含F(xiàn)MDV中和表位的重組病毒顆粒的構(gòu)建及鑒定

苗巍男，李　瑞，鐘　江，鄭兆鑫，劉明秋

(復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，上海 200438)

?

含F(xiàn)MDV中和表位的重組病毒顆粒的構(gòu)建及鑒定

苗巍男，李瑞，鐘江，鄭兆鑫，劉明秋

(復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，上海 200438)

摘要：針對(duì)FMDV的疫苗研究一直是防控口蹄疫的重點(diǎn)，而病毒樣顆粒(VLPs)形式的疫苗因其安全性和近似傳統(tǒng)滅活疫苗的良好免疫效果，近年來逐漸成為疫苗研究的一個(gè)新方向.本實(shí)驗(yàn)利用豬圓環(huán)病毒PCV2的衣殼蛋白(CAP)作為載體，分別插入FMDV MYA98毒株的抗原表位組合——VP1蛋白上B細(xì)胞表位141～160aa(B)與串聯(lián)的B細(xì)胞和T細(xì)胞表位141～160aa-21～40aa-141～160aa(BTB)，構(gòu)建對(duì)應(yīng)重組桿狀病毒，分別命名為reBAC-CAP-B，reBAC-CAP-BTB.將上述病毒顆粒轉(zhuǎn)入Sf9細(xì)胞表達(dá)，收獲重組桿狀病毒并再次感染Sf9細(xì)胞擴(kuò)大病毒滴度，獲得目的蛋白CAP-B，CAP-BTB，經(jīng)過SDS-PAGE，Western blot鑒定正確，透射電鏡觀察到20～30 nm大小的目的顆粒.

關(guān)鍵詞:口蹄疫病毒； 豬圓環(huán)病毒； 病毒樣顆粒； 抗原表位； 桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)

口蹄疫(Foot-and-Mouth Disease， FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-Mouth Disease Virus， FMDV)引起的一種偶蹄類動(dòng)物所患的急性、熱性、高度接觸性傳染病[1].FMDV屬于小RNA病毒科(Picornaviridae)，口蹄疫病毒屬(Aphthovirus)，是最小的動(dòng)物病毒之一.按血清學(xué)分類，口蹄疫病毒目前可以分為7種血清型： O、A、C型(歐洲型)，SAT1、2、3型(非洲型)，AsiaⅠ型(亞洲型)；每種血清型內(nèi)又包含許多亞型[2].不同血清型間不能交叉保護(hù)，同一種血清型中不同亞型也有變化，不一定能交叉保護(hù).由于該病傳播途徑多，傳染速度快，并且病毒易變異，已被國(guó)際獸醫(yī)局(OIE)列為A類傳染病之首[3]；許多國(guó)家盡管投入了大量的人力、物力和財(cái)力進(jìn)行預(yù)防和控制，然而該病仍在流行；因此針對(duì)口蹄疫預(yù)防及治療的研究一直是一個(gè)熱點(diǎn).在我國(guó)主要流行的血清型之一是O型FMDV，其中近年來廣泛爆發(fā)的是MYA98亞型毒株[4].

疫苗免疫是預(yù)防FMDV爆發(fā)的重要手段之一，可以在疾病暴發(fā)時(shí)快速誘導(dǎo)免疫動(dòng)物產(chǎn)生中和抗體，從而保護(hù)動(dòng)物免于病毒感染[5].傳統(tǒng)疫苗為滅活疫苗，具有免疫原性高，生產(chǎn)、儲(chǔ)存、運(yùn)輸方便等優(yōu)點(diǎn)，但是滅活不徹底則容易造成散毒，制作過程需要很高的防護(hù)措施以防病毒泄露是滅活疫苗的重大缺點(diǎn)[6].近年來隨著基因工程和蛋白質(zhì)工程技術(shù)的不斷發(fā)展，逐漸衍生出基因工程亞單位疫苗、合成肽疫苗、活載體疫苗、核酸疫苗等新疫苗種類.

