外源注射CART特異性dsRNA對(duì)蛋雞產(chǎn)蛋性能和蛋品質(zhì)的影響

李鵬飛, 景炅婕, 畢錫麟, 王　鍇, 張子寧, 呂麗華

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西 太谷 030801)

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外源注射CART特異性dsRNA對(duì)蛋雞產(chǎn)蛋性能和蛋品質(zhì)的影響

李鵬飛1, 景炅婕2, 畢錫麟2, 王鍇2, 張子寧2, 呂麗華2

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西 太谷 030801)

摘要:選擇500只健康、20周齡的海蘭褐蛋雞，預(yù)飼30 d后隨機(jī)平均分為5組，每組4個(gè)重復(fù)，分別進(jìn)行如下處理：生理鹽水僅第1天注射一次組(A組，對(duì)照組)、可卡因—苯丙胺調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄肽(CART)特異性雙鏈RNA(dsRNA)僅第1天注射一次組(B組)、CART dsRNA每40 d注射一次組(C組)、CART dsRNA每20 d注射一次組(D組)、CART dsRNA每10 d注射一次組(E組)，120 d后對(duì)各處理組蛋雞的產(chǎn)蛋性能、蛋品質(zhì)、蛋組分和體重變化進(jìn)行測(cè)定，研究CART對(duì)產(chǎn)蛋期蛋雞的產(chǎn)蛋性能和蛋品質(zhì)的影響.結(jié)果表明：各試驗(yàn)組之間以及與對(duì)照組之間在產(chǎn)蛋率上均存在差異(P<0.05);B組的日產(chǎn)蛋量與對(duì)照組的差異不顯著，其他試驗(yàn)組與對(duì)照組的差異顯著(P<0.05);各試驗(yàn)組的采食量均高于對(duì)照組(P<0.05)；從蛋料比來看，B、C組與對(duì)照組的差異不顯著，D組與E組的差異不顯著，但均與對(duì)照組存在差異(P<0.05)；各試驗(yàn)組蛋品質(zhì)、蛋組分與對(duì)照組的差異不顯著；試驗(yàn)結(jié)束后，各試驗(yàn)組蛋雞的體重變化與對(duì)照組均存在差異(P<0.05).總之，CART dsRNA對(duì)海蘭褐蛋雞產(chǎn)蛋性能和體重變化的影響顯著， 對(duì)蛋品質(zhì)和蛋組分的影響不顯著.

關(guān)鍵詞:蛋雞; 雙鏈RNA(dsRNA); 可卡因—苯丙胺調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄肽(CART); 產(chǎn)蛋性能; 蛋品質(zhì)

提高蛋雞養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益的核心就是提高蛋雞產(chǎn)蛋率和蛋料比.可卡因—苯丙胺調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄肽(cocaine-and amphetamine-regulated transcript, CART)是動(dòng)物體內(nèi)廣泛分布的神經(jīng)肽，本課題組經(jīng)大量研究證實(shí)CART對(duì)豬[1]、綿羊[2]、牛[3-4]卵泡細(xì)胞的生長增殖及雌激素的分泌具有抑制作用；并從基因和蛋白水平上證實(shí)CART在雞卵泡中也有表達(dá)[5].蛋雞卵泡發(fā)育過程中有成熟卵泡和未成熟卵泡之分[6-7]，在產(chǎn)蛋期每天有一個(gè)未成熟卵泡經(jīng)選擇并發(fā)育為成熟卵泡[8-9].蛋雞排卵數(shù)降低的生理原因是卵泡在發(fā)育過程中出現(xiàn)卵泡閉鎖，通常閉鎖多在卵泡直徑發(fā)育到2～8 mm時(shí)發(fā)生[10].雙鏈RNA(double-stranded RNA, dsRNA)在細(xì)胞及脊椎動(dòng)物體內(nèi)可誘導(dǎo)同源序列的基因表達(dá)受到抑制，進(jìn)而產(chǎn)生干擾素反應(yīng)；已經(jīng)確定體外給予dsRNA后可不同程度地影響蛋雞各階段卵泡CART基因的表達(dá)，同時(shí)對(duì)不同發(fā)育階段蛋雞卵泡雌激素的分泌產(chǎn)生不同程度的影響，由此推測(cè)體外注射dsRNA可能通過影響卵泡細(xì)胞孕酮和雌激素的合成與分泌，進(jìn)而調(diào)控蛋雞卵泡發(fā)育過程[11].基于以上研究，本試驗(yàn)對(duì)產(chǎn)蛋期蛋雞靜脈注射CART dsRNA，通過測(cè)定蛋雞的產(chǎn)蛋性能、蛋品質(zhì)、飼料報(bào)酬和蛋雞體重，研究體外注射CART dsRNA應(yīng)用于蛋雞的可行性，為后期CART dsRNA的推廣應(yīng)用提供技術(shù)和理論指導(dǎo).

