TALEN構(gòu)建Fndc5基因敲除小鼠及初步分析

吳子環(huán)，胡雄兵3，毛鳳儀，王 超，張 彬，莊峰鋒3，胡克平，孫曉波，劉 曉，匡世煥，，金 文

（1.寧波大學(xué)海洋學(xué)院，浙江寧波 315000；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所藥理毒理中心中藥（天然藥物）創(chuàng)新藥物研發(fā)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院-普渡大學(xué)脂肪代謝聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；3.北京唯尚立德生物科技有限公司，北京 100085；4.普渡大學(xué)動(dòng)物系，美國）

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TALEN構(gòu)建Fndc5基因敲除小鼠及初步分析

吳子環(huán)1，2，胡雄兵3，毛鳳儀2，王 超4，張 彬2，莊峰鋒3，胡克平2，孫曉波2，劉 曉1，匡世煥2，4，金 文2

（1.寧波大學(xué)海洋學(xué)院，浙江寧波 315000；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所藥理毒理中心中藥（天然藥物）創(chuàng)新藥物研發(fā)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院-普渡大學(xué)脂肪代謝聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；3.北京唯尚立德生物科技有限公司，北京 100085；4.普渡大學(xué)動(dòng)物系，美國）

【摘要】目的 通過構(gòu)建Fndc5基因敲除小鼠，為后續(xù)的研究提供動(dòng)物模型。方法 運(yùn)用TALEN技術(shù)在Fndc5基因FNIII domain中造成缺失突變，并通過測序進(jìn)行基因型鑒定。通過配對(duì)建立穩(wěn)定遺傳系并在mRNA和DNA水平鑒定出生小鼠基因型；對(duì)不同年齡段出生小鼠進(jìn)行體重、血糖分析；通過qPCR確定Fndc5在腎臟、肝臟、大腦、肌肉、心臟等組織中的表達(dá)情況。結(jié)果 成功構(gòu)建并鑒定得到4種不同的Fndc5基因敲除小鼠品系；不同年齡段出生小鼠體重、血糖未見顯著性差異；確定Fndc5在肌肉、心臟等組織中高表達(dá)。結(jié)論 本實(shí)驗(yàn)在國際上成功構(gòu)建了Fndc5基因敲除小鼠，并進(jìn)行了初步分析，為深入研究Fndc5基因在體內(nèi)中的功能提供了動(dòng)物模型。

【關(guān)鍵詞】骨骼?。籉ndc5基因；纖維連接蛋白；TALEN

骨骼肌在調(diào)控系統(tǒng)能量穩(wěn)態(tài)上扮演著重要的角色。而且骨骼作為一個(gè)分泌器官漸漸被認(rèn)同，肌肉分泌和表達(dá)的細(xì)胞因子和其他多肽類，并且通過自分泌、內(nèi)分泌、旁分泌的方式在不同組織發(fā)揮作用的物質(zhì)叫“肌因子”［1-3］。其中，肌因子 irisin越來越受到關(guān)注，其前體Fndc5（fibronectin type III domain containing protein 5）是一個(gè)跨膜蛋白，它的胞外域裂解產(chǎn)生一個(gè)溶解的激素irisin［4］。Fndc5最早是在對(duì)fibronectin type III domains的基因組搜索中發(fā)現(xiàn)的［5］。最初，研究發(fā)現(xiàn)Fndc5在運(yùn)動(dòng)的刺激下作為PGC1-α依賴的產(chǎn)物，隨后裂解產(chǎn)生irisin進(jìn)入血液作用于白色脂肪，刺激UCP1表達(dá)提高產(chǎn)熱；促使白色脂肪棕色化，從而提高和改善了肥胖和糖尿病患者的代謝狀態(tài)，為治愈肥胖和糖尿病提供了可能［2］。隨著研究的深入，關(guān)于Fndc5的許多其他功能都被證實(shí)。

