斑馬魚性腺組織的原代細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的建立

董丹丹， 孫燕俠， 郭華榮

(中國(guó)海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院，山東青島 266003)

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斑馬魚性腺組織的原代細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的建立

董丹丹， 孫燕俠， 郭華榮*

(中國(guó)海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院，山東青島 266003)

摘要[目的]建立斑馬魚卵巢和精巢組織的原代細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，獲得原代和傳代培養(yǎng)細(xì)胞單層。[方法]采用組織塊貼壁法進(jìn)行斑馬魚卵巢和精巢組織的原代細(xì)胞培養(yǎng)，采用0.25%胰蛋白酶消化法進(jìn)行傳代培養(yǎng)。[結(jié)果]斑馬魚性腺組織的原代細(xì)胞培養(yǎng)條件為：最適培養(yǎng)基為DMEM/F12(pH 7.0～7.2)，培養(yǎng)溫度為24 ℃，在添加20 ng/mL 表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、20 ng/mL 堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、0.5 mmol/L β-巰基乙醇和15%胎牛血清時(shí)更有利于細(xì)胞的存活。其中，卵巢的組織塊接種3～4 d后，上皮樣細(xì)胞首先開始遷出，遷出的上皮樣細(xì)胞生長(zhǎng)5 d后，逐漸凋亡；此后，成纖維樣細(xì)胞和另一種上皮樣細(xì)胞開始大量遷出， 10 d后可生長(zhǎng)匯合成80%的原代細(xì)胞單層；可成功傳代培養(yǎng)1次，但傳代后的上皮樣細(xì)胞不貼壁，很快死亡,而傳代后的成纖維樣細(xì)胞可貼壁生長(zhǎng)，但基本不分裂，健康存活7 d后開始逐漸凋亡。精巢組織接種5 d后，上皮樣細(xì)胞和成纖維樣細(xì)胞同時(shí)開始遷出，培養(yǎng)16 d后逐漸凋亡，僅得到60%原代培養(yǎng)細(xì)胞單層。[結(jié)論]初步建立了斑馬魚性腺組織的原代細(xì)胞培養(yǎng)條件，并將卵巢組織塊遷出的成纖維樣細(xì)胞成功傳代1次。

關(guān)鍵詞斑馬魚；性腺組織；原代細(xì)胞培養(yǎng)；傳代培養(yǎng)

斑馬魚是原產(chǎn)于印度和巴基斯坦淡水河流中的一種熱帶硬骨魚，具有易于飼養(yǎng)、繁殖周期短、多次產(chǎn)卵和胚胎透明等優(yōu)點(diǎn)，是功能基因組時(shí)代生命科學(xué)研究中最重要的一種水生模式脊椎動(dòng)物[1-2]。斑馬魚作為研究模型，可用于揭示胚胎和組織器官發(fā)育的分子機(jī)理，研究和解決環(huán)境科學(xué)中的重大問題。近年來(lái)，由于環(huán)境中內(nèi)分泌干擾物含量的持續(xù)增加，導(dǎo)致許多魚類發(fā)生性逆轉(zhuǎn)。因此，斑馬魚常被用于研究魚類的性別分化與決定以及環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的毒性機(jī)制等[3]，然而這些研究主要是基于對(duì)斑馬魚發(fā)育過(guò)程異常的觀察，過(guò)程相對(duì)繁瑣，重復(fù)性差。體外培養(yǎng)的斑馬魚細(xì)胞系可為此研究提供更簡(jiǎn)便的試驗(yàn)材料和手段，簡(jiǎn)化研究過(guò)程，試驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性好。

目前，斑馬魚的肝臟細(xì)胞系[4]、胚胎細(xì)胞系[5]和脾臟細(xì)胞系[6]已成功建立，但關(guān)于建立斑馬魚性腺細(xì)胞系的研究則鮮見報(bào)道。筆者建立和優(yōu)化斑馬魚生殖腺組織包括卵巢和精巢的原代和傳代細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，旨在為今后斑馬魚性腺細(xì)胞系的建立與應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)魚4～5月齡的性成熟斑馬魚(Daniorerio)，體長(zhǎng)約3 cm，購(gòu)自青島市南山水產(chǎn)品市場(chǎng)，雌雄分開后，分別于15 L的玻璃缸中充氣暫養(yǎng)至少7 d，光照周期為14 h L/10 h D，水溫為25 ℃。1.2試劑胰蛋白酶(1∶250)，為Wolsen公司產(chǎn)品；表皮生長(zhǎng)因子(EGF)和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)均為北京義翹神州公司產(chǎn)品；基礎(chǔ)培養(yǎng)基L-15和DMEM均為Gibco公司產(chǎn)品；基礎(chǔ)培養(yǎng)基DMEM/F12和胎牛血清(FBS)均為Hyclone公司產(chǎn)品；其他藥品均為分析純。