1材料與方法

1.1材料

試驗(yàn)用海蘭褐蛋雞來自于山西偏關(guān)縣新牧畜禽養(yǎng)殖公司，蛋雞均為20周齡.蛋雞飲水充足，并選用正大蛋雞產(chǎn)蛋期全價(jià)配合料(貨號(hào)324)飼喂.

1.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選擇500只健康初產(chǎn)海蘭褐蛋雞，預(yù)飼期30 d后，依據(jù)本課題組前期體外注射CART基因特異性dsRNA對(duì)海蘭褐蛋雞內(nèi)分泌激素的影響[11]，根據(jù)注射頻率的不同，隨機(jī)平均分為5組，每組4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)25只雞.各處理組分別為生理鹽水僅第1天注射一次組(A組，對(duì)照組)、CART dsRNA僅第1天注射一次組(B組)、CART dsRNA每40 d注射一次組(C組)、CART dsRNA每20 d注射一次組(D組)、CART dsRNA每10 d注射一次組(E組).5個(gè)處理組采食同一全價(jià)飼料.

1.3飼養(yǎng)管理

雞籠為三層階梯式，單籠長40 cm，深45 cm，前高45 cm，后高38 cm，籠底坡度6°～8°.雞自由飲水和采食，自然光照補(bǔ)加燈照，每籠飼養(yǎng)3只.雞舍(17±2) ℃，相對(duì)濕度55%～65%，自然通風(fēng).雞舍每天清糞2次，每周消毒1次.

1.4CART dsRNA的設(shè)計(jì)與合成

CART dsRNA的設(shè)計(jì)與合成參照本課題組前期研究的方法[6]，將序列5′-GAG CCC TGG ACA TCT ACT CCG C-3′及其互補(bǔ)鏈作為CART dsRNA序列.

1.5CART dsRNA的稀釋及注射

合成的粉末狀CART dsRNA開蓋前于5 000 r·min-1離心5 min，緩慢開蓋后加入滅菌超純水，振蕩混勻，配制成濃度為0.1 μmol·mL-1的溶液備用.

試驗(yàn)期CART dsRNA的注射劑量依據(jù)本課題組前期研究的方法[11]，按分組要求，用5號(hào)針頭在蛋雞翅膀內(nèi)側(cè)靜脈注射CART dsRNA，對(duì)照組則注射生理鹽水，劑量為每只蛋雞每次200 μL.試驗(yàn)期間采集雞蛋并記錄指標(biāo).

1.6指標(biāo)測(cè)定

1.6.1產(chǎn)蛋性能的測(cè)定試驗(yàn)期以組內(nèi)重復(fù)為單位，每天記錄產(chǎn)蛋數(shù)、蛋重，每10 d結(jié)料一次；120 d后，以組內(nèi)重復(fù)為單位，計(jì)算產(chǎn)蛋率、日采食量、日產(chǎn)蛋量和蛋料比.

1.6.2蛋品質(zhì)的測(cè)定試驗(yàn)期以組內(nèi)重復(fù)為單位，每周隨機(jī)采集雞蛋1枚，即整個(gè)試驗(yàn)期每個(gè)重復(fù)共采集17枚雞蛋，采用EMT5200多功能蛋品質(zhì)測(cè)定儀(日本Robotmation公司)測(cè)定蛋白高度，采用EFG0503全自動(dòng)蛋殼強(qiáng)度測(cè)量儀測(cè)定蛋殼強(qiáng)度，采用ETG1061全自動(dòng)蛋殼厚度測(cè)量儀測(cè)定蛋殼厚度.

1.6.3蛋組分的測(cè)定試驗(yàn)期以組內(nèi)重復(fù)為單位，每周隨機(jī)采集雞蛋1枚，每個(gè)重復(fù)共采集17枚雞蛋，分別稱重，分離蛋清、蛋黃和蛋殼并分別稱重，計(jì)算各組分所占全蛋的比例.

