LAMP法檢測(cè)兒童糞便中腸道腺病毒的建立

趙　娜,劉金霞,孫殿興

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LAMP法檢測(cè)兒童糞便中腸道腺病毒的建立

趙娜1,劉金霞1,孫殿興2

1.承德醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，承德067000；;2.中國(guó)人民解放軍白求恩國(guó)際和平醫(yī)院全軍肝病診治中心，石家莊050082

摘要：目的通過(guò)應(yīng)用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)建立一種快速、簡(jiǎn)便的可視化檢測(cè)兒童腸道腺病毒核酸的方法。方法登錄GenBank網(wǎng)站下載腺病毒40和41基因型的六鄰體序列，根據(jù)該區(qū)段的保守序列設(shè)計(jì)4條LAMP引物。將反應(yīng)體系加入EP管，在恒溫條件(65 ℃)擴(kuò)增60 min后，再以凝膠電泳和鈣黃綠素染色評(píng)價(jià)LAMP法的特異性和靈敏度，并和PCR法的結(jié)果相比較。最后，同時(shí)用LAMP和PCR法對(duì)40份可疑臨床樣本進(jìn)行檢測(cè)，應(yīng)用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果LAMP法能準(zhǔn)確地使腺病毒40和41型得到擴(kuò)增，酶切結(jié)果也正確，顯示了LAMP法較好的特異性。LAMP的靈敏度比PCR高約10倍。經(jīng)過(guò)對(duì)40份臨床樣本的檢測(cè)，LAMP與PCR均沒(méi)有發(fā)生非特異擴(kuò)增，LAMP法和PCR法的一致性為92.5%(P>0.05)且LAMP法沒(méi)有漏檢陽(yáng)性樣本。另外，使用鈣黃綠素染色的方法更好地顯示了產(chǎn)物檢測(cè)的可視性和簡(jiǎn)便性。結(jié)論該研究初步建立了快速、簡(jiǎn)便、可視化檢測(cè)腸道腺病毒的LAMP技術(shù)，在基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)有一定的實(shí)用價(jià)值。

關(guān)鍵詞：腸道腺病毒；環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)；兒童

人類(lèi)腺病毒屬于雙鏈DNA病毒，具有對(duì)稱(chēng)的20面體衣殼，無(wú)包膜，包含240個(gè)六鄰體和12個(gè)五鄰體，共57個(gè)血清型[1]。腺病毒分為A～G共7個(gè)亞屬組，其中F組40和41型，又稱(chēng)腸道腺病毒，是僅次于輪狀病毒的引起5歲以下兒童腹瀉的主要病原體之一[2-4]。

然而，目前檢測(cè)腸道腺病毒的方法存在不足之處：電鏡法靈敏度較低，單克隆抗體為基礎(chǔ)的ELISA[5]。培養(yǎng)困難[6]，PCR法易造成交叉污染而導(dǎo)致假陽(yáng)性[2]。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)具有良好的靈敏度和特異度，且不需開(kāi)蓋檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，從而減少了污染機(jī)會(huì)，但是這對(duì)操作者的技術(shù)和儀器的精密度要求均很高[7]。特研究并評(píng)價(jià)LAMP法的特異性、靈敏性和臨床實(shí)用性，初步建立可視化檢測(cè)兒童腸道腺病毒40和41型的LAMP技術(shù)。

1材料與方法

1.1模板來(lái)源標(biāo)準(zhǔn)病毒株(腺病毒F組40和41型、B組3型和7型、D組37和50型)由中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院提供。選取2015年3月間到白求恩國(guó)際和平醫(yī)院就診的5歲以下兒童，每天排便3次或3次以上且糞便性狀為水樣便、蛋花樣便或粘液便作為納入標(biāo)準(zhǔn)。此期間共采集了40份糞便，糞便收集后24 h內(nèi)送實(shí)驗(yàn)室，以適量pH=7.4的PBS懸浮后，5 000 r/min離心約5 min，取上清液。按照QIAmp DNA Stool Mini Kit(QIAGEN公司)說(shuō)明書(shū)提取DNA模板，提取好的DNA進(jìn)行分裝，凍存于-80 ℃冰箱備用。

