祛風(fēng)通絡(luò)方對阿霉素腎病大鼠腎小球內(nèi)皮細(xì)胞通透性的影響

王　娟，　崔志軍，　馬巧亞，　孫萬森，　王　竹

(1.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，　陜西　西安　710004 2.陜西省交通醫(yī)院急診科，　陜西　西安　710068)

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祛風(fēng)通絡(luò)方對阿霉素腎病大鼠腎小球內(nèi)皮細(xì)胞通透性的影響

王娟1，崔志軍2，馬巧亞1，孫萬森1，王竹1

(1.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，陜西西安710004 2.陜西省交通醫(yī)院急診科，陜西西安710068)

【摘要】目的：探討祛風(fēng)通絡(luò)方對阿霉素腎病大鼠腎小球內(nèi)皮細(xì)胞通透性的影響。方法：一次性尾靜脈注射阿霉素建立大鼠腎病模型。采用全自動生化分析儀檢測24h尿蛋白定量、血清生化指標(biāo)；采用酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒測定腎小球內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)上清血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)水平；采用二室彌散系統(tǒng)檢測腎小球內(nèi)皮細(xì)胞通透性。結(jié)果：尿蛋白定量降低，血清白蛋白升高，血總膽固醇降低，腎小球內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)上清VEGF降低，腎小球內(nèi)皮細(xì)胞通透性降低。結(jié)論：祛風(fēng)通絡(luò)方可能通過下調(diào)阿霉素腎病大鼠腎小球內(nèi)皮細(xì)胞VEGF表達(dá)，降低腎小球內(nèi)皮細(xì)胞通透性，從而達(dá)到防治蛋白尿的目的。

【關(guān)鍵詞】祛風(fēng)通絡(luò)方；蛋白尿；腎小球內(nèi)皮細(xì)胞；血管內(nèi)皮生長因子；通透性

蛋白尿是多種腎臟疾病的主要臨床表現(xiàn)之一，蛋白尿程度與腎小球?yàn)V過膜通透性密切相關(guān)。本課題前期研究證實(shí)，祛風(fēng)通絡(luò)方可通過調(diào)節(jié)阿霉素腎病(adriamycin nephropathy，AN)大鼠足細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)發(fā)揮防治蛋白尿的作用，但祛風(fēng)通絡(luò)方對GEC通透性的影響尚未明確[1]。本研究擬以AN大鼠為動物模型，探討祛風(fēng)通絡(luò)方對AN大鼠腎小球內(nèi)皮細(xì)胞通透性的影響，旨在為祛風(fēng)通絡(luò)方的臨床治療提供可靠依據(jù)。

1材料與方法

1.1動物與藥品:SPF級成年雄性SD大鼠48只，體重140g～160g，購于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心(合格證號為陜醫(yī)動字第09-005號)；阿霉素購于浙江海正藥業(yè)，規(guī)格：10mg，國藥準(zhǔn)字H33021980；醋酸潑尼松購于廣東華南藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批號：國藥準(zhǔn)字H44020682，規(guī)格：5mg；祛風(fēng)通絡(luò)方由西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院中醫(yī)科制劑室提供，方中包含黃芪、生地、青風(fēng)藤、桑寄生、烏梢蛇、海風(fēng)藤，每劑含生藥105g。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑及儀器:胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基、PBS緩沖液(Hyclon公司，美國)；血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)ELISA檢測試劑盒(R&D公司，美國)；7600-020型全自動生化分析儀(日立公司，日本)；酶標(biāo)儀(Thermo公司，美國)。