PBS配方為：8 g/L NaCl、0.2 g/L KCl、3 g/L Na2HPO4·12H2O、0.2 g KH2PO4。

完全培養(yǎng)基配方為：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入10%～20%FBS、20 ng/mL EGF、20 ng/mL bFGF、0.5 mmol/L β-巰基乙醇(β-ME)、100 IU/mL青霉素和100 μg/mL硫酸鏈霉素。

1.3原代培養(yǎng)方法取健康斑馬魚置于煮沸消毒的自來(lái)水中暫養(yǎng)4 h后，轉(zhuǎn)移至含1 000 IU/mL青霉素和1 000 μg/mL硫酸鏈霉素的煮沸消毒自來(lái)水中繼續(xù)暫養(yǎng)12～16 h。撈出斑馬魚后，用0.2%碘伏溶液擦拭消毒斑馬魚全身，尤其是腹部，然后，將其置于75%酒精中浸泡30 s。然后，于超凈工作臺(tái)內(nèi)無(wú)菌取出卵巢或精巢組織，并將性腺組織在75%酒精中快速漂洗一下，然后轉(zhuǎn)移至含200 IU/mL青霉素和200 μg/mL硫酸鏈霉素的PBS緩沖液和基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別漂洗至少2遍，最后置于含10%FBS、100 IU/mL青霉素和100 μg/mL硫酸鏈霉素的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中暫存。

當(dāng)所有卵巢或精巢組織取完后，分別剪碎成約1 mm×1 mm×1 mm的組織小塊，漂洗干凈后，均勻接種于25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶(Corning公司)中，分別于20～28 ℃培養(yǎng)箱中密閉薄層培養(yǎng)18 h，然后加入3 mL含有10%～20%FBS、20 ng/mL EGF、 20 ng/mL bFGF、0.5 mmol/L β-ME、100 IU/mL青霉素和100 μg/mL硫酸鏈霉素的完全培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，隔天補(bǔ)加至5 mL，此后每隔3～4 d更換50%培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。每天于倒置顯微鏡(Nikon)下觀察和記錄細(xì)胞的遷出和生長(zhǎng)狀況。

1.4傳代培養(yǎng)方法吸出舊培養(yǎng)基，然后用PE(含0.02% EDTA的PBS)緩沖液洗滌細(xì)胞，待細(xì)胞有收縮趨勢(shì)時(shí)去除PE緩沖液，加入300 μL 0.25%的胰蛋白酶溶液消化至細(xì)胞開始脫落，立即加入完全培養(yǎng)基終止消化，用移液管吹打6～8次，然后將細(xì)胞懸液離心洗滌1次(800 r/min，離心3 min)，最后加入5 mL完全培養(yǎng)基重懸，平均接種到2個(gè)25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，并補(bǔ)加培養(yǎng)基至5 mL，最適溫度下繼續(xù)培養(yǎng)。

1.5最適培養(yǎng)條件的篩選

1.5.1最適培養(yǎng)基的篩選。比較和觀察卵巢組織小塊在3 種不同培養(yǎng)基(1.5×L-15、DMEM 和DMEM/F12 培養(yǎng)基)(pH 7.0～7.2)中的細(xì)胞遷出和增殖情況。以上3種基礎(chǔ)培養(yǎng)基中均分別添加10%FBS、20 ng/mL EGF、 20 ng/mL bFGF、0.5 mmol/L β-巰基乙醇、100 IU/mL青霉素和100 μg/mL硫酸鏈霉素。分別于24 ℃下進(jìn)行原代培養(yǎng)，以確定最適培養(yǎng)基。

1.5.2最適血清濃度的篩選。以最適培養(yǎng)基(DMEM/F12)為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，于24 ℃下觀察卵巢或精巢組織小塊在3種血清濃度(10%、15%和20% FBS)的完全培養(yǎng)基中的細(xì)胞遷出和增殖情況，確定最適血清濃度。完全培養(yǎng)基中的其他添加成分相同，為20 ng/mL EGF、 20 ng/mL bFGF、0.5 mmol/L β-巰基乙醇、100 IU/mL青霉素和100 μg/mL硫酸鏈霉素。

