出3個(gè)QTL聚集區(qū)及一因多效QTL。高度相關(guān)的性狀之間表現(xiàn)出區(qū)域化分布現(xiàn)象或存在一些共同的QTL[29]。位于2A染色體標(biāo)記Tdurum_contig64391_231與RAC875_c58503_182之間的QTL為同時(shí)控制旗葉長和旗葉面積的一因多效QTL，且該QTL在多個(gè)環(huán)境中均能檢測到，為1個(gè)穩(wěn)定的QTL；在5A染色體上3個(gè)相近的區(qū)間BS00063095_51-BS00090309_51、wsnp_Ex_c19647_28632894-Ku_c24324_850和wsnp_BE497820A_Ta_2_2-BS00043474_51包含1個(gè)旗葉長和3個(gè)旗葉面積的QTL，其中，BS00063095_51-BS00090309_51之間的QTL為同時(shí)控制旗葉長和旗葉面積的一因多效QTL；在6B染色體上Ex_c20409_854-Kukri_c42895_593區(qū)間的QTL同時(shí)影響旗葉長和旗葉面積，為一因多效QTL。在5A染色體上檢測到3個(gè)旗葉面積QTL，且3個(gè)QTL距離在24.0 cM內(nèi)，推測這一區(qū)段為控制旗葉面積的基因簇。此外，6B染色體上檢測出4個(gè)旗葉長相關(guān)QTL。

本研究發(fā)現(xiàn)控制旗葉相關(guān)性狀的QTL存在QTL聚集區(qū)和一因多效現(xiàn)象，這說明旗葉不同性狀之間具有一定的相關(guān)性?？刂葡嚓P(guān)性狀的基因更傾向于形成基因聚合區(qū)域，而非零散分布，這也許是物種進(jìn)化帶來的結(jié)果，同時(shí)也對聚合育種提供了很大的便利。

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收稿日期：2016-01-17修回日期：2016-03-07

基金項(xiàng)目：國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目(2014CB138100)；陜西省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2015JM3094)；陜西省重點(diǎn)科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(2014KCT-25)

通訊作者：馮 毅(E-mail：fengyi1455@126.com)；孫道杰(E-mail：chinawheat@163.com)

中圖分類號：S512.1；S330

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1009-1041(2016)06-0689-10

QTL Mapping of Flag Leaf Traits Using an Integrated High-density 90K Genotyping Chip

LIAN Junfang,ZHANG Deqiang,WU Bingjin,SONG Xiaopeng,MA Wenjie,ZHOU Limin,Feng Yi,SUN Daojie

(College of Agronomy,Northwest A&F University,Yangling,Shaanxi 712100,China)

Abstract:In order to carry out the quantitative trait loci(QTLs) of wheat flag leaf traits,in this study,QTLs for flag leaf traits were mapped using an available high-density 90K wheat SNP and SSR genetic linkage map developed from a recombinant inbred line(RIL) population of Zhou 8425B × Xiaoyan 81.A genetic map covering 21 wheat chromosomes was constructed,which contains 6 949 polymorphism markers(6 910 SNP and 36 SSR),with a total genetic distance of 4 839.9 cM and an average interval distance of 0.7 cM.A,B and D chromosomes posseed 2 085,4 677 and 187 polymorphism markers,accounting for the proportion of 30.0%,67.3% and 2.7%,respectively.And the average interval distance of the markers were 1.0,0.6 and 0.8 cM,respectively.Using phenotypic data at two locations(Yangling and Anyang) in two years(2013-2014 and 2014-2013 growing seasons),22 QTLs for flag leaf length(FLL),flag leaf width(FLW) and flag leaf area(FLA) were detected by inclusive composite interval mapping(ICIM)(LOD ≥ 2.5). Among those QTLs,ten QTLs for FLL were mapped on chromosome 2A,3B,4B,5A,6B and 7B with phenotypic variations ranging from 7.900% to 24.098%.A stable and major QTL associated with FLL, Qfll2A-1,was detected in two environments,while the other nine QTLs can be detected in only one environment.Four QTLs for FLW were found on chromosome 2A,3A and 5B with phenotypic variations from 9.080% to 16.540%. A stable and major QTL associated with FLW, Qflw2A-1,was detected in three environments with phenotypic variations ranging from 12.483% to 16.540%.Eight QTLs for FLA were mapped on chromosome 2A,3B,4B,5A,6B and 7A with phenotypic variations ranging from 9.310% to 30.498% and three of them were anchored on 5A chromosome.Three QTL enrichment sections of 2A,5A and 6B chromosomes were identified.

Key words:Wheat; RILs; Flag leaf traits; SNP; QTL

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-05-30

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20160530.1535.004.html

第一作者E-mail：18829785748@163.com