TALEN（transcriptionactivator-like（TAL）effector nuclease）靶向基因敲除基因修飾是第二代新型基因編輯分子生物學(xué)工具，首次發(fā)現(xiàn)于黃單胞桿菌（Xanthomonas）中［6，7］。TALE中的重復(fù)可變雙殘基（repeat variable di-residue，RVD）［6］與A、C、T、G有恒定的對(duì)應(yīng)關(guān)系［8，9］。因此，為識(shí)別某一特定氨基酸序列，只需設(shè)計(jì)相應(yīng)TALE單元串聯(lián)克隆，然后在N-端加上核定位信號(hào)，并在C-端融合上Fork I核酸內(nèi)切酶的切割區(qū)，就構(gòu)建成了TALEN［10，11］，利用其特異性內(nèi)切酶活性切割特定的DNA序列，最后細(xì)胞可以通過NHEJ（non-homologous end joining）途徑修復(fù)DNA損傷，在此修復(fù)過程中隨機(jī)插入或刪除了一定數(shù)目的堿基，造成移碼突變，形成了目標(biāo)基因敲除的突變體［12，13］。目前，TALEN技術(shù)已在非洲爪 蟾（XenoPuslaevis）［14，15］、青 鳉（Oryzias latiPes）［16］、斑馬魚（Danio rerio）［17］、大鼠（Rattus norvegicus）［18］、小鼠（Mus musculus）［19］等模式動(dòng)物的基因敲除研究中獲得了成功。

Fndc5作為新肌因子irisin的前體從研究初始其在體內(nèi)外的功能就備受熱議。它在小鼠、人體內(nèi)的功能研究已經(jīng)取得了初步進(jìn)展，但是其在肌肉中的功能研究還未開展。我們通過TALEN技術(shù)在國

際上構(gòu)建Fndc5基因敲除小鼠，并進(jìn)行了初步分析，為后期研究Fndc5在體內(nèi)尤其肌肉中的的功能提供了敲除小鼠模型，對(duì)于Fndc5/irisin對(duì)肌肉本身的影響的認(rèn)識(shí)，將填補(bǔ)這一認(rèn)知領(lǐng)域的空白。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)C57BL/6小鼠品系，購自北京維通利華有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)合格證號(hào)：SCXK（京）2014-0001。飼養(yǎng)于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所SPF級(jí)動(dòng)物房，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證：SYXK（京）2013-0023，動(dòng)物房溫度（20～26）℃，相對(duì)濕度40%～70%。

1.1.2 TALEN質(zhì)粒：TALEN質(zhì)粒pCS5-eTALEN-T由北京唯尚立德生物科技有限公司合成。靶位點(diǎn)位置 T1：TTTCTAGAAGAAGGATGT gcggatgctccggtt CATTCAGGAGGTGAACA，其中左邊TALE識(shí)別序列：TTCTAGAAGAAGGATGT 17 bp，右邊TALE識(shí)別序列：GTTCACCTCCTGAATG 16bp，間隔15 bp。靶 位 點(diǎn) 位 置T3：TCCGGCACCTCAAGGCC aactctgccgtggtcag CTGGGATGTCCTGGAGGA，其中左邊TALE識(shí)別序列：CCGGCACCTCAAGGCC 16 bp，右邊TALE識(shí)別序列：CCTCCAGGACATCCCAG 17 bp，間隔17 bp。

1.1.3 引物：對(duì)于靶點(diǎn)位置1，設(shè)計(jì)基因型檢測PCR引物：CATGTTTCCTTAGCTCTACTGTGG（正向），GGAGAAAGCATGCATGGCAGTCTC（反向）PCR片段長度為518 bp；對(duì)于靶點(diǎn)位置3，設(shè)計(jì)基因型檢測PCR 引 物：GGACCCTTGGTTTGGCCAGTCTA（正 向），CTCTACCATCATCCTCCATGCCTG（反向）PCR片段長度為 479 bp。Real-Time引物：FNDC5-F：ATGAA GGATGGGGAGGAA，F(xiàn)NDC5-R：GCGGCAGAAGAGAG CTATAACA，18s-F：CATGCAGAACC CACGACAGTA，18s-R：CCTCACGCAGCTTGTTG TCTA。

1.1.4 試劑：本實(shí)驗(yàn)的引物由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成。AmpPCRmix（TAKARA，Ro74A）試劑盒、TransZol Up Plus RNA Kit（Tran，ER501-01）、EasyScript First-Strand cDNA SynthesisSuperMxi（Tran，AE301-03）、TransStrt Top Green qPCR SupreMix（Tran，AQ131-02）、Base（堿液）、Neutrlization（中和液）等。