1.5.3最適培養(yǎng)溫度的篩選。以最適培養(yǎng)基(DMEM/F12)為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，以添加最適濃度的FBS(15%)、20 ng/mL EGF、 20 ng/mL bFGF、0.5 mmol/L β-巰基乙醇、100 IU/mL青霉素和100 μg/mL硫酸鏈霉素的完全培養(yǎng)基，比較和觀察卵巢或精巢組織小塊在3種溫度(20、24和28 ℃) 下的細(xì)胞遷出和增殖情況，確定最適培養(yǎng)溫度。

2結(jié)果與分析

2.1斑馬魚卵巢組織的原代細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果由表1可知，在選用的3種基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，1.5×L-15和DMEM培養(yǎng)基所培養(yǎng)的卵巢組織塊的貼壁率和形成細(xì)胞單層的能力均明顯低于DMEM/F12培養(yǎng)基，且細(xì)胞于接種5 d后才開始從組織塊中遷出；DMEM/F12培養(yǎng)基所培養(yǎng)的組織塊的貼壁率高達(dá)80%，接種3 d后即可見到細(xì)胞遷出。因此，DMEM/F12培養(yǎng)基更適于斑馬魚卵巢組織的原代細(xì)胞培養(yǎng)。

由表2可知，斑馬魚卵巢組織分別于含3種不同血清濃度(10%、15%和20% FBS)的DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)。當(dāng)血清添加濃度為15% 時(shí)，組織塊的貼壁率和形成細(xì)胞單層的能力最高。因此，DMEM/F12培養(yǎng)基的最適血清濃度為15%。

表1斑馬魚卵巢組織原代細(xì)胞培養(yǎng)中最適培養(yǎng)基的篩選

Table 1Screening results of the optimal medium for primary cell culture of the ovary tissues of zebrafish

基礎(chǔ)培養(yǎng)基Basicmedium組織塊貼壁率Tissuepiecerate∥%細(xì)胞遷出時(shí)間Cellmigrationtime∥d形成細(xì)胞單層的能力Theabilitytoformamonolayerofcells1.5×L-15205+DMEM405+DMEM/F12803+++

注：“+” 表示少量組織塊有細(xì)胞遷出，細(xì)胞鋪板率約25%；“++” 表示很多組織有細(xì)胞遷出，細(xì)胞鋪板率約50%；“+++” 表示較多組織有細(xì)胞遷出，細(xì)胞鋪板率約75%。

Note: “+” indicated a small amount of tissue blocks have cells to move out,cells plating efficiency rate was 25%; “++” indicated that many tissues have cells to move out,cells plating efficiency rate was 50%; “+++” indicated more tissues have cells to move out,cells plating efficiency rate was 75%.

表2斑馬魚卵巢組織原代細(xì)胞培養(yǎng)中最適血清濃度的篩選

Table 2Screening results of the optimal percentage of FBS for primary cell culture of the ovary tissues of zebrafish

血清濃度Serumconcentra-tion%組織塊貼壁率Tissuepiecerate∥%細(xì)胞遷出時(shí)間Cellmigrationtime∥d形成細(xì)胞單層的能力Theabilitytoformamonolayerofcells10603++15803+++20703++

注：“+” 表示少量組織塊有細(xì)胞遷出，細(xì)胞鋪板率約25%；“++” 表示很多組織有細(xì)胞遷出，細(xì)胞鋪板率約50%；“+++” 表示較多組織有細(xì)胞遷出，細(xì)胞鋪板率約75%。

Note: “+” indicated a small amount of tissue blocks have cells to move out,cells plating efficiency rate was 25%; “++” indicated that many tissues have cells to move out,cells plating efficiency rate was 50%; “+++” indicated more tissues have cells to move out,cells plating efficiency rate was 75%.

