化學(xué)發(fā)光免疫法檢測(cè)醛固酮和腎素濃度及對(duì)原發(fā)性醛固酮增多癥診斷價(jià)值的評(píng)價(jià)

王芳，康金鎖，鄒玉寶，蔣雄京，叢祥鳳，陳曦

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化學(xué)發(fā)光免疫法檢測(cè)醛固酮和腎素濃度及對(duì)原發(fā)性醛固酮增多癥診斷價(jià)值的評(píng)價(jià)

王芳，康金鎖，鄒玉寶，蔣雄京，叢祥鳳，陳曦

摘要

目的：對(duì)化學(xué)發(fā)光免疫法（CLIA）檢測(cè)醛固酮和腎素濃度進(jìn)行方法學(xué)評(píng)價(jià)，并通過和放射免疫法（RIA）比較評(píng)價(jià)其對(duì)原發(fā)性醛固酮增多癥（原醛） 的診斷價(jià)值。

方法：依據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)的相關(guān)方案，對(duì)CLIA檢測(cè)醛固酮和腎素濃度的精密度、準(zhǔn)確性、線性范圍及參考值范圍進(jìn)行評(píng)價(jià)和驗(yàn)證，同時(shí)對(duì)40例高血壓原因待查患者分別用RIA和CLIA檢測(cè)腎素活性或腎素濃度及醛固酮濃度，以臨床診斷為金標(biāo)準(zhǔn)，比較兩種方法測(cè)得的醛固酮濃度/腎素活性或濃度的比值（ARR或ADRR）用于原醛診斷的特異性和敏感性。

結(jié)果：CLIA檢測(cè)醛固酮和腎素濃度的批內(nèi)和批間精密度分別小于5%和10%；回收率分別為102%和95%；醛固酮濃度在3～74 ng/dl范圍內(nèi)、腎素濃度在0.99～330.00 μIU/ml范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好；20例健康受試者除2例腎素濃度超過參考值范圍，20例醛固酮濃度和ADRR均在廠商提供的正常人參考范圍內(nèi)。高血壓原因待查患者的篩查試驗(yàn)結(jié)果顯示CLIA和RIA的檢測(cè)敏感性相同，為85.7%，特異性則分別為97.0%和94.0%。

結(jié)論：CLIA具有操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好、無放射性污染等優(yōu)點(diǎn)，CLIA的檢測(cè)結(jié)果符合臨床要求，廠商提供的正常參考值范圍可用于臨床，本研究推薦用CLIA替代RIA。

關(guān)鍵詞 醛固酮增多癥；化學(xué)發(fā)光測(cè)定法；腎素；醛固酮

Objective： To evaluate chemiluminescence immunoassay （CLIA） for detecting blood levels of aldosterone and rennin with its diagnostic value of primary aldosteronism （PA） with comparison to radio immunoassay （RIA）.

Methods： According to American protocols of CLSI， we conducted a verification study between RIA and CLIA for their precision， accuracy， linearity and reference ranges； meanwhile， taking clinical diagnosis as golden standard， examined renin activity or concentration and aldosterone concentration in 20 healthy volunteers and 40 hypertension patients by both RIA and CLIA， compared the ratios of ARR （aldosterone concentration/renin activity） or ADRR （aldosterone concentration/renin concentration） for the specificity and sensitivity of PA diagnosis.

Results： Within-lot and between-lot accuracies of CLIA for detecting aldosterone levels were below 5% and 10%， the recoveries were 102% and 95% respectively. There was a good linear correlation in the range of aldosterone at （3-74） ng/dl and renin at （0.99-330） μIU/ml. In healthy volunteers， renin level was higher in 2 subjects， while aldosterone level and ADRR ratio were within normal references in all subjects by the manufacturer. In hypertension patients， the sensitivity and specificity for aldosterone and rennin detections by CLIA were at 85.7% and 97.0%， by RIA were at 85.7% and 94.0%.

Conclusion： CLIA has the superiority of simple performance， repeatable and without radioactive contamination； it isrecommended for replacing RIA as necessity.