1.2 方法

1.2.1 Fndc5基因敲除TALEN靶點(diǎn)位置的設(shè)計(jì)：根據(jù)Fndc5的基因組結(jié)構(gòu)，F(xiàn)ndc5 protein domain的分析，破壞the FNIII domain，將TALEN的靶點(diǎn)位置設(shè)計(jì)在外顯子3上或者外顯子3前，測定SSA活性，選擇活性比較高的靶點(diǎn)進(jìn)行后續(xù)的Fndc5基因敲除小鼠的構(gòu)建。

1.2.2 Fndc5基因敲除鼠的構(gòu)建流程：將Fndc5-T1和 Fndc5-T3的 TALEN質(zhì)粒對(duì)，體外轉(zhuǎn)錄成mRNA后，共顯微注射mRNA到小鼠的受精卵中，共注射120個(gè)受精卵，出生23只小鼠。兩周齡后，剪取4周齡出生小鼠任一只耳朵大約1/3，放置在做好標(biāo)記的1.5 mL的離心管中，加入75 μL堿液（base）95℃以上40 min；然后加入75 μL中和液（neutrlization），常溫靜置5 min，溶液即為提取的基因組DNA。以此基因組DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，產(chǎn)物測序并根據(jù)峰圖進(jìn)行基因型鑒定。

2 結(jié)果

2.1 四品系Fndc5基因敲除小鼠的建立

2.1.1 Fndc5基因敲除TALEN靶點(diǎn)位置的設(shè)計(jì)：根據(jù)Fndc5的基因組結(jié)構(gòu)，F(xiàn)ndc5 protein domain的分析，決定破壞the FNIII domain，因此TALEN的靶點(diǎn)位置將設(shè)計(jì)在外顯子3上或者外顯子3前，設(shè)計(jì)結(jié)果如圖1箭頭所示。

2.1.2 Fndc5 TALEN的SSA活性檢測：根據(jù)SSA活性結(jié)果，我們選擇活性比較高的靶點(diǎn)Fndc5-T1和Fndc5-T3進(jìn)行后續(xù)的Fndc5基因敲除小鼠的構(gòu)建，結(jié)果見圖2。

2.1.3 Fndc5基因敲除首建鼠的鑒定：將受精卵注射后出生23只小鼠，對(duì)出生兩周的小鼠進(jìn)行基因型分析和鑒定。結(jié)果如圖3所示，我們選取Founder 7 （T1一條缺失2 bp，一條缺失4 bp）進(jìn)行測序圖分析。測序峰形圖在突變位點(diǎn)開始出現(xiàn)雙峰，表明為雜合子。通過峰形分析，可以將突變型1的DNA序列（下指箭頭所指峰形）和突變型2的DNA序列（上指箭頭所指峰形）分析出來。結(jié)果為一條在CCGGTTCATTCAGGA前缺失2個(gè)堿基CT；一條在CGGTTCATTCAGG前缺失4個(gè)堿基GCTC，均發(fā)生移碼突變。

注：A為FNDC5蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)，B為Fndc5基因組結(jié)構(gòu)（箭頭為TALEN的靶點(diǎn)位置）。圖1 FNDC5蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)及Fndc5的基因組Note.A is the primary structure of FNDC5 protein；B is the Fndc5 genome structure（red arrow for TALEN target site）.Fig.1 The primary structure of FNDC5 protein and the Fndc5 genome.