由表3可知，斑馬魚卵巢組織分別于不同溫度(20、24和28 ℃)下培養(yǎng)，24 ℃下組織塊的貼壁率最高(80%)，細(xì)胞遷出時(shí)間最短(3 d)，形成細(xì)胞單層能力最強(qiáng)；20 ℃下組織塊的貼壁率與24 ℃下一樣高(80%)，但細(xì)胞遷出時(shí)間最長(zhǎng)(7 d)，形成細(xì)胞單層的能力介于24 ℃和28 ℃之間；28 ℃下，組織塊的貼壁率最低(40%)，細(xì)胞遷出用時(shí)5 d，形成單層的能力最差。由此可見，斑馬魚卵巢組織原代細(xì)胞培養(yǎng)的最適溫度為24 ℃。

在最適培養(yǎng)條件下，于添加15%FBS、20 ng/mL EGF、20 ng/mL bFGF、0.5 mmol/L β-巰基乙醇、100 IU/mL青霉素和100 μg/mL硫酸鏈霉素的DMEM/F12 完全培養(yǎng)基中，24 ℃下斑馬魚卵巢組織塊貼壁情況良好,只有極少數(shù)組織塊脫落，懸浮于培養(yǎng)液中。細(xì)胞于組織塊接種3 d后開始遷出，最先遷出的是1種上皮樣細(xì)胞(圖1A)，該細(xì)胞生長(zhǎng)5 d后開始變圓并空泡化，逐漸凋亡(圖1B)。此時(shí)，長(zhǎng)梭形的成纖維樣細(xì)胞和多角形上皮樣細(xì)胞開始大量遷出，且可持續(xù)13天左右。其中，長(zhǎng)梭形的成纖維樣細(xì)胞很快長(zhǎng)成致密單層(圖1C)，但僅能健康存活20天左右；隨后，長(zhǎng)梭形的成纖維細(xì)胞變大變薄，邊界模糊，部分細(xì)胞出現(xiàn)空泡化(圖1E)；后期，長(zhǎng)梭形的成纖維細(xì)胞極度鋪展，形狀極不規(guī)則，空泡化嚴(yán)重，最終凋亡(圖1G)。多角形上皮樣細(xì)胞也在接種后20天內(nèi)形成細(xì)胞單層(圖 1D)，相比之下，遷出的多角形上皮樣細(xì)胞可健康存活更長(zhǎng)時(shí)間，在不傳代條件下，可健康存活40天左右(圖1F)，隨后，細(xì)胞逐漸變圓脫落，最終死亡(圖1H)。2.2精巢組織的原代細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果采用與卵巢組織相同的最適培養(yǎng)條件，斑馬魚精巢組織的原代細(xì)胞培養(yǎng)啟動(dòng)4～5 d后，可觀察到2類細(xì)胞同時(shí)遷出，即成纖維樣細(xì)胞(圖2A)和上皮樣細(xì)胞(圖2A和圖2B)，這2類細(xì)胞均可健康存活15 d左右。接種21 d后，成纖維樣細(xì)胞開始空泡化，邊界模糊(圖 2C)；上皮細(xì)胞逐漸變圓脫落(圖2D)，在培養(yǎng)25 d左右時(shí)全部死亡。

表3斑馬魚卵巢組織原代細(xì)胞培養(yǎng)中最適培養(yǎng)溫度的篩選

Table 3Screening results of the optimal temperature for primary cell culture of the ovary tissues of zebrafish

培養(yǎng)溫度Temperature℃組織塊貼壁率Tissuepiecerate∥%細(xì)胞遷出時(shí)間Cellmigrationtime∥d形成細(xì)胞單層的能力Theabilitytoformamonolayerofcells20807++24803+++28405+

注：“+” 表示少量組織塊有細(xì)胞遷出，細(xì)胞鋪板率約25%；“++” 表示很多組織有細(xì)胞遷出，細(xì)胞鋪板率約50%；“+++” 表示較多組織有細(xì)胞遷出，細(xì)胞鋪板率約75%。

Note: “+” indicated a small amount of tissue blocks have cells to move out,cells plating efficiency rate was 25%; “++” indicated that many tissues have cells to move out,cells plating efficiency rate was 50%; “+++” indicated more tissues have cells to move out,cells plating efficiency rate was 75%.