1.2LAMP引物的設(shè)計(jì)登錄NCBI網(wǎng)站，下載腺病毒40型和41型六鄰體(Hexon)區(qū)段序列，使用ClusawX軟件進(jìn)行多重序列對(duì)比，確定引物設(shè)計(jì)區(qū)段。根據(jù)腺病毒的40型(參考序列Genbank號(hào)：AB330121)和41型(參考序列Genbank號(hào)：AB330122)的Hexon保守區(qū)段，以LAMP引物軟件Primer Explorer V4(http：//primerexplorer.jp/e/)設(shè)計(jì)通用引物。引物的相對(duì)位置見(jiàn)圖1，序列見(jiàn)表1，其中F3和B3為外引物，F(xiàn)IP和BIP為內(nèi)引物，所有引物由上海生工公司合成。

圖1　LAMP引物的相對(duì)位置

PrimerSequence(5'→3')Length/bpF3GCCACCGATACCTACTTCAG20B3GTCAAAGTAGGTGCTGGCC19FIP(F1c+F2)GTCGCTGCGACCTGTCTGTGCCTGGGGAACAAGTTCAGAA40BIP(B1c+B2)CGCGAGGAAACCGCCTACTCATGTCCAAAACCCGGTTGT39

1.3LAMP反應(yīng)體系內(nèi)引物(FIP和BIP)各1.6 μmol/L，外引物(F3和B3)各0.2 μmol/L，甜菜堿0.8 mol/L，MgSO46 mmol/L，dNTPs 1.4 mmol/L，DNA模板2 μL，BstDNA聚合酶8U，10×反應(yīng)緩沖液 2.5 μL。擴(kuò)增溫度為65 ℃，擴(kuò)增時(shí)間為60 min。擴(kuò)增完成后，如果體系中提前加入1 μL的鈣黃綠素混合溶液(鈣黃綠素和MnCl2的終濃度分別5 mmol/L和10 mmol/L)，肉眼觀察到綠色為陽(yáng)性，橙色為陰性。取5 μL LAMP產(chǎn)物上樣于2%瓊脂糖凝膠中電泳約40 min，凝膠成像系統(tǒng)下檢視階梯狀擴(kuò)增條帶以驗(yàn)證鈣黃綠素的染色結(jié)果。

1.4PCR反應(yīng)體系各1.0 μmol/L的引物(引物參考眀紅霞等的報(bào)道[11])，Taq DNA聚合酶1.25 U，10×Taq Buffer 5 μL，各0.2 mmol/L的dNTPs，4 mmol/L的MgCl2，2 μL模板DNA，用雙蒸水補(bǔ)足50 μL。將反應(yīng)體系置于PCR擴(kuò)增儀上，設(shè)置參數(shù)為：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，將變性、退火和延伸步驟循環(huán)35次，最后72 ℃再延伸5 min。取5 μL產(chǎn)物上樣于2%瓊脂糖凝膠中電泳，凝膠成像系統(tǒng)下觀察擴(kuò)增條帶，產(chǎn)物大小應(yīng)為163 bp。

1.5LAMP的特異性分別以腺病毒F組(40和41型)、B組(3和7型)和D組(37和50型)標(biāo)準(zhǔn)毒株進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，將F組擴(kuò)增產(chǎn)物用內(nèi)切酶BalI酶切，37 ℃孵育過(guò)夜，預(yù)計(jì)酶切后片段主要為一條191 bp的條帶。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次以上。

1.6LAMP的靈敏度 對(duì)標(biāo)準(zhǔn)毒株的DNA模板用雙蒸水對(duì)其進(jìn)行一系列10倍稀釋(稀釋度從1∶1到1∶10 000)，分別進(jìn)行LAMP和PCR擴(kuò)增，比較檢測(cè)靈敏度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次以上。

1.7統(tǒng)計(jì)分析對(duì)40份疑似腸道腺病毒感染的糞便DNA提取物樣本分別用LAMP和PCR法檢測(cè)，應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行卡方檢測(cè)，P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1LAMP的特異性F組(40和41型酶切結(jié)果如圖2A第1、2泳帶所示，腺病毒40和41型DNA模板酶切后的電泳條帶和預(yù)計(jì)條帶相符(191 bp)。所有病毒DNA的LAMP擴(kuò)增結(jié)果如圖2A第3～8泳帶所示，只有腺病毒40和41型被擴(kuò)增，B組和D組腺病毒沒(méi)有被擴(kuò)增，該實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步說(shuō)明引物的特異性良好。另外，由圖2B可知，鈣黃綠素的可視化效果和電泳結(jié)果相當(dāng)。