2.1.2 F1代四品系Fndc5基因敲除鼠的鑒定：根據(jù)發(fā)生移碼突變情況，選取的 Founder 7小鼠、Founder 13小鼠、和Founder 18小鼠分別與野生型C57小鼠交配，出生的小鼠兩周齡后按上述方法進(jìn)行基因型鑒定。通過測序圖可分析F1代小鼠的突變情況：如果測序峰全是單峰說明該小鼠是WT（野生型）；如果測序圖出現(xiàn)雙峰則該小鼠為雜合子；如果測序圖也是單峰但是在預(yù)期位置出現(xiàn)缺失突變則該小鼠為純合基因敲除小鼠，這在圖3中已經(jīng)進(jìn)行了類似分析。我們從中選出4種突變類型#7-T1-1（T1缺失2個(gè)堿基CT）、#7-T1-2（T1缺失4個(gè)堿基GCTC）、#13-T1-1（T1缺失2個(gè)堿基TG）、#18-T1-1（T1缺失2個(gè)堿基TC）建立穩(wěn)定遺傳F1小鼠品系。四品系F1小鼠的突變位點(diǎn)及突變后導(dǎo)致提前產(chǎn)生終止密碼子的位置見表1。基因型中黑體標(biāo)記部分是TALEN設(shè)計(jì)敲除的靶位點(diǎn)序列，下劃線部分為敲除的基因序列，這些缺失突變都會(huì)導(dǎo)致提前產(chǎn)生終止密碼子。

2.2 Fndc5敲除小鼠的初步分析

2.2.1 Fndc5小鼠體重分析：通過成功建立和鑒定四品系F1小鼠后，將每個(gè)品系之間進(jìn)行雜交配對(duì)，對(duì)出生的小鼠進(jìn)行基因分型鑒定，分別在1月齡、2月齡進(jìn)行所有出生小鼠的體重測量，體重分析時(shí)將雌雄分開，進(jìn)行純合子與WT之間的體重差異分析，結(jié)果見圖4。結(jié)果表明小鼠生長正常，在1月齡、2月齡純合子和WT小鼠之間體重沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.2.2 Fndc5在小鼠不同組織的表達(dá)情況分析：檢測Fndc5在不同組織內(nèi)的表達(dá)情況有助于下一步的體內(nèi)功能研究。提取小鼠不同組織H（心臟）、K（腎臟）、B（大腦）、L（肝臟）、TA（肌肉）進(jìn)行液氮研磨提取mRNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA進(jìn)行熒光定量PCR，選取18s作為內(nèi)參，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Fndc5在H、B、TA中表達(dá)量較高，在K、L中表達(dá)很少，如圖5。

圖2 Fndc5 TALEN的SSA活性檢測Fig.2 Detection of the Fndc5 TALEN SSA activity

注：突變型1的DNA序列（下指箭頭所指峰形）和突變型2的DNA序列（上指箭頭所指峰形）。圖3 Fndc5基因敲除首建鼠的鑒定Note.The DNA sequence of mutant 1 peak shape（black arrows）and the DNA sequence of mutant 2 peak shape（red arrows）.Fig.3 Identification of Fndc5 first built knockout mice

表1 四品系F1小鼠的突變情況Tab.1 The mutation of four different Fndc5-KO lines of mice

注：A為1月齡體重分析結(jié)果，B為2月齡體重分析結(jié)果。圖4 Fndc5小鼠不同年齡體重分析Note.A：The Results of body weight analysis at one month of age.B：The?Results of body weight analysis at two months of age.Fig.4 Analysis of body weight of the Fndc5 mice at different ages.

注：H-心臟，K-腎臟，B-大腦，L-肝臟，TA-肌肉圖5 Fndc5在小鼠不同組織的表達(dá)情況分析。Note.H-heat.K-kidney.B-brain.L-liver.TA-muscleFig.5 Fndc5 expression in different tissues in the mice.

3 討論

Fndc5作為Irisin（myokine）的前體，作用于白色脂肪提高了全身的產(chǎn)熱能力，促進(jìn)了白色脂肪向棕色脂肪的轉(zhuǎn)化，這一研究從發(fā)現(xiàn)伊始就被認(rèn)為可作為治療糖尿病的靶點(diǎn)。但是經(jīng)過幾年的研究，爭議一直沒有平息：Fndc5裂解產(chǎn)生irisin的機(jī)制是什么？Irisin在不同組織細(xì)胞發(fā)揮作用的受體？Irisin在人體內(nèi)是否發(fā)揮積極作用？總而言之關(guān)于它在小鼠及人體內(nèi)的研究還急需廣泛開展。