注：A.接種3 d后遷出的多角形上皮樣細(xì)胞；B.接種8 d后，遷出的上皮樣細(xì)胞開始變圓并空泡化，逐漸凋亡;C.接種20 d后，遷出的長(zhǎng)梭形的成纖維細(xì)胞;D.接種20 d后，遷出的多角形上皮樣細(xì)胞;E.接種27 d后，部分成纖維細(xì)胞出現(xiàn)空泡化;F.接種30 d后，部分上皮樣細(xì)胞脫落;G.接種35 d后，長(zhǎng)梭形的成纖維細(xì)胞極度鋪展，細(xì)胞變大變薄，邊界模糊，形狀極不規(guī)則，空泡化嚴(yán)重;H.接種46 d后，大部分上皮樣細(xì)胞變圓，脫落死亡。 　Note:A.The epithelium-like cells migrated from the ovary explants at 3 d post seeding.B.The migrated epithelium-like cells tends to shrink and vacuolate at 8 d post seeding.C.The fibroblast-like cells migrated from the ovary explants at 20 d post seeding.D.The epithelium-like cells migrated from the ovary explants at 20 d post seeding.E.Partial fibroblast-like cells shown in panel C showed vacolation at 27 d post seeding. F.Partial epithelium-like cells shown in panel D detached at 30 d post seeding.G.The fibroblast-like cells shown in panel C tend to over-spread out and become big,thin,irregular and vacuolated seriously at 35 d post seeding.H.Most epithelium-like cells shown in panel D begin to shrink,detach and die at 46 d post seeding.圖 1　斑馬魚卵巢組織的原代細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果Fig.1　Light micrographs of the primary culture cells derived from the ovary tissues of zebrafish

2.3傳代培養(yǎng)結(jié)果斑馬魚精巢組織的原代培養(yǎng)細(xì)胞傳代后，細(xì)胞不貼壁，未能成功傳代。卵巢組織的原代細(xì)胞培養(yǎng)15 d后，細(xì)胞狀態(tài)良好(圖3A)，可進(jìn)行傳代。傳代后的初期階段，細(xì)胞能夠正常貼壁和生存，呈長(zhǎng)梭形(圖3B)；中期，細(xì)胞伸展，仍可見長(zhǎng)梭輪廓，生長(zhǎng)緩慢，難以形成單層(圖3C)；后期，胞質(zhì)內(nèi)逐漸出現(xiàn)空泡化，最后凋亡(圖3D)。

3討論與結(jié)論

魚類細(xì)胞系可為在細(xì)胞水平上研究魚類的生理生化特性以及魚類的病毒學(xué)、免疫學(xué)、遺傳學(xué)、營(yíng)養(yǎng)學(xué)、毒理學(xué)和內(nèi)分泌學(xué)等提供有力的研究工具和手段，而性腺細(xì)胞系對(duì)研究生殖干細(xì)胞的自我更新以及配子形成具有重要意義。Wolf等[7]于1962 年建立了世界上第1個(gè)魚類性腺組織細(xì)胞系——虹鱒魚性腺細(xì)胞系(RTG-2)。性腺組織的有絲分裂水平較高，已報(bào)道的魚類性腺細(xì)胞系已有20余種[8-9]，但迄今為止尚未見到斑馬魚性腺組織細(xì)胞系的成功報(bào)道。筆者首次優(yōu)化和建立了斑馬魚卵巢和精巢組織的原代和傳代培養(yǎng)技術(shù)，為今后成功建立斑馬魚性腺組織細(xì)胞系奠定了基礎(chǔ)。

注：A.接種5 d后，遷出的上皮樣細(xì)胞(e)和成纖維樣細(xì)胞(f);B.接種5 d后，遷出的上皮樣細(xì)胞;C.接種21 d后，空泡化的成纖維樣細(xì)胞;D.接種21 d后，開始脫落死亡的上皮樣細(xì)胞?！ote:A.The migrated epithelium-like cells (e) and fibroblast-like cells (f) at 5 d post seeding; B.The migrated epithelium-like cells at 5 d post seeding; C.The fibroblast-like cells shown in panel A demonstrated vacuolation at 21 d post seeding; D.The epithelium-like cells shown in panel B began to detach and die at 21 d post seeding.圖2　斑馬魚精巢組織的原代細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果Fig.2　Light micrographs of the primary culture cells derived from the testis tissues of zebrafish

注：A.傳代前的原代細(xì)胞單層;B.傳代3 d后的細(xì)胞;C.傳代7 d后的細(xì)胞;D.傳代10 d后的成纖維樣細(xì)胞。　Note:A.Primary ovary cells before subculture; B.Cells at 3 d after subculture; C.Cells at 7 d after subculture; D.Cells at 10 d after subculture.圖3　斑馬魚卵巢組織原代培養(yǎng)細(xì)胞的傳代Fig.3　Subculture of primary ovary cells of zebrafish