1.6.4蛋雞體重的測(cè)定分別在預(yù)飼期結(jié)束后及120 d試驗(yàn)期后，以組內(nèi)重復(fù)為單位對(duì)蛋雞進(jìn)行活體稱重并計(jì)算蛋雞的體重變化.

1.7數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以4次重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示；采用SPSS V19.0對(duì)各指標(biāo)進(jìn)行方差分析并多重比較，差異顯著性以P<0.05水平為標(biāo)準(zhǔn).

2結(jié)果與分析

2.1CART dsRNA對(duì)蛋雞產(chǎn)蛋性能的影響

對(duì)各處理組蛋雞的產(chǎn)蛋性能進(jìn)行顯著性分析，結(jié)果(表1)顯示：各試驗(yàn)組之間以及與對(duì)照組之間在產(chǎn)蛋率上均存在差異(P<0.05)，C組的產(chǎn)蛋率最高，E組最低，且低于對(duì)照組；B組的日產(chǎn)蛋量與對(duì)照組之間不存在顯著差異，其他試驗(yàn)組與對(duì)照組均存在差異(P<0.05)，C組最高，E組低于對(duì)照組；各試驗(yàn)組的日采食量均高于對(duì)照組(P<0.05)，且隨著CART dsRNA注射頻率的增加，日采食量呈上升的趨勢(shì)；從蛋料比來看，B、C組與對(duì)照組的差異不顯著，D組與E組的差異不顯著，但均與對(duì)照組存在差異(P<0.05).

表1　CART dsRNA對(duì)蛋雞產(chǎn)蛋性能的影響1)

1)同列數(shù)據(jù)后附不同小寫字母者表示差異顯著(P<0.05)，附相同字母者表示差異不顯著(P>0.05).

2.2CART dsRNA對(duì)蛋品質(zhì)的影響

對(duì)各處理組的蛋品質(zhì)進(jìn)行顯著性分析，結(jié)果(表2)顯示，各試驗(yàn)組與對(duì)照組之間在蛋白高度、蛋殼強(qiáng)度和蛋殼厚度上均不存在差異(P>0.05).

2.3CART dsRNA對(duì)蛋組分的影響

對(duì)各處理組的蛋組分進(jìn)行顯著性分析，結(jié)果(表3)顯示，各試驗(yàn)組與對(duì)照組之間在蛋黃比例、蛋清比例和蛋殼比例上均不存在差異(P>0.05)，且隨著CART dsRNA注射頻率的增加，蛋組分的變化很小.

表2　CART dsRNA對(duì)蛋品質(zhì)的影響

表3　CART dsRNA對(duì)蛋組分的影響

表4　CART dsRNA對(duì)蛋雞體重的影響1)

1)同列數(shù)據(jù)后附不同小寫字母者表示差異顯著(P<0.05)，附相同字母者表示差異不顯著(P>0.05).

2.4CART dsRNA對(duì)蛋雞體重的影響

預(yù)飼期結(jié)束后對(duì)蛋雞隨機(jī)分組，因此不同處理組蛋雞試驗(yàn)前的體重不存在顯著差異(表4).試驗(yàn)結(jié)束后對(duì)各處理組蛋雞的體重進(jìn)行顯著性分析，結(jié)果(表4)顯示：B組與對(duì)照組的體重不存在差異(P>0.05)，C、D、E組之間以及與對(duì)照組、B組之間均存在差異(P<0.05)；各試驗(yàn)組與對(duì)照組之間在蛋雞體重變化上均存在差異(P<0.05)；且隨著CART dsRNA注射頻率的增加，蛋雞體重及體重變化呈明顯的上升趨勢(shì).