Key words Primary adlosteronism；Chemiluminescence immunoassay： Renin；Aldosterone

（Chinese Circulation Journal， 2016，31：606.）

原發(fā)性醛固酮增多癥（原醛）是繼發(fā)性高血壓的常見原因之一，是由于腎上腺皮質(zhì)腺瘤或增生，過量分泌醛固酮，導(dǎo)致水鈉潴留，體液容量擴(kuò)增繼而引起血壓升高、腎素-血管緊張素系統(tǒng)受抑制、鉀分泌過多，嚴(yán)重者導(dǎo)致低鉀血癥。以往認(rèn)為原醛的發(fā)病率占輕中度高血壓患者的1%，但近些年的研究表明原醛在高血壓患者中的比例超過10%［1-3］，而且，相對(duì)于同年齡、同性別以及血壓水平相當(dāng)?shù)脑l(fā)性高血壓患者，原醛患者的心血管疾病發(fā)生率和死亡率均更高［4，5］，因此及早識(shí)別原醛對(duì)于早期治療和改善預(yù)后尤為重要［6］。

近年來發(fā)展的全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫法（CLIA）可直接測(cè)定血漿腎素濃度，具有操作簡(jiǎn)便、快速、無放射性污染的特點(diǎn)，已有研究表明醛固酮與腎素濃度的比值（ADRR）在鑒別原醛的效果上與RIA的醛固酮的濃度/腎素活性（ARR）相似［7，8］，并且此方法已收入內(nèi)分泌學(xué)會(huì)臨床實(shí)踐指南［9］，但此方法目前并未在國(guó)內(nèi)廣泛開展，本研究對(duì)此方法進(jìn)行了較為全面的檢測(cè)方法學(xué)評(píng)價(jià)，以期為臨床推廣應(yīng)用提供參考。

1 資料與方法

研究對(duì)象：選取2015-05至2015-08因高血壓原因待查在阜外醫(yī)院入院的患者40例，其中最終確診原醛患者7例，原醛診斷以臨床醫(yī)生依據(jù)病史、體征、臥立位醛固酮、腎素和ARR、鹽水負(fù)荷實(shí)驗(yàn)、腎上腺靜脈采血等作出的綜合判斷為金標(biāo)準(zhǔn)。

入選北京地區(qū)健康受試者20例，年齡26～66歲，其中男性10例，女性10例，通過問卷調(diào)查方式將高血壓、心臟病、腎臟疾病等除外。

腎素和醛固酮檢測(cè)方法：CLIA采用意大利索靈公司全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光儀（Diasorin Liaison）檢測(cè)，其原理是將一個(gè)能識(shí)別被測(cè)物的特異性單克隆抗體包被在磁微粒（固相）上，另一個(gè)被測(cè)物特有的單克隆抗體結(jié)合在發(fā)光底物上，只有被測(cè)物分子兩側(cè)都存在抗體的結(jié)合物被保留，在催化劑作用下產(chǎn)生光信號(hào)，發(fā)光強(qiáng)度與被測(cè)物濃度成正比。本文采用索靈公司醛固酮、腎素濃度檢測(cè)試劑盒檢測(cè)血漿醛固酮濃度（ng/dl）和腎素濃度（μIU/ml），并由此濃度值計(jì)算ADRR。

RIA采用北京北方生物技術(shù)研究所有限公司檢測(cè)血漿腎素活性［ng/（ml·h）］和醛固酮濃度（ng/ ml），ARR=（醛固酮/腎素活性）×100。

標(biāo)本采集和保存：由于臨床上可依據(jù)患者由臥位到立位所產(chǎn)生的腎素和醛固酮的變化來協(xié)助判斷原醛，因此本研究對(duì)每位受試者分別采集臥位和立位血進(jìn)行檢測(cè)。臥位標(biāo)本于平臥過夜采集，立位標(biāo)本站立2 h后靜坐15 min后采集，收集于EDTA抗凝采血管，立即于室溫離心（1760 g）10 min后收集血漿，分裝保存于-80℃冰箱，檢測(cè)時(shí)于37℃水浴迅速?gòu)?fù)融后用于測(cè)定。