A：LAMP電泳圖。1、2分別表示腺病毒40和41型的擴(kuò)增產(chǎn)物酶切結(jié)果；3～8表示分別檢測(cè)腺病毒40、41、3、7、37和50型的電泳圖；B：鈣黃綠素可視化檢測(cè)效果，各管的排列順序同3～8泳道。M：1kb DNA marker。

A：Electrophoresis pattern of LAMP. 1, 2: restriction endonuclease digestion results of amplification products of adenovirus genotypes 40 and 41; 3-8: electrophoresis pattern for detection of adenoviurs genotypes 40, 41, 3, 7, 37 and 50；B：Visualized detection by calcein,the order of each tube is the same as 3-8 lanes.M: 1 kb DNA marker.

圖2LAMP檢測(cè)腸道腺病毒的特異性

Fig.2Specificity of LAMP for detection of enteric adenovirus

2.2LAMP和PCR的靈敏度將腸道腺病毒標(biāo)準(zhǔn)株用雙蒸水進(jìn)行一系列10倍稀釋?zhuān)瑢?duì)稀釋的模板DNA分別用LAMP和PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖3A所示，隨著稀釋度的逐漸增大，擴(kuò)增條帶逐漸減弱，最終只能檢測(cè)到的模板稀釋度為1∶100。用LAMP法的電泳擴(kuò)增結(jié)果如圖3B所示，隨著稀釋度的逐漸增大，最終可檢測(cè)到的模板稀釋度為1∶1 000。鈣黃綠素染色效果如圖3C所示，可用肉眼觀察LAMP擴(kuò)增結(jié)果，其可視化效果和電泳檢測(cè)的效果相當(dāng)。

2.3LAMP和PCR對(duì)臨床樣本的檢測(cè)為確證LAMP診斷臨床樣本的準(zhǔn)確性，對(duì)40份可疑樣本分別進(jìn)行LAMP和PCR擴(kuò)增并測(cè)序。結(jié)果LAMP法檢測(cè)出22份陽(yáng)性，PCR法檢測(cè)出19份陽(yáng)性，二者的一致率為92.5%，卡方檢驗(yàn)結(jié)果P=0.25(P>0.05)，證明無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在PCR法得出陽(yáng)性結(jié)果的樣本中，用LAMP法沒(méi)有出現(xiàn)得出陰性結(jié)果的情況。對(duì)結(jié)果不一致的3份樣本測(cè)序，結(jié)果均為腺病毒41型，這進(jìn)一步顯示了LAMP具有更高的靈敏度。還可確定LAMP和PCR法的陽(yáng)性率分別為55%和47.5%。

A：PCR電泳圖：1～5分別表示模板稀釋度為1∶1、1∶10、1∶100、1∶1000、1∶10 000；B：LAMP電泳圖：1～5分別表示模板稀釋度為1∶1、1∶10、1∶100、1∶1000、1∶10 000；C：鈣黃綠素可視化效果：各管的排列順序同上。M：1kb DNA marker；N：雙蒸水陰性對(duì)照。

A：Electrophoresis pattern of PCR: 1-5 electrophoresis pattern of dilution at 1:1, 1:10, 1:100, 1∶1 000, 1∶10 000， B：Electrophoresis pattern of LAMP: 1-5 electrophoresis pattern of dilution at 1∶1, 1∶10, 1∶100, 1∶1 000, 1∶10 000；C：Visualized detection by calcein: the order of each tube is the same as above.M: 1kb DNA marker; N: Negative control using ddH2O.

圖3PCR和LAMP檢測(cè)腸道腺病毒的靈敏度

Fig.3Sensitivity of PCR and LAMP for detection of enteric adenovirus

3討論

在致病的腺病毒中，特定的血清型同疾病的癥狀、流行分布及高危人群具有一定相關(guān)性[12-13]。比如兒童呼吸道感染與腺病毒3、7和14型相關(guān)[14]，角膜結(jié)膜炎與腺病毒53和54型相關(guān)[15]，腸道腺病毒與腺病毒40和41型相關(guān)，Ziros等[16]也用LAMP法進(jìn)行研究，與本研究不同的是Ziros等是用兩套LAMP引物對(duì)腸道腺病毒進(jìn)行分型檢測(cè)，而且產(chǎn)物檢測(cè)沒(méi)有達(dá)到可視性。