1.3動物模型建立及分組:將48只大鼠按簡單隨機(jī)分組法分為空白對照組(A組，n=8)和腎病模型組(G組，n=40)，參照任艷云[2]等報(bào)道方法，采用一次性尾靜脈注射阿霉素6mg/kg建立大鼠腎病模型，A組給予尾靜脈注射等量生理鹽水。3周后檢測大鼠24h尿蛋白定量、血清白蛋白(albumin，ALB)、血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、血肌酐(creatinine，Cr)、血總膽固醇(total cholesterol，TC)、血甘油三酯(triglyceride，TG)指標(biāo)，提示造模成功(見表1)。將G組40只腎病模型大鼠按簡單隨機(jī)分組法分為5組，即B組、C組、D組、E組、F組，每組8只。B組為模型對照組，C、D、E組為祛風(fēng)通絡(luò)方干預(yù)組，F(xiàn)組為陽性對照組。從第4周期，A組和B組僅給予生理鹽水，C、D、E組分別給予含生藥量1.0g/mL、2.1g/mL、4.2g/mL的祛風(fēng)通絡(luò)方2mL(分別相當(dāng)于成人臨床用藥的6倍、12倍、24倍)，F(xiàn)組給予25mg/kg潑尼松液2mL(相當(dāng)于成人劑量4倍)，各組均采用灌胃給藥，1次/d，連續(xù)給藥28d。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，處死所有受試動物。

1.4腎小球內(nèi)皮細(xì)胞分離培養(yǎng):參照曾玉[3]等報(bào)道方法，分離培養(yǎng)腎小球內(nèi)皮細(xì)胞?；铙w取出大鼠腎臟，去除腎被膜及髓質(zhì)，輕輕碾磨皮質(zhì)，并依次通過80目、120目、200目篩子，收集腎小球。加入0.1%IV型膠原酶消化腎小球，收集沉淀，將腎小球接種與鋪有1%明膠培養(yǎng)瓶，常規(guī)培養(yǎng)，待腎小球充分貼壁后常規(guī)換液，第3周進(jìn)行純化。采用MiniMACS間接免疫磁珠分選系統(tǒng)分離純化CD34陽性細(xì)胞，純化后細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)并傳代，采用形態(tài)學(xué)觀察、直接免疫熒光法及免疫組化法對所分離內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行鑒定。

1.5腎小球內(nèi)皮細(xì)胞通透性測定:參照陳朝紅[4]等報(bào)道方法，進(jìn)行腎小球內(nèi)皮細(xì)胞通透性檢測。調(diào)整內(nèi)皮細(xì)胞濃度為3.0×105個(gè)/mL并接種于微孔細(xì)胞培養(yǎng)嵌套中，將嵌套置于6孔培養(yǎng)板中，加入1640培養(yǎng)液，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天換液一次，待濾膜上內(nèi)皮細(xì)胞生長成致密連接狀態(tài)后，加入100mg/L biotin-BSA作為通透性指示劑，收集培養(yǎng)12h時(shí)內(nèi)室和外室培養(yǎng)液各10μL，測定biotin-BSA含量。內(nèi)皮細(xì)胞單層對白蛋白的通透性計(jì)算公式=(外室biotin-BSA濃度/內(nèi)室biotin-BSA濃度)×100%。

1.6血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)測定：采用酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA)試劑盒測定腎小球內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)上清VEGF水平，操作嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.724h尿蛋白測定:采用鄰苯三酚紅/鉬酸鹽法檢測24h尿蛋白定量。

1.8血清生化指標(biāo):采用全自動生化分析儀監(jiān)測血清ALB、BUN、Cr、TC、TG等指標(biāo)。

2結(jié)果

2.1各組7周末24h尿蛋白定量比較:各組間7周末24h尿蛋白定量比較差異顯著(F=20.421，P<0.05)。與B組比較，C、D、E、F組24h尿蛋白定量降低，組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；C、D、E組三組間24h尿蛋白定量比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；C、D、E組三組間24h尿蛋白定量與F組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表2)。

表1　各組3周末24h尿蛋白定量及血清各項(xiàng)指標(biāo)比較±s)

注：與A組比較，*P<0.05

表2　各組7周末24h尿蛋白定量比較±s)