目前關(guān)于它在腦、骨髓中的功能研究已經(jīng)取得了一些進(jìn)展，但是關(guān)于它在肌肉中的研究還未見報(bào)道，我們已經(jīng)成功構(gòu)建了4種品系Fndc5敲除小鼠，各自的突變類型在上文中也進(jìn)行了分析，并建立了穩(wěn)定遺傳F1小鼠。我們發(fā)現(xiàn)每個(gè)品系出生小鼠符合正常的孟德爾比率，生長沒有受到影響，在不同年齡段體重沒有出現(xiàn)明顯差異，我們也分析了Fndc5在不同組織內(nèi)的表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)其在H、B、TA中表達(dá)量較高，這為我們下一步開展其在肌肉中的功能研究提供了基礎(chǔ)。有趣的是，通過Fndc5抗體進(jìn)行檢測敲除小鼠時(shí)發(fā)現(xiàn)WT和純合子都出現(xiàn)條帶，我們認(rèn)為本實(shí)驗(yàn)中利用TALEN技術(shù)構(gòu)建敲除小鼠模型只是在Fndc5的FNIII domain缺失了幾個(gè)堿基，導(dǎo)致終止密碼子提前產(chǎn)生，從而是蛋白質(zhì)的功能缺失。但是經(jīng)過缺失突變的Fndc5還是會(huì)產(chǎn)生70-110aa長的蛋白質(zhì)，關(guān)于這部分蛋白質(zhì)是否能發(fā)揮一定的功能還不知道，所以后續(xù)可能還需要其他的手段去確切的證實(shí)Fndc5敲除小鼠是否成功。

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〔修回日期〕2016-02-25

【中圖分類號(hào)】R-33

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1671-7856（2016）06-0037-05

doi：10.3969.j.issn.1671-7856.2016.06.008

［基金項(xiàng)目］國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81471070）；“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)（2012ZX09101、2012ZX09301002-001）；諾華諾德-協(xié)和英才基金（肌信息素抵抗肥胖作用機(jī)理的研究）；藥植所創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃資助。

［作者簡介］吳子環(huán)（1990-），男，碩士研究生，專業(yè)：生物功能基因研究，E-mail：wuzihuan1122@163.com。

［通訊作者］金文（1971-），女，副研究員，博士，研究方向：代謝性疾病藥物藥效學(xué)研究，E-mail：wjin@implad.ac.cn。showed no significant differences.Finally high Fndc5 expressions in the muscles，heart and other organs were determined. Conclusions We Have for the first time successfully generated Fndc5 knockout（KO）mouse model using TALEN mediated DNA targeting technique，and performed preliminary analysis.This Fndc5 knockout（KO）mouse model provides a novel tool for further studies on the in vivo function of FNDC5.

Constructtion of a Fndc5 knockout mouse model by TALEN-mediated DNA targeting

WU Zi-huan1，2，HU Xiong-bing3，MAO Feng-yi2，WANG Chao4，ZHANG Bin2，ZHUANG Feng-feng3，HU Ke-ping2，SUN Xiao-bo2，LIU Xiao1，KUANG Shi-huan2，4，JIN Wen2
（1.School of Ocean Biology，Ningbo University，Ningbo 315000，China；2.Beijing Key Laboratory of Innovative Drug Development of Traditional Chinese Medicine（Natural Medicine）and Translational Medicine，CAMS-Purdue Associate Laboratory of Adipose Metabolism，Center of Pharmacology and Toxicology，Institute of Medicinal Plant Development，Peking Union Medical College and Chinese Academy of Medical Sciences，Beijing 100193；3.Beijing Viewsolid Biotech Company Ltd.，Beijing 100085；4.Department of Animal Science，Purdue University，USA）

【Abstract】Objective To construct Fndc5 knockout mouse models and provide animal models for related studies in the future.Methods Indels were introduced into FNIII domain of Fndc5 gene by TALEN technology in mice，and genotypes were identified by sequencing.To set stable genetic system by pairing.Then at mRNA and DNA levels identified the genetype of born mice.At the same time the body weight and blood glucose of the mice at different ages were analyzed. Finally the Fndc5 expression in the kidney，liver，brain，muscles，heart and other organs was determined by qPCR. Results Four different Fndc5-KO lines were generated.The body weight and blood glucose of the mice at different ages

【Key words】Skeletal muscle；Fndc5；Fibronectin；TALEN；Knockout mouse model