魚類原代細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的消毒處理和無(wú)菌取材是培養(yǎng)能否成功的關(guān)鍵。筆者通過(guò)以下措施成功實(shí)現(xiàn)了試驗(yàn)材料的完全無(wú)菌：①試驗(yàn)前24 h停止喂食，并轉(zhuǎn)移到煮沸消毒過(guò)的自來(lái)水中暫養(yǎng)4 h，然后再將斑馬魚轉(zhuǎn)移至含雙抗(1 000 IU/mL青霉素和1 000 μg/mL硫酸鏈霉素)的煮沸消毒的自來(lái)水中暫養(yǎng)12～16 h，這樣就在極大程度上控制了微生物和原生動(dòng)物的污染；②解剖前用碘伏擦拭斑馬魚體表，然后再用75%的酒精浸泡約30 s，進(jìn)一步去除體表的微生物和原生動(dòng)物，并使其麻醉；③取出的生殖腺再用75%的酒精漂洗2～3 s，然后再依次用含200 IU/mL青霉素和200 μg/mL硫酸鏈霉素的PBS及基礎(chǔ)培養(yǎng)基漂洗，以除去組織塊表面殘留的酒精成分，避免由于酒精損傷組織而降低細(xì)胞的貼壁能力和存活率。

組織塊貼壁培養(yǎng)法是一種常用的簡(jiǎn)便易行的原代細(xì)胞培養(yǎng)方法，因其組織塊未受太大的破壞，所以與體內(nèi)環(huán)境比較接近，可在短期內(nèi)保持貼壁能力和增殖能力，并形成生長(zhǎng)暈。此外，這種方法操作步驟簡(jiǎn)單、一般不會(huì)造成污染[10]。筆者采用組織塊貼壁法成功啟動(dòng)了斑馬魚卵巢組織的原代細(xì)胞培養(yǎng)，細(xì)胞一般在原代培養(yǎng)啟動(dòng)后3～4 d內(nèi)即可見到上皮樣細(xì)胞開始遷出，5 d后該上皮樣細(xì)胞停止遷出，并開始空泡化；與此同時(shí)，長(zhǎng)梭形的成纖維樣細(xì)胞和另一種上皮樣細(xì)胞開始遷出，10 d后可形成細(xì)胞單層，并可以成功傳代1次。傳代后的細(xì)胞不生長(zhǎng)分裂，這可能與培養(yǎng)基中某種生長(zhǎng)因子的缺乏有關(guān)，尚需進(jìn)一步研究。

筆者通過(guò)比較斑馬魚卵巢組織細(xì)胞在1.5×L-15、DMEM 和DMEM/F12 3種培養(yǎng)基中組織塊的遷出、貼壁及增殖情況，發(fā)現(xiàn)DMEM/F12(pH7.0～7.2)是適宜斑馬魚卵巢組織細(xì)胞體外培養(yǎng)的培養(yǎng)基，這與斑馬魚胚胎細(xì)胞系(ZF4)[5]的最適培養(yǎng)基相同，可能與DMEM/F12培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分比較豐富有關(guān)。

血清中含有各種生長(zhǎng)因子和激素等有助于細(xì)胞貼壁和生長(zhǎng)的物質(zhì)，其添加濃度是體外細(xì)胞培養(yǎng)能否成功的重要因素。該研究發(fā)現(xiàn)含15% FBS的培養(yǎng)基最適合斑馬魚性腺細(xì)胞的體外培養(yǎng)，而含10% 和20%FBS的的培養(yǎng)基均不適合斑馬魚生殖腺細(xì)胞的培養(yǎng)，可能與血清中的某些生長(zhǎng)因子的濃度過(guò)低和過(guò)高，抑制細(xì)胞的增殖有關(guān)[11]。

該研究還發(fā)現(xiàn)斑馬魚性腺細(xì)胞體外培養(yǎng)的最適溫度為24 ℃，而斑馬魚肝臟細(xì)胞系(ZFL)[4]和ZF4細(xì)胞系[5]的最適培養(yǎng)溫度分別為26和28.5 ℃。這說(shuō)明魚類作為變溫動(dòng)物，不同組織來(lái)源的細(xì)胞的培養(yǎng)條件可能有所差異。