其中病毒樣顆粒(Virus-Like Particles， VLPs)是一種新興的具有巨大潛力的疫苗形式.病毒樣顆粒即含有一種或多種病毒結(jié)構(gòu)蛋白的空心顆粒，它具有和野生病毒相似的顆粒結(jié)構(gòu)和抗原性，但不含相關(guān)病毒基因[7].VLPs具有安全性高(不含病毒核酸)、免疫原性高、結(jié)構(gòu)利于抗原呈遞、穩(wěn)定性好、能作為載體插入外源片段、可以用來區(qū)分免疫動(dòng)物和感染動(dòng)物等優(yōu)點(diǎn)[8].目前已有多種公司研發(fā)的VLPs形式的疫苗上市銷售.VLPs作為疫苗的潛力已被各項(xiàng)研究充分地證明，并且仍擁有著廣闊的發(fā)展前景和巨大的潛力，在基礎(chǔ)研究中也充滿著潛力，為科學(xué)研究開辟了新的探索領(lǐng)域[9-10].

豬圓環(huán)病毒(Procine CircoVirus， PCV)屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬成員，是迄今為止已知最小的動(dòng)物病毒[11]，該病毒顆粒無囊膜，呈二十面體結(jié)構(gòu).其ORF2編碼的CAP蛋白是病毒最主要的結(jié)構(gòu)蛋白和免疫原[12]，CAP蛋白C端含有較多的轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)，位于病毒顆粒表面，因此也是優(yōu)勢(shì)抗原表位所在[13].單獨(dú)CAP蛋白已被證明能組裝成病毒顆粒，且能插入外源片段表達(dá)，并具有生物活性[14-15]，插入的外源片段最大約為20aa左右.

本實(shí)驗(yàn)采用PCV2的外殼蛋白CAP作為載體，在C端插入兩種不同的FMDV中和表位組合-MYA98亞型VP1蛋白上B細(xì)胞表位141～160aa(B)與串聯(lián)的B細(xì)胞和T細(xì)胞表位141～160aa-21～40aa-141～160aa(BTB)，將構(gòu)建的重組桿狀病毒在草地夜蛾Sf9細(xì)胞系內(nèi)擴(kuò)增并驗(yàn)證了CAP蛋白C端所能容納的外源片段大小，期望為進(jìn)一步構(gòu)建含有FMDV表位的VLPs疫苗奠定基礎(chǔ).

1材料和方法

1.1材料

1.1.1菌株、細(xì)胞與質(zhì)粒

大腸桿菌菌株E.coliDH5α由本實(shí)驗(yàn)室保存；草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)卵巢細(xì)胞Sf9，大腸桿菌E.coliDH10Bac，pFastBac-1載體由復(fù)旦大學(xué)鐘江教授提供.

1.1.2主要試劑

限制性內(nèi)切酶，T4 DNA連接酶體系購自New England Biolabs公司；pMD-18T試劑盒購自TaKaRa公司；PCR體系(pfu酶，taq酶，PCR buffer，dNTPs等)購自北京天根生化科技有限公司；質(zhì)粒小量抽提試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒均購自Axygen公司；TNM-FH培養(yǎng)基購自Sigma公司；胎牛血清購自Thermo Fisher公司；Cellfectin Ⅱ轉(zhuǎn)染試劑，購自Invitrogen公司；豚鼠抗FMDV MYA亞型血清來自內(nèi)蒙古金宇保靈生物藥品有限公司；辣根過氧化物酶(Horseradish Peroxidase， HRP)偶聯(lián)羊抗豚鼠抗體購自proteintech公司；ECL化學(xué)發(fā)光顯色試劑盒購自GE公司.

表1　實(shí)驗(yàn)中使用的引物序列

注： 劃線部分為酶切位點(diǎn).

1.1.3引物和序列

FMDV O型毒株O/BY/CHA/2010(MYA98亞型)VP1上的21～40aa和141～160aa的核苷酸序列(GenBank： JN998085.1)由上海捷瑞生物工程有限公司經(jīng)由昆蟲細(xì)胞密碼子優(yōu)化后合成，命名為BTB；PCV2 CAP基因(GenBank： ACZ06084.1)由上海農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所易建中老師提供；實(shí)驗(yàn)過程所用引物由上海賽百盛基因技術(shù)有限公司合成，見表1.