注：與A組比較，*P<0.05；與B組比較，#P<0.05

2.2各組7周末血清各項(xiàng)指標(biāo)比較:各組間7周末ALB、Cr、TC、TG比較差異顯著(F=15.368、7.213、35.247、44.619，P<0.05)。各組間7周末BUN比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=0.734，P>0.05)；與A組相比較，B組ALB明顯降低，Cr、TC、TG明顯升高，組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與B組相比較，C、D、E組ALB升高，TC降低，組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。C、D、E組三組間ALB、Cr、TC、TG比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表3)。

表3　各組7周末血清各項(xiàng)指標(biāo)比較±s)

注：與A組比較，*P<0.05；與B組比較，#P<0.05

2.3各組腎小球內(nèi)皮細(xì)胞VEGF表達(dá)水平比較:各組間7周末腎小球內(nèi)皮細(xì)胞VEGF表達(dá)水平比較差異顯著(F=14.682，P<0.05)。與A組相比較，B組腎小球內(nèi)皮細(xì)胞VEGF水平明顯升高，組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與B組相比較，C、D、E、F組腎小球內(nèi)皮細(xì)胞VEGF明顯降低，組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。C、D、E組三組間腎小球內(nèi)皮細(xì)胞VEGF比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。C、D、E組三組間腎小球內(nèi)皮細(xì)胞VEGF與F組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見圖1)。

圖1　各組腎小球內(nèi)皮細(xì)胞VEGF表達(dá)水平比較示意圖

注：與A組比較，*P<0.05；與B組比較，#P<0.05

2.4各組腎小球內(nèi)皮細(xì)胞通透性比較:各組間腎小球內(nèi)皮細(xì)胞通透性比較差異顯著(F=28.335，P<0.05)。與A組相比較，B組腎小球內(nèi)皮細(xì)胞通透性明顯升高，組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與B組相比較，C、D、E、F組腎小球內(nèi)皮細(xì)胞通透性降低，組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。C、D、E組三組間腎小球內(nèi)皮細(xì)胞通透性比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。C、D、E組三組間腎小球內(nèi)皮細(xì)胞通透性與F組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見圖2)。

圖2　各組腎小球內(nèi)皮細(xì)胞通透性比較示意圖

注：與A組比較，*P<0.05；與B組比較，#P<0.05

3討論

腎小球內(nèi)皮細(xì)胞作為腎臟濾過屏障的重要組成部分，其通透性增高是誘發(fā)蛋白尿的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。腎小球內(nèi)皮細(xì)胞通透性改變的機(jī)制較為復(fù)雜，VEGF的靶向作用是其中的重要機(jī)制之一。VEGF作為強(qiáng)大的血管通透因子，主要分布于腎小球足細(xì)胞及腎小管上皮細(xì)胞中，其在腎臟中的作用機(jī)制尚未完全明確，目前認(rèn)為VEGF可通過旁分泌作用，穿透腎小球基膜，作用于腎小球內(nèi)皮細(xì)胞，從而調(diào)節(jié)腎小球?yàn)V過膜通透性。陳朝紅[5]等分別選取腎小球內(nèi)皮細(xì)胞和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞為研究對象，并觀察VEGF體外刺激對二者通透性的影響，結(jié)果顯示VEGF體外刺激可明顯提高腎小球內(nèi)皮細(xì)胞和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞通透性，且腎小球內(nèi)皮細(xì)胞對VEGF的敏感性明顯高于人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，證實(shí)VEGF在腎臟疾病及蛋白尿的發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