任國(guó)誠(chéng)等[12]在培養(yǎng)漠斑牙鲆胚胎細(xì)胞和樊廷俊[13]等在培養(yǎng)褐點(diǎn)石斑魚細(xì)胞時(shí)均添加了一定濃度的bFGF，有效促進(jìn)了細(xì)胞的有絲分裂，這是由于bFGF與酪氨酸激酶受體結(jié)合后激活了Ras蛋白，從而激活MAP酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終使細(xì)胞進(jìn)入分裂期，引起細(xì)胞增殖[14]；EGF也能夠促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂[15]。此外，有研究證實(shí)EGF和bFGF能夠促進(jìn)斑馬魚細(xì)胞的有絲分裂[16-18]。筆者在培養(yǎng)基中添加了20 ng/mL EGF和20 ng/mL bFGF，發(fā)現(xiàn)這2種生長(zhǎng)因子也有效促進(jìn)了斑馬魚性腺細(xì)胞的體外培養(yǎng)。該研究結(jié)果還表明年幼的斑馬魚的性腺組織細(xì)胞的遷出量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于年長(zhǎng)斑馬魚，這是因?yàn)槟暧捉M織的細(xì)胞具有較強(qiáng)的增殖能力。因此，試驗(yàn)材料的來(lái)源對(duì)于斑馬魚性腺組織的原代細(xì)胞培養(yǎng)順利與否也很重要。

總之，該研究所建立的斑馬魚性腺組織原代和傳代培養(yǎng)條件，為今后斑馬魚性腺組織細(xì)胞系的建立、斑馬魚生殖干細(xì)胞的培養(yǎng)、基因功能研究以及環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的毒性檢測(cè)等奠定了良好基礎(chǔ)。

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基金項(xiàng)目國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31472274，31172391)；海洋經(jīng)濟(jì)創(chuàng)新發(fā)展區(qū)域示范項(xiàng)目(12PYY001SF08)；中國(guó)海洋大學(xué)本科生SRDP項(xiàng)目。

作者簡(jiǎn)介董丹丹(1991- )，女，山東荷澤人，碩士研究生，研究方向：細(xì)胞生物學(xué)。*通訊作者，教授，博士，碩士生導(dǎo)師，從事海洋生物分子細(xì)胞生物學(xué)研究。

收稿日期2016-04-27

中圖分類號(hào)S 917

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611(2016)15-130-05

Development of Primary Cell Culture from the Gonad Tissues of Zebrafish

DONG Dan-dan,SUN Yan-xia,GUO Hua-rong*

(College of Marine Life,Ocean University of China,Qingdao,Shandong 266003 )

Abstract[Objective] To develop a primary cell culture system for the cells from ovary and testis tissues of zebrafish and to obtain the corresponding cell monolayer of both primary culture and subculture.[Method] Primary cell cultures were derived using the explants culture method.The primary cells were sub-cultured by 0.25% trypsin digestion.[Result] The zebrafish gonad-derived cells were cultured in DMEM/F12 (pH 7.0-7.2) at an optimal temperature of 24 ℃.The cells had better growth and survivor when the medium mentioned above was supplemented with 20 ng/mL epidermal growth factor (EGF),20 ng/mL basic fibroblast factor (bFGF),0.5 mmol/L β-mercaptoethanol and 15% fetal bovine serum (FBS).For ovary tissues,epithelium-like cells first migrated from the explants at 3～4 days after seeding.These epithelium-like cells could only survive for about 5 days in vitro,and then tended to apoptosis.However,active migration of fibroblast-like cells and another kind of epithelium-like cells were then observed and a primary cell monolayer with 80% confluence could be formed within 10 days.Then the primary cell monolayer could be successfully sub-cultured once.The epithelium-like cells can’t re-attach and die soon after subculture.However,the re-attached fibroblast-like cells could healthily survive for another 7 days and then tend to apoptosis.No obvious cell division was observed in both the primary and subculture cells.For testis tissues,both epithelium-like cells and fibroblast-like cells migrated from the explants at 5 days after seeding.At 16 days after seeding,a primary cell monolayer with 60% confluence was obtained and then tended to apoptosis.[Conclusion] This study has established a primary cell culture system suitable for the gonad tissues of zebrafish,and the fibroblast-like cell monolayer derived from the ovary tissues has been successfully sub-cultured for one time.

Key wordsZebrafish; Gonad tissue; Primary cell culture; Subculture