檢測(cè)性能評(píng)價(jià)：精密度驗(yàn)證：依據(jù)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI） EP15-A文件（User Demonstration of Performance for Precision and Accuracy，2001年），將高低2個(gè)濃度水平血漿混合樣本，分別重復(fù)檢測(cè)20次，計(jì)算批內(nèi)均值與變異系數(shù)；將高低2個(gè)濃度水平血漿混合樣本分別每日檢測(cè)2批次，每批次各檢測(cè)2次，連續(xù)檢測(cè)5天，計(jì)算批間均值與變異系數(shù)。

準(zhǔn)確性驗(yàn)證：實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性通過回收率來驗(yàn)證，將高濃度標(biāo)本和低濃度標(biāo)本按照1：2、1：4、1：8進(jìn)行混合，各重復(fù)測(cè)定兩次，取測(cè)定平均值與期望值計(jì)算回收率。

線 性 范 圍 驗(yàn) 證：依 據(jù)CLSI EP6-A文 件（Evaluation of the Linearity of Quantitative Measurement Procedure，2003年），將接近線性范圍上限的高值混合樣本，用低值混合樣本進(jìn)行稀釋制備出6個(gè)梯度樣本，每份樣本重復(fù)測(cè)定2次，計(jì)算平均值，以測(cè)定值為Y，理論值為X，使用統(tǒng)計(jì)軟件擬合一次、二次、三次方程，評(píng)估是否線性。

參考值范圍驗(yàn)證：依據(jù)CLSI C28-A2文件（How to Define and Determine Reference Intervals in the Clinical Laboratory，2000年），對(duì)生產(chǎn)廠家提供的參考值范圍進(jìn)行驗(yàn)證（醛固酮為3.0～35.3 ng/dl，腎素為4.4～46.1 μIU/ml，ADRR＜3.7（ng/dl）/（μIU/ml），選取健康受試者20例，采血選擇立位，對(duì)醛固酮和腎素濃度進(jìn)行測(cè)定并計(jì)算ADRR值，應(yīng)少于2人的測(cè)定值超過生產(chǎn)廠家提供的參考范圍。

臨床應(yīng)用評(píng)價(jià)：高血壓原因待查患者40例（包括原醛和非原醛高血壓患者），進(jìn)行篩查試驗(yàn)，即測(cè)定臥、立位血漿腎素和醛固酮水平，以臨床診斷為金標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)估CLIA區(qū)分原醛和非原醛患者的敏感性和特異性，并和RIA進(jìn)行比較。CLIA原醛診斷標(biāo)準(zhǔn)：立位ADRR＞3.7（ng/dl）/（μIU/ml）；RIA原醛診斷標(biāo)準(zhǔn)：立位ARR＞30（ng/ml）/［ng/（ml·h）］。

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。正態(tài)分布計(jì)量資料以±s表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；率的比較采用卡方檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

CLIA法精密度驗(yàn)證（表1、2）：醛固酮濃度的批內(nèi)和批間變異系數(shù)分別小于5%和10%，腎素濃度的批內(nèi)和批間變異系數(shù)均小于5%，均在可接受范圍內(nèi)。

表1 化學(xué)發(fā)光免疫法醛固酮濃度精密度驗(yàn)證

表2 化學(xué)發(fā)光免疫法腎素濃度精密度驗(yàn)證

CLIA法準(zhǔn)確性驗(yàn)證（表3）：醛固酮和腎素的平均回收率分別為102%和95%，在可接受范圍內(nèi)。

表3 醛固酮和腎素濃度的回收率

CLIA法線性范圍驗(yàn)證：一次線性方程醛固 酮 為 y=0.9959x-0.0156，r2=0.9995；腎 素 為y=0.9945x+2.0761，r2=0.9999。兩次多項(xiàng)式系數(shù)a的P＞0.05；三次多項(xiàng)式系數(shù)a和b的P＞0.05。顯示二次、三次多項(xiàng)式系數(shù)與“0”無明顯差異，說明醛固酮濃度在3～74 ng/dl范圍內(nèi)、腎素濃度在0.99～330.00 μIU/ml范圍內(nèi)呈線性。