1.2方法

1.2.1CAP-B和CAP-BTB基因的克隆

分別從公司合成的含有BTB基因的載體和含有CAP基因的載體上擴(kuò)增出BTB和CAP基因(使用的引物分別為btb-F/btb-R和cap-F/cap-R)，然后通過重疊PCR(合成的BTB基因N端含有CAP基因C端一部分序列)獲得CAP-BTB序列(使用的引物為cap-F/btb-R)，測(cè)序確認(rèn).再利用cap-F/b-R引物從測(cè)序正確的CAP-BTB序列上擴(kuò)增出CAP-B序列，測(cè)序確認(rèn)后分別保存.

1.2.2質(zhì)粒pFB-CAP-B和pFB-CAP-BTB的構(gòu)建

將CAP-B基因和pFastBac1載體分別用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切，回收后進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入感受態(tài)E.coliDH5α后，挑取陽性克隆測(cè)序確認(rèn)，抽取質(zhì)粒并命名為pFB-CAP-B；同樣方法獲得pFB-CAP-BTB.

1.2.3重組桿狀病毒質(zhì)粒reBAC-CAP-B和reBAC-CAP-BTB的獲得

分別將質(zhì)粒pFB-CAP-B和pFB-CAP-BTB轉(zhuǎn)化入E.coliDH10 Bac感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，借由質(zhì)粒上的Tn5轉(zhuǎn)座單位和細(xì)胞內(nèi)輔助質(zhì)粒的功能將目的基因轉(zhuǎn)座到桿狀病毒載體Bacmid上.經(jīng)由抗生素(卡那霉素，四環(huán)素，慶大霉素)和藍(lán)白斑篩選后，提取重組桿狀病毒質(zhì)粒，分別利用目的基因的特異性引物和載體上的M13通用引物進(jìn)行PCR鑒定，分別命名為reBAC-CAP-B和reBAC-CAP-BTB.

1.2.4重組病毒樣顆粒的表達(dá)

將2種重組桿狀病毒質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至對(duì)數(shù)期Sf9昆蟲細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變時(shí)，收獲培養(yǎng)基上清，500g離心5～10min收取上清，即為P1代毒株；再用P1代毒株感染細(xì)胞獲得滴度較高的P2代毒株；P2代毒株再次感染細(xì)胞(MOI=1～5)即可表達(dá)重組病毒樣顆粒，分別命名為CAP-B和CAP-BTB.

1.2.5SDS-PAGE及Western blot鑒定

用P2代感染細(xì)胞，當(dāng)有明細(xì)病變時(shí)，收獲細(xì)胞，PBS洗2次，500g離心5～10min收獲細(xì)胞沉淀，加入SDS-PAGE loading Buffer混勻后進(jìn)行SDS-PAGE驗(yàn)證.同時(shí)電轉(zhuǎn)硝酸纖維素膜進(jìn)行Western blot鑒定，用含5% 脫脂奶粉的PBST(含0.1% Tween-20的PBS)封閉液封閉2h，加入按效價(jià)稀釋的豚鼠抗FMDV MYA98亞型血清的一抗孵育1h，PBST洗3次，每次5min；加入HRP標(biāo)記的羊抗豚鼠IgG二抗孵育1h，PBST洗3次，每次5min；使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行顯色分析.

1.2.6透射電鏡觀察VLPs形態(tài)

將P2代感染后的細(xì)胞經(jīng)過超聲波破碎，離心后取沉淀樣品少許溶于PBS制成懸浮液，滴在載樣銅網(wǎng)上，使用2%的磷鎢酸負(fù)染3～5min，吸去多余液體，室溫干燥后使用透射電鏡(TEM)進(jìn)行觀察.