本研究采用一次性尾靜脈注射阿霉素法成功建立大鼠腎病模型，并在此基礎(chǔ)上觀察大鼠腎小球內(nèi)皮細(xì)胞VEGF表達(dá)及通透性的影響。結(jié)果表明祛風(fēng)通絡(luò)方和潑尼松對阿霉素腎病大鼠蛋白尿均有明顯的治療作用，且祛風(fēng)通絡(luò)方對阿霉素腎病大鼠蛋白尿的治療作用與潑尼松相當(dāng)，但并無潑尼松的副作用。不同濃度祛風(fēng)通絡(luò)方的干預(yù)效果無明顯差異。此外，祛風(fēng)通絡(luò)方可顯著抑制阿霉素腎病所致的腎小球內(nèi)皮細(xì)胞通透性增高，其抑制效果與潑尼松相當(dāng)，該結(jié)果為祛風(fēng)通絡(luò)方拮抗阿霉素腎病大鼠蛋白尿提供了可靠佐證。祛風(fēng)通絡(luò)方均可明顯下調(diào)阿霉素腎病所致的VEGF高表達(dá)，且各組VEGF變化趨勢與腎小球內(nèi)皮細(xì)胞通透性變化趨勢相符，提示祛風(fēng)通絡(luò)方可能是通過調(diào)節(jié)VEGF表達(dá)達(dá)到降低腎小球內(nèi)皮細(xì)胞通透性的目的。

中醫(yī)認(rèn)為，脾腎兩虛是腎性蛋白尿的主要病機(jī)。筆者認(rèn)為“風(fēng)伏腎絡(luò)”是腎性蛋白尿的另一重要病機(jī)。本虛乃腎絡(luò)空虛，標(biāo)實(shí)乃四時(shí)邪氣。依據(jù)此病機(jī)，應(yīng)以“補(bǔ)虛祛邪”之法以填補(bǔ)腎絡(luò)之空虛，驅(qū)逐當(dāng)令之邪。祛風(fēng)通絡(luò)方是在“風(fēng)伏腎絡(luò)”病機(jī)指導(dǎo)下經(jīng)多年臨床實(shí)踐加減而成的中藥復(fù)方。方中以烏梢蛇為君，具有祛風(fēng)通絡(luò)、止痙鎮(zhèn)痛之功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)，烏梢蛇可明顯增強(qiáng)網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬能力，對蛋白尿具有較好的治療效果。海風(fēng)藤為臣，具有祛風(fēng)通絡(luò)、行氣止痛之功效。君臣互補(bǔ)，可搜腎絡(luò)之伏風(fēng)、通腎絡(luò)之瘀滯。佐以黃芪、桑寄生，可補(bǔ)腎健脾、利水消腫?？v觀全方，共奏祛風(fēng)通絡(luò)、補(bǔ)氣益腎之功效，契合腎性蛋白尿“風(fēng)伏腎絡(luò)”之病機(jī)和本虛標(biāo)實(shí)的病性。 綜上所述，祛風(fēng)通絡(luò)方可能通過下調(diào)阿霉素腎病大鼠腎小球內(nèi)皮細(xì)胞VEGF表達(dá)，降低腎小球內(nèi)皮細(xì)胞通透性，從而達(dá)到防治蛋白尿的目的。

【參考文獻(xiàn)】

[1]王竹,劉俊田,孫萬森,等.祛風(fēng)通絡(luò)方對阿霉素腎病大鼠足細(xì)胞Desmin及CD2AP蛋白的影響[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志,2014,34(2):203～208.

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[4]陳朝紅,劉志紅,余晨,等.一種體外研究腎小球內(nèi)皮細(xì)胞通透性的方法[J].腎臟病與透析腎移植雜志,2002,11(5):497～500.

[5]陳朝紅,劉志紅.血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子對腎小球內(nèi)皮細(xì)胞通透性的影響[J].腎臟病與透析腎移植雜志,2002,11(4):353～357.

【基金項(xiàng)目】國家青年自然科學(xué)基金，(編號：81001579)；西安交通大學(xué)基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)自由探索與自主創(chuàng)新類項(xiàng)目，(編號：08143035)；西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院院基金重點(diǎn)項(xiàng)目，[編號：YJ(ZD)201203]

【通訊作者】王竹

【文章編號】1006-6233(2016)06-0957-04

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A【doi】10.3969/j.issn.1006-6233.2016.06.028