LAMP的特異性驗(yàn)證用不同的腺病毒標(biāo)準(zhǔn)毒株為模板進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果和擴(kuò)增產(chǎn)物的酶切結(jié)果均證明了引物的特異性較好。從原理上解釋?zhuān)@4條LAMP引物需要同時(shí)識(shí)別出靶序列的6段特定區(qū)段才啟動(dòng)擴(kuò)增，而PCR是用兩條引物同時(shí)識(shí)別靶序列的2段特定區(qū)段。在靈敏度方面，LAMP的靈敏度比PCR更高；另外，常規(guī)提取方法，尤其是從糞便中得到的DNA中可能伴有DNA聚合酶抑制物等雜質(zhì)，這對(duì)PCR有抑制作用，而LAMP法的耐干擾性強(qiáng)，這也是LAMP法比PCR法靈敏的原因之一。

在產(chǎn)物檢測(cè)階段用染料鈣黃綠素進(jìn)行可視化檢測(cè)，基本原理為反應(yīng)前與Mn2+結(jié)合處于淬滅狀態(tài)，反應(yīng)中副產(chǎn)物焦磷酸根與Mn2+結(jié)合釋放鈣黃綠素，鈣黃綠素的淬滅狀態(tài)解除，發(fā)出綠色熒光[17]，這種熒光用肉眼可進(jìn)行結(jié)果判斷，簡(jiǎn)單方便。

LAMP法由于具有優(yōu)于其他檢測(cè)方法的優(yōu)勢(shì)而正在被廣泛的研究應(yīng)用，但是該方法也存在不足之處，比如引物設(shè)計(jì)繁瑣，易產(chǎn)生氣溶膠污染等。因此，要在大規(guī)模樣本驗(yàn)證后使其發(fā)展成一種經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便的腸道腺病毒檢測(cè)技術(shù)，便于在基層醫(yī)院檢測(cè)或做流行病學(xué)調(diào)查。

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DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2016.02.005

通訊作者：孫殿興，Email：sundianxing@hotmail.com

Corresponding authors: Sun Dian-xing, Email: sundianxing@hotmail.com; Liu Jin-xia, Email: 1158210524@qq.com

中圖分類(lèi)號(hào)：R373

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1002-2694(2016)02-0124-04

收稿日期：2015-10-22；修回日期:2015-12-11

Detection for enteric adenovirus in children by a loop-mediated isothermal amplification method

ZHAO Na1,LIU Jin-xia1,SUN Dian-xing2

(1.Chengde Medical University, Chengde 067000, China;2.BethuneInternationalPeaceHospital,Shijiazhuang050082,China)

Abstract:We aimed to establish a rapid, simple and visualized nucleic acids detection method for enteric adenovirus in children by loop-mediated isothermal amplification(LAMP). Firstly, we logged in GenBank and downloaded the hexon genetic region of adenovirus genotypes 40 and 41. Four LAMP primers were designed according to its conserved region. The amplification was completed by incubating all reagents in an EP tube under the isothermal condition (65 ℃) for 60 min. Then, the specificity and sensitivity of LAMP method were evaluated by both gel electrophoresis and calcein-stain methods, and the results of the method were compared with that of PCR. At last, A total of 40 specimens collected from suspicious children were simultaneously detected by both LAMP and PCR methods, statistically significant analysis was evaluated by using chi-square test. Results showed that LAMP method could accurately identify adenovirus genotypes 40 and 41, and the results of digestive production by restriction enzyme were right as well, which showed good specificity. The sensitivity of LAMP method was about tenfold higher than that of PCR. After detection of 40 clinical samples, non-specific products could not be detected by LAMP and PCR methods. Compared with PCR, LAMP exhibited 92.5% (P>0.05) identity during the detection of enteric adenovirus without the missing of positive samples. In addition, the calcein-stain method for products detection showed good visibility and simplicity. In conclusion, our study established a rapid, simple and visualized detection method for enteric adenovirus by LAMP, which has some practical value in primary care hospitals.

Keywords:enteric adenovirus; loop-mediated isothermal amplification(LAMP); children

全軍醫(yī)藥衛(wèi)生科研基金項(xiàng)目(No.CBJ14C010)資助

劉金霞，Email：1158210524@qq.com

Supported by the Medicine and Hygiene Research Foundation of the Whole Army (No. CBJ14C010)