2結(jié)果與分析

2.1CAP，BTB及重組基因CAP-B，CAP-BTB擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定

CAP和BTB基因全長(zhǎng)分別為705bp和243bp，分別用cap-F/cap-R和btb-F/btb-R引物進(jìn)行擴(kuò)增后，瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果見圖1(a)，條帶大小均正確.CAP和BTB基因在CAP基因C端重疊21bp，利用引物cap-F/btb-R通過重疊PCR獲得CAP-BTB基因，全長(zhǎng)為930bp，再用cap-F/b-R引物從CAP-BTB基因上擴(kuò)增出CAP-B序列，全長(zhǎng)為771bp，電泳分析結(jié)果均正確(圖1(b),(c)).所有結(jié)果均測(cè)序并比對(duì)標(biāo)準(zhǔn)序列確認(rèn).

2.2重組桿狀病毒質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

挑選轉(zhuǎn)座后白斑抽取重組桿狀病毒質(zhì)粒，分別獲得reBAC-CAP-B和reBAC-CAP-BTB；分別利用M13引物(桿狀病毒質(zhì)粒上自帶引物，見圖2(a)(見第384頁))和序列對(duì)應(yīng)的特異性引物進(jìn)行PCR鑒定；M13引物PCR產(chǎn)物理論大小分別為3100bp和3200bp，特異性引物PCR產(chǎn)物結(jié)果分別為771bp和930bp，結(jié)果見圖2(b)、(c)(見第384頁)，均在目的大小位置看到對(duì)應(yīng)條帶，說明重組桿狀病毒質(zhì)粒構(gòu)建成功.

2.3重組桿狀病毒毒株的獲得

用rBAC-CAP-B和rBAC-CAP-BTB分別轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞，3～4d后細(xì)胞停止生長(zhǎng)，體積變大，內(nèi)部出現(xiàn)顆粒體(小泡)，晚期細(xì)胞脫落或破碎，大量死亡；陰性對(duì)照組細(xì)胞正常生長(zhǎng)，說明重組病毒轉(zhuǎn)染成功，見圖3(見第384頁)(結(jié)果未完全列出).待細(xì)胞大部分明顯病變后收獲病毒毒株，即P1代毒株，用于接下來的擴(kuò)增.

2.4重組病毒樣顆粒的SDS-PAGE和Western blot結(jié)果

使用P2代毒株感染細(xì)胞，收獲細(xì)胞進(jìn)行SDS-PAGE鑒定.根據(jù)軟件預(yù)測(cè)， CAP-B蛋白約為30kD，CAP-BTB約為36kD.如圖4(a)，各樣品在預(yù)計(jì)大小位置有明顯目的條帶，且陰性對(duì)照空細(xì)胞和空載體在相應(yīng)位置無明顯條帶，說明目的蛋白成功表達(dá).

使用豚鼠抗FMDV MYA98亞型血清作為一抗進(jìn)行Western blot，在CAP-B和CAP-BTB實(shí)驗(yàn)組均可以觀察到特異性條帶(圖中向下箭頭指示位置)，而陰性對(duì)照均無對(duì)應(yīng)條帶，見圖4(b).圖中除目的條帶位置處有其他條帶，是因?yàn)樗靡豢篂槎嗫乖斐傻姆翘禺愋噪s帶，沒有特異性條帶反應(yīng)強(qiáng)烈，不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)論.結(jié)果說明表達(dá)的重組病毒樣顆粒均具有良好的免疫反應(yīng)性.

2.5重組病毒樣顆粒的電鏡觀察

表達(dá)的2種重組VLPs樣品經(jīng)過磷鎢酸負(fù)染后，在透射電鏡下觀察結(jié)構(gòu).PCV2病毒顆粒大小理論上直徑為17～20nm，預(yù)估插入了外源片段后，CAP-B的大小為20～25nm，CAP-BTB大小為20～30nm.圖5中可見，觀察到的顆粒與預(yù)測(cè)大小一致，證明了重組病毒形成了VLPs結(jié)構(gòu).圖中有些較大的顆?？赡苁嵌鄠€(gè)蛋白聚在一起沒分開導(dǎo)致的，屬于正?，F(xiàn)象.