3討論

禽類E2的合成、分泌與哺乳動(dòng)物有所不同，禽類卵泡E2由膜細(xì)胞合成[12].前人[13-14]研究表明，雞卵泡E2通過旁分泌途徑反饋調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞分泌孕酮，并作用于卵泡調(diào)節(jié)蛋雞排卵.家禽P主要由卵泡顆粒細(xì)胞合成，在蛋雞產(chǎn)蛋期，黃體生成素和促卵泡激素協(xié)同作用于卵泡細(xì)胞，調(diào)節(jié)E2和P的合成與分泌，對(duì)促進(jìn)卵泡成熟和排卵發(fā)揮重要作用[15-16].Sen et al[3]于2008年通過研究建立了牛卵泡中CART信號(hào)傳導(dǎo)模型，其中，CART刺激并誘導(dǎo)Erk1/2激活過程中的Go/i-PKC-MEK通路，促進(jìn)促卵泡激素誘導(dǎo)的Erk1/2和Akt信號(hào)終止；同時(shí)，CART信號(hào)通路及表達(dá)量的改變對(duì)芳構(gòu)化酶CYP19A1基因的表達(dá)也產(chǎn)生影響，進(jìn)一步影響了P的合成與分泌.在前期研究中，已經(jīng)通過蛋雞CARTmRNA序列設(shè)計(jì)了高特異性dsRNA，證明其對(duì)海蘭褐蛋雞卵泡E2和P的分泌產(chǎn)生不同程度的影響[6].因此，本試驗(yàn)的設(shè)計(jì)目的在于初步研究體外注射CART dsRNA對(duì)蛋雞產(chǎn)蛋性能和蛋品質(zhì)的影響.

本試驗(yàn)結(jié)果表明，CART dsRNA注射頻率對(duì)海蘭褐蛋雞蛋品質(zhì)和蛋組分的影響不顯著，對(duì)產(chǎn)蛋性能和體重變化影響顯著.試驗(yàn)期每40 d注射一次CART dsRNA(C組)，蛋雞的產(chǎn)蛋率最高，為86.77%；從蛋雞的體重變化來看，隨著CART dsRNA注射頻率的增大，蛋雞體重變化明顯增大(P<0.05).

CART dsRNA在引發(fā)真核細(xì)胞中同源序列基因表達(dá)干擾時(shí)，具有高度特異性和高效性，不同處理組之間蛋雞產(chǎn)蛋性能和體重產(chǎn)生顯著差異的原因，可能是由CART dsRNA作用于真核細(xì)胞發(fā)揮干擾作用的另一個(gè)特性——可傳播性造成的，即CART dsRNA局部注射可對(duì)動(dòng)物整個(gè)機(jī)體產(chǎn)生影響.研究表明，CART參與調(diào)節(jié)下丘腦—垂體—腎上腺軸進(jìn)而調(diào)控動(dòng)物攝食行為[17]，同時(shí)，體內(nèi)催產(chǎn)素水平暫時(shí)性升高，皮質(zhì)酮和血糖水平顯著升高[18]，動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)熱增加[19].動(dòng)物采食量與血糖濃度呈負(fù)相關(guān)，而機(jī)體細(xì)胞吸收率是體內(nèi)血糖濃度變化的標(biāo)識(shí)[20].活體試驗(yàn)表明，對(duì)大鼠中樞灌注CART后，動(dòng)物采食量和體重均會(huì)下降，并伴隨血糖濃度上升和胰島素水平下降，CART可能通過調(diào)節(jié)胰島素水平影響血糖濃度進(jìn)而調(diào)節(jié)動(dòng)物采食量[21].瘦素和神經(jīng)肽Y是動(dòng)物食欲調(diào)節(jié)的主要因子，而弓狀核可以合成CART、神經(jīng)肽Y、阿黑皮素原和刺鼠相關(guān)蛋白，研究表明，與攝食抑制相關(guān)的所有神經(jīng)肽通過與神經(jīng)肽Y相互作用均會(huì)影響動(dòng)物食欲[22-23].位于人體8號(hào)染色體5q13-14的CART基因是肥胖病的一個(gè)易感位點(diǎn)，研究發(fā)現(xiàn)，小鼠CART基因缺失或發(fā)生突變后，極容易出現(xiàn)肥胖癥[24].總之，當(dāng)與攝食相關(guān)的中樞系統(tǒng)功能發(fā)生異常時(shí)，機(jī)體將對(duì)調(diào)控?cái)z食的激素變化出現(xiàn)相應(yīng)的調(diào)節(jié)反應(yīng)，引起食欲與機(jī)體能量需求狀況的不平衡[25].本試驗(yàn)結(jié)果也表明：隨著CART dsRNA注射間隔時(shí)間的縮短，蛋雞體重及體重變化顯著增加，這可能是由于CART dsRNA不僅抑制了卵泡CART的表達(dá)，同時(shí)對(duì)下丘腦弓狀核CART的表達(dá)也產(chǎn)生抑制，造成與攝食相關(guān)的中樞系統(tǒng)功能發(fā)生異常，從而引起蛋雞采食量及體重顯著增加(P<0.05)；同時(shí)，dsRNA干擾CART表達(dá)的變化，進(jìn)一步引起了下丘腦—垂體—腎上腺軸調(diào)節(jié)水平發(fā)生變化，對(duì)蛋雞體內(nèi)相關(guān)激素的分泌量產(chǎn)生影響，導(dǎo)致CART dsRNA注射間隔時(shí)間不同也會(huì)造成蛋雞的產(chǎn)蛋性能出現(xiàn)差異(P<0.05)，使得CART dsRNA在試驗(yàn)中的高特異性和高效性未能得到驗(yàn)證.此外，在試驗(yàn)過程中，由于體外注射CART dsRNA對(duì)蛋雞產(chǎn)生的應(yīng)激較大，合理的CART dsRNA給藥方法、注射間隔時(shí)間及對(duì)蛋雞全身性的影響還有待進(jìn)一步研究.