CLIA法參考值范圍驗(yàn)證：結(jié)果顯示腎素濃度男女性各有1例超過參考值范圍（4.4～46.1μIU/ml），分別為50.23 μIU/ml和50.97 μIU/ml，超出范圍的百分?jǐn)?shù)為10%，在可接受范圍內(nèi)。20例健康受試者醛固酮和ADRR值均在參考值范圍內(nèi)，表明可采用此參考值范圍。

兩種醛固酮和腎素檢測(cè)方法診斷原醛的效能結(jié)果：CLIA的檢測(cè)特異性和敏感性分別為97.0%和85.7%，RIA的檢測(cè)特異性和敏感性分別為94.0% 和85.7% 。兩種方法的檢測(cè)敏感性相同，但CLIA的特異性略高于RIA。

3 討論

本研究結(jié)果顯示CLIA的精密度、準(zhǔn)確性、線性范圍均符合臨床需要。對(duì)廠商提供的正常人參考范圍進(jìn)行的驗(yàn)證表明目前此參考值范圍可用于臨床。此外利用患者標(biāo)本進(jìn)行方法學(xué)比對(duì)，結(jié)果顯示CLIA與RIA對(duì)原醛的診斷能力相當(dāng)。

自1981年Hiramatsu等［10］首次提出檢測(cè)腎素活性并計(jì)算ARR來篩查原醛后，此方法延用至今，目前臨床上仍以RIA測(cè)定的醛固酮和腎素活性為主，其中腎素活性是通過測(cè)定血管緊張素原轉(zhuǎn)換為血管緊張素Ⅰ的速率來間接測(cè)得，雖然這種方法在臨床使用多年，但一直存在較明顯的局限性：其一是檢測(cè)周期長(zhǎng)，出報(bào)告時(shí)間至少需要3天；其二是檢測(cè)重復(fù)性差，檢測(cè)受多種體內(nèi)和體外因素影響，結(jié)果無可比性。因此，ARR在臨床的使用面臨了較大的挑戰(zhàn)。2004年研究報(bào)道了全自動(dòng)CLIA直接測(cè)定腎素濃度的方法［11］，這種方法幾乎克服了RIA測(cè)定腎素活性所有的不足，唯一的問題是腎素活性與腎素濃度的相關(guān)性以及利用腎素濃度計(jì)算所得的ADRR在篩查原醛的效果上是否與ARR相當(dāng)，事實(shí)上，國(guó)外已經(jīng)有許多研究表明這兩種方法之間具有良好的相關(guān)性［7，8，12，13］，甚至包括在卡托普利試驗(yàn)中的相關(guān)性［14］，而在2008年的歐洲內(nèi)分泌學(xué)會(huì)臨床實(shí)踐指南中也已納入腎素濃度的檢測(cè)方法［9］。但是國(guó)內(nèi)則少有醫(yī)院對(duì)此方法進(jìn)行評(píng)價(jià)并投入臨床使用，僅有中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院賴?guó)P華等［15］和重慶醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院孫明芳等［16］分別報(bào)道了這兩種方法的比對(duì)和在原醛診斷中的篩查價(jià)值。與國(guó)內(nèi)外其他研究者的結(jié)果一致，我們的研究通過較為全面的方法學(xué)評(píng)價(jià)，表明了CLIA測(cè)定腎素濃度和醛固酮的可用性和基于腎素濃度的ADRR用于篩查診斷原醛的可行性。