3討論

多種病毒，包括包膜病毒、無包膜病毒、人類病毒、植物病毒、動(dòng)物病毒等均已證明在各種表達(dá)系統(tǒng)中內(nèi)能正常表達(dá)并正確組裝成顆粒結(jié)構(gòu)[16-17].桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)具有安全性好、可容納的外源片段大、表達(dá)效率較高、蛋白質(zhì)翻譯后修飾與哺乳動(dòng)物細(xì)胞類似等優(yōu)點(diǎn)[18-19].Invitrogen公司的bac-to-bac系統(tǒng)就是采用這一體系的轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞重組系統(tǒng).目前已有多種利用該系統(tǒng)表達(dá)的VLPs疫苗正式上市.因此本實(shí)驗(yàn)采用昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)表達(dá)目的蛋白.

PCV2的ORF2編碼的CAP蛋白是其最主要的結(jié)構(gòu)蛋白，已被證明在不同表達(dá)體系中均能正確折疊成天然顆粒結(jié)構(gòu)，且有一定的容納外源片段(約20aa)的能力[14-15].理論上，在C端插入的序列是暴露或者部分暴露在VLPs顆粒的表面，所以對(duì)結(jié)構(gòu)的形成影響不大.目前關(guān)于FMDV的VLPs研究多使用P1-2A-3C形式構(gòu)建完整FMDV病毒顆粒，也有在其他病毒外殼蛋白插入結(jié)構(gòu)蛋白或表位的構(gòu)建方式[20-22].研究表明，F(xiàn)MDV復(fù)合多表位組合可誘導(dǎo)強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，其中VP1蛋白上的21～40aa為常見的T細(xì)胞表位[23]，141～160aa位于暴露在表面的G-H環(huán)區(qū)域，是常見的經(jīng)典B細(xì)胞表位之一[24].因此本實(shí)驗(yàn)采用在C端插入兩種不同表位組合(單表位和三表位串聯(lián))的不同方式構(gòu)建重組VLPs，成功獲得重組毒株并表達(dá)蛋白CAP-B，CAP-BTB，在預(yù)期蛋白質(zhì)大小位置分別可看到對(duì)應(yīng)的條帶，并且在使用口蹄疫病毒血清的Western blot實(shí)驗(yàn)中CAP-B，CAP-BTB都有免疫反應(yīng)，證明了表達(dá)的蛋白具有免疫反應(yīng)性.在電鏡觀察結(jié)果中看到重組VLPs均形成了顆粒狀結(jié)構(gòu)，近似天然病毒.說明重組病毒具備形成顆粒結(jié)構(gòu)的能力，PCV2 VLPs能容納長(zhǎng)達(dá)70aa的外源片段.

理論上桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)表達(dá)的外源性蛋白應(yīng)該可溶，大部分的實(shí)驗(yàn)也證明了這點(diǎn).但是本實(shí)驗(yàn)提取的重組病毒樣顆粒均不溶于緩沖溶液(PBS，TNE等溶液)中，即使在裂解細(xì)胞時(shí)采取了超聲破碎、反復(fù)凍融、細(xì)胞裂解液等辦法，但是蛋白仍然存在于裂解后離心下來的沉淀中.對(duì)重組病毒樣顆粒的等電點(diǎn)進(jìn)行分析，中和緩沖液pH有一定的差距；且重組病毒樣顆粒上無核定位和膜定位信號(hào)，因此理論上不會(huì)形成膜融合蛋白或者核內(nèi)蛋白.蛋白質(zhì)的溶解情況可能與蛋白質(zhì)本身性質(zhì)、表達(dá)量、裂解條件有一定的關(guān)系.大部分的研究本身表達(dá)的蛋白均可溶，因此對(duì)不溶的情況研究較少，楊林等在2000年對(duì)昆蟲細(xì)胞表達(dá)的GST融合蛋白的可溶性進(jìn)行了一定研究，發(fā)現(xiàn)本身不溶的蛋白在提高裂解液非離子去垢劑(如Triton-X100)濃度以及加入十二烷基肌氨酸鈉(Sarkosyl)后有約20%～30%的蛋白質(zhì)變?yōu)榭扇躘25].Crisci等在2012年利用該系統(tǒng)表達(dá)VLPs時(shí)，裂解細(xì)胞時(shí)分別加入了DNase Ⅰ和Sarkosyl處理[22]，研究本身并未提及表達(dá)的VLPs是否存在不溶的情況，但是這些處理方式為以后的實(shí)驗(yàn)改進(jìn)提供了新的方向.此外也可以考慮更換細(xì)胞系，如高表達(dá)量的High Five、哺乳動(dòng)物細(xì)胞等，或者引入引導(dǎo)序列使得蛋白質(zhì)可以分泌表達(dá)等方法.