4結(jié)論

CART dsRNA對(duì)海蘭褐蛋雞的產(chǎn)蛋性能和體重變化具有顯著影響，初步確定每40 d注射一次CART dsRNA有利于提高雞場(chǎng)經(jīng)濟(jì)效益；CART dsRNA對(duì)蛋品質(zhì)和蛋組分沒有顯著影響.

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(責(zé)任編輯:施曉棠)

收稿日期：2016-01-01修回日期：2016-03-03

基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31172211)；農(nóng)業(yè)部“948”項(xiàng)目(2010-Z43)；山西省橫向協(xié)作與委托項(xiàng)目(2010HX54)；山西省回國留學(xué)人員科研項(xiàng)目(2014-重點(diǎn)5)；山西省科技攻關(guān)項(xiàng)目(20130311027-2)；山西省人事廳人才引進(jìn)項(xiàng)目；山西農(nóng)業(yè)大學(xué)引進(jìn)人才博士科研啟動(dòng)費(fèi)(2014ZZ04) ；山西農(nóng)業(yè)大學(xué)科研管理費(fèi)資助重大項(xiàng)目和標(biāo)志性成果培育項(xiàng)目(71060003).

作者簡介:李鵬飛(1978-)，男，副教授，博士.研究方向：動(dòng)物生殖生理.Email：adamlpf@126.com.通訊作者呂麗華(1969-)，女，教授，博士.研究方向：動(dòng)物繁殖生物技術(shù).Email：lihualvsxau@126.com.

中圖分類號(hào):S831.2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

文章編號(hào):1671-5470(2016)04-0434-05

DOI:10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2016.04.011

Effects of exogenous injection specificity dsRNA of CART on production performance and egg quality for laying hen

LI Pengfei1, JING Jiongjie2, BI Xilin2, WANG Kai2, ZHANG Zining2, Lü Lihua2

(1.College of Life Science; 2.College of Animal Science and Technology,Shanxi Agricultural University, Taigu, Shanxi 030801, China)

Abstract:To investigate the effect of cocaine-and amphetamine-regulated transcript (CART) on production performance and egg quality of laying hen in laying period, 500 20-week-old healthy highland brown laying hens were randomized into 5 groups with 4 replications per group. Four treatments, which included no injection as the control (group A), and injections with CART specificity of double-stranded RNA (dsRNA) on the 1st day (group B), every 40 d (group C), every 20 d (group D) and every 10 d (group E), were applied after hens were fed for 30 d. Egg production performance, including egg quantity, quality, and composition, and body weight of hens were measured after 120-day treatment. Results showed that body weight and laying rate varied significantly among treatment groups (P<0.05). All injected groups differed significantly from the control in average daily egg production (P<0.05), except that no difference existed between group B and the control. Feed intakes of all injected groups were significantly higher than the control (P<0.05), however, they were the same statistically among all injected groups. With regard to egg-feed ratio, all injected groups differed from the control (P<0.05), however, no difference existed among groups A, B and C, and between groups D and E. In a word, CART dsRNA exerts significant impacts on laying performance and body weight of laying hens but not on egg quality and components.

Key words:laying hen; double-stranded RNA (dsRNA); cocaine-and amphetamine-regulated transcript (CART); egg laying performance; egg quality