ARR用于篩查原醛的診斷界值尚無定論。主要是因?yàn)槟I素檢測(cè)方法的不同而導(dǎo)致的診斷界值的差異，基于檢測(cè)腎素活性的RIA通常采用的診斷界值是30 （ng/ml）/［ng/（ml·h）］，而基于腎素濃度的CLIA的診斷界值則在不同的研究中提出不同的界值和單位，歐洲內(nèi)分泌學(xué)會(huì)臨床實(shí)踐指南推薦的是立位ADRR大于3.7（ng/dl）/（μIU/ml）［9］，而Glinicki等［8］的研究則為立位ADRR大于30（pg/ml）/（pg/ml），孫明芳等［16］的研究所確定的診斷界值則為立位ADRR大于43.45 （pg /ml） /（μIU/ml），造成差異的原因一是腎素濃度單位的差異，二是研究人群本身不同。本研究中廠家所采用的ADRR單位是（ng/dl）/（μIU/ml），其診斷界值為3.7（ng/dl）/（μIU/ml） ，因?yàn)楸狙芯康闹饕康氖窃u(píng)價(jià)CLIA的檢測(cè)性能，故本文并未建立本實(shí)驗(yàn)室的ADRR診斷界值，而是用給定的診斷界值判斷檢測(cè)結(jié)果并與臨床診斷相比對(duì)，我們發(fā)現(xiàn)在篩查試驗(yàn)中RIA和CLIA的敏感性均為85.7%，而特異性則分別94.0%和97.0% ，這雖然證明了CLIA可替代RIA，但也提示了3.7（ng/dl）/ （μIU/ml） 可能并不是最佳診斷界值，因?yàn)樽鳛楹Y查試驗(yàn)的敏感性略顯不足，這也是為什么指南中RIA的診斷界值會(huì)是20～40（ng/dl）/［ng（ml·h）］ 這樣一個(gè)范圍，而CLIA的最佳診斷界值則需要更多數(shù)據(jù)的積累。

本研究有其不足之處，一是對(duì)于正常參考值范圍，我們僅是對(duì)廠商提供的參考范圍進(jìn)行了驗(yàn)證，但實(shí)際上應(yīng)該針對(duì)中國(guó)人群建立我們實(shí)驗(yàn)室自己的參考值范圍，不過這部分工作我們實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)在籌備進(jìn)展中。另一個(gè)不足之處就是用于方法學(xué)比對(duì)的患者標(biāo)本數(shù)量偏少，本研究是參照EP9-A2文件的最低樣本量40例所開展，我們將進(jìn)一步擴(kuò)大標(biāo)本量對(duì)兩種方法進(jìn)行更為完善的評(píng)價(jià)。

總之，本研究對(duì)CLIA檢測(cè)醛固酮和腎素濃度診斷原醛進(jìn)行了較為全面的方法學(xué)評(píng)價(jià)，我們認(rèn)為與RIA相比，CLIA操作簡(jiǎn)單快速重復(fù)性好，沒有放射性污染，對(duì)于原醛的診斷效果與RIA相似，可以替代RIA用于原醛的篩查試驗(yàn)。

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（編輯：常文靜）

Corresponding Author：CHEN Xi， Email：chenxifw@126.com

收稿日期：（2016-01-12）

作者單位：100037 北京市，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 國(guó)家心血管病中心 阜外醫(yī)院 臨床檢驗(yàn)中心 （王芳、康金鎖、叢祥鳳、陳曦），心內(nèi)科（鄒玉寶、蔣雄京）

作者簡(jiǎn)介：王芳 助理研究員 博士 主要研究方向?yàn)樾难芗膊∩飿?biāo)志物 Email：fray.163@163.com 通訊作者：陳曦 chenxifw@126.com

中圖分類號(hào)：R54

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-3614（2016）06-0606-04

doi：10.3969/j.issn.1000-3614.2016.06.020

Evaluation of Chemiluminescence Immunoassay for Detecting Blood Levels of Aldosterone and Renin With its Diagnostic Value of Primary Aldosteronism

WANG Fang， KANG Jin-suo， ZOU Yu-bao， JIANG Xiong-jing， CONG Xiang-feng， CHEN Xi.
Department of Laboratory Medicine， Cardiovascular Institute and Fu Wai Hospital， CAMS and PUMC， Beijing （100037）， China

Abstract