本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了含有FMDV抗原表位的重組病毒顆粒載體，并表達(dá)了具有免疫反應(yīng)性及能夠形成顆粒結(jié)構(gòu)的重組VLPs，驗(yàn)證了PCV2 CAP蛋白在C端插入了70aa的外源片段后仍能形成VLPs，為進(jìn)一步利用該載體表達(dá)多表位抗原奠定了基礎(chǔ).雖然存在著蛋白質(zhì)不可溶的問題，但可以考慮直接加入佐劑進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)檢測(cè)免疫效果，同時(shí)嘗試著更換條件以期望得到可溶的蛋白質(zhì).

參考文獻(xiàn)：

[1]MARVIN J G, BARRY B. Foot-and-mouth disease [J].ClinMicrobiolRev, 2004，17(2)： 465-493．

[2]雷連成,陳偉.家畜口蹄疫研究進(jìn)展 [J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2001,23(4)： 77-80．

[3]殷震，劉景華．動(dòng)物病毒學(xué) [M].北京： 科學(xué)出版社，1985： 395-414．

[4]PATON D J, KING D P, KNOWLES N J,etal. Recent spread of foot-and-mouth disease in the Far East [J].VetRec, 2010,166(18)： 569-570．

[5]FRENKEL H S. Research on foot-and-mouth disease. Ⅱ. The cultivation of the virus on a practical scale in explantation bovine tongue epithelium [J].AmJVetRes, 1951,17(3)： 224-228．

[6]DOEL T R. FMD vaccines [J].VirusRes, 2003,91(1)： 81-99．

[7]JOHNSON J E, CHIU W. Structures of virus and virus-like particles [J].CurrOpinStructBiol, 2000,10(2)： 229-235．

[9]HAO X, SHANG X, WU J,etal. Single-particle tracking of hepatitis B virus-like vesicle entry into cells [J].Small, 2011,7(9)： 1212-1218．

[10]KACZMARCZYK S J, SITARAMAN K, YOUNG H A,etal. Protein delivery using engineered virus- like particles [J].ProcNatlAcadSciUSA, 2011,108(41)： 16998-17003．

[11]TISCHER I, RASCH R, TOCHTERMANN G. Characterization of papovavirus and picornavirus-like particles in permanent pig kidney cell lines [J].Eentralbb,BakteriolOrigA, 1974,226(2)： 153-167．

[12]NAWAGITGUL P, MOROZOV I, BOLIN S,etal. Open reading frame 2 of porcine circovirus type 2 encodes a major capsid protein [J].JGenVirol, 2000,81(1): 2281-2287．

[13]NAWAGITGUL P, HARMS P A, THAEKER B J,etal. Modified indicret Porcine circovirus(PCV) type2 based and recombinant capsid protein (ORF2)- based enzyme linked immunosorbent assays for detection of antibodies to PCV [J].ClinDiagnLabImmunol, 2002,9(1)： 33-40．

[14]BEACH N M, MENG X. Efficacy and future prospects of commercially available and experimental vaccines against porcine circovirus type 2(PCV2) [J].VirusResearch, 2012,164(1/2)： 33-42.

[15]LI W, WANG X, BAI J,etal. Construction and immunogenicity of recombinant porcine circovirus-like particles displaying somatostatin [J].VeterinaryMicrobiology, 2013,163(1/2)： 23-32.

[16]KUSHNIR N, STREATFIELD S J, YUSIBOV V. Virus-like particles as a highly efficient vaccine platform： Diversity of targets and production systems and advances in clinical development [J].Vaccine, 2012,31(1)： 58-83.

[17]GRGACIC E V, ANDERSON D A. Virus-like particles： Passport to immune recongnition [J].Methods, 2006,40(1)： 60-65.

[18]MENA J A, KAMEN A A. Insect cell technology is a versatile and robust vaccine manufacturing platform [J].ExpertReviewofVaccines, 2011,10(7)： 1063-1081.

[19]LIU F, WU X, LI L,etal. Use of baculovirus expression system for generation of virus-like particles： Successes and challenges [J].ProteinExpressionandPurification, 2013,90(2)： 104-116.

[20]GUO H C, SUN S Q, JIN Y,etal. Foot-and-mouth disease virus-like particles produced by a SUMO fusion protein system in Escherichia coli induce potent protective immune responses in guinea pigs, swine and cattle [J].VetRes, 2013,44(1)： 48-60.

[21]SUBRAMANIAN B M, MADHANMOHAN M, SRIRAMAN R,etal. Development of foot-and- mouth disease virus(FMDV) serotype O virus-like-particles(VLPs) vaccine and evaluation of its potency [J].AntiviralResearch, 2012,96(3)： 288-295.

[22]CRISCI E, FRAILE L, MORENO N,etal. Chimeric calicivirus-like particles elicit specific immune responses in pigs [J].Vaccine, 2012,30(14)： 2427-2439.

[23]張中旺,張永光.抗原表位的研究方法及口蹄疫病毒抗原表位的研究進(jìn)展 [J].微生物學(xué)通報(bào),2008,35(8)： 1302-1310.

[24]PFAFF E, MUSSGAY M, BOHM H O,etal. Antibodies against a preselected peptide recognize and neutralize foot and mouth disease virus [J].EMBOJ, 1982,1(7)： 869-874．

[25]楊林,李國(guó)清,黃葆英,等.GST融合蛋白在桿狀病毒系統(tǒng)中表達(dá)的可溶性研究 [J].中國(guó)病毒學(xué),2000，15(2)： 48-53.

文章編號(hào)：0427-7104(2016)03-0381-07

收稿日期：2015-07-28

基金項(xiàng)目：教育部留學(xué)回國(guó)人員科研啟動(dòng)基金；上海市科學(xué)技術(shù)委員會(huì)項(xiàng)目(13DZ2252000)

作者簡(jiǎn)介：苗巍男(1992—)，男，碩士研究生；劉明秋，女，副教授，通訊聯(lián)系人，E-mail： liumq@fudan.edu.cn.

中圖分類號(hào)：Q 78

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Construction and Identification of Recombinant Virus-like Particles Fused with Neutralizing Epitopes of FMDV

MIAO Weinan， LI Rui， ZHONG Jiang， ZHENG Zhaoxin， LIU Mingqiu

(SchoolofLifeSciences,FudanUniversity,Shanghai200438,China)

Abstract：The study on vaccine of FMDV is always a hot spot in world. Recent years, VLPs became a new direction of vaccine study, for its safety and good ability of protection against virus compared to traditional vaccines. Two kinds of neutralizing epitopes of type O FMDV MYA98, single B antigen epitope on VP1 141—160 aa(B) and the combination of B antigen epitope and T antigen epitope 141—160 aa-21—40 aa-141—160 aa(BTB) epitopes, were inserted into CAP vector protein from PCV2 to construct the recombined Bacmids reBAC-CAP-B, reBAC-CAP-BTB. These recombined Bacmids were transfected into Sf9 cells to express fusion proteins CAP-B，CAP-BTB respectively. After amplifying the viral stock, the high-titer stock was infected to cells for protein expression. The results of SDS-PAGE, Western blot and TEM showed that the proteins with the right molecule size had the specific immunogenicity and were assembled into VLPs successfully.

Keywords：FMDV; PCV; VLPs; antigen epitope; baculovirus-insect cell expression system