精異丙甲草胺脅迫下煙草根際土壤微生物的動(dòng)態(tài)響應(yīng)及其降解

侯少鋒++李榮玉++尹顯慧+龍友華++吳小毛

摘要：為了探明除草劑在煙草根際的降解與其根際微生物數(shù)量之間的關(guān)系，揭示煙草根際環(huán)境中除草劑快速降解的機(jī)制，采用室內(nèi)模擬法研究精異丙甲草胺脅迫下煙草根際土壤微生物的動(dòng)態(tài)響應(yīng)及其降解動(dòng)態(tài)。結(jié)果表明：在整個(gè)試驗(yàn)周期內(nèi)，無論是處理土壤，還是對(duì)照土壤，根際土壤微生物區(qū)系數(shù)量、土壤呼吸作用均高于非根際土壤，存在明顯的根際效應(yīng)；真菌是精異丙甲草胺脅迫下的優(yōu)勢菌群，能夠在該除草劑污染的根際土壤中旺盛生長；精異丙甲草胺在煙株根際土壤中更容易降解，與非根際土壤相比，根際土壤中精異丙甲草胺的降解速率提高了1.23倍，半衰期縮短了18.77%。

關(guān)鍵詞：精異丙甲草胺；煙草根際；微生物；降解；動(dòng)態(tài)響應(yīng)；非根際土壤

中圖分類號(hào)： S154.3文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2016）06-0493-03

收稿日期：2016-02-01

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（編號(hào)：21267007）；中國煙草總公司貴州省公司科技項(xiàng)目專項(xiàng)[編號(hào)：201311，編號(hào)：201414]；貴州省煙草公司畢節(jié)市公司項(xiàng)目（編號(hào)：BJYC-201304）。

作者簡介：侯少鋒（1987—），男，河北唐山人，碩士研究生，主要從事農(nóng)藥環(huán)境毒理學(xué)及農(nóng)產(chǎn)品安全評(píng)價(jià)研究。Tel：（0851）88297830；E-mail：460912660@qq.com。

通信作者：吳小毛，博士，副教授，主要從事農(nóng)藥環(huán)境毒理學(xué)及農(nóng)產(chǎn)品安全評(píng)價(jià)研究。Tel：（0851）88297830；E-mail：wuxm827@126.com。植物根際是根與土壤環(huán)境相互耦合的生態(tài)與環(huán)境界面，是一個(gè)較為特殊的微生態(tài)環(huán)境，由于其中的微生物活動(dòng)非常旺盛，能加快土壤中有機(jī)化合物的分解及其他礦質(zhì)元素的活化，根際環(huán)境，特別是有機(jī)污染物脅迫下的根際環(huán)境與一般土體存在顯著差別[1]。由于植物根系脫落物及根系分泌作用的存在，根際環(huán)境中pH值、Eh（氧化還原電位）、養(yǎng)分狀況的變化，將直接影響微生物組成、酶活性等物理、化學(xué)及生物學(xué)特性[2]。根際—土壤界面決定了污染物降解的過程遠(yuǎn)較一般土體復(fù)雜，有關(guān)污染物在根—土界面的形態(tài)及毒性變化的研究一直是環(huán)境科學(xué)研究的熱點(diǎn)，但目前相關(guān)的研究主要集中于重金屬及有機(jī)污染物方面[3-7]。

精異丙甲草胺（S-metolachlor）別稱（S）-異丙甲草胺，是一種酰胺類除草劑，其化學(xué)名為2-氯-N-（2-乙基-6-甲基苯基）-N-[（1S）-2-甲氧基-1-甲基乙基]乙酰胺。精異丙甲草胺是一種選擇性芽前土壤處理藥劑，其主要作用機(jī)理為抑制發(fā)芽的雜草種子蛋白質(zhì)的合成，其次是抑制膽堿類物質(zhì)滲入磷脂，干擾卵磷脂的形成。精異丙甲草胺的殺草譜非常廣范，其主要防除對(duì)象為一年生的單子葉雜草、部分闊葉雜草和莎草，并被廣泛應(yīng)用于玉米、馬鈴薯、水稻、大豆、煙草、蔬菜等多種作物的田間除草[8-11]。目前有關(guān)精異丙甲草胺脅迫下土壤微生物生態(tài)效應(yīng)及其降解動(dòng)態(tài)的研究較少，筆者選用煙株根際土壤為基質(zhì)，采用室內(nèi)模擬培養(yǎng)的方法，研究精異丙甲草胺脅迫下煙草植株根際微生物的動(dòng)態(tài)變化及根際微生物對(duì)其降解潛力。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1土壤在花溪煙草種植試驗(yàn)地中，采集以煙草K326煙株為中心、15 cm半徑范圍的整個(gè)土塊，將抖落大塊土壤后的煙株根系連同與之緊密黏附的土壤置于保鮮袋中，帶回實(shí)驗(yàn)室，仔細(xì)刷下并收集黏附于煙株根系的土壤，風(fēng)干，過1 mm篩，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2藥品及試劑精異丙甲草胺標(biāo)準(zhǔn)品[≥ 97.7%，85%（S）isomer]，購自美國迪馬科技有限公司。甲醇為色譜純，其他試劑為分析純。

1.1.3主要儀器設(shè)備6 890N氣相色譜（帶μECD檢測器）、HP-5石英毛細(xì)管柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm，美國Agilent）、AL104分析天平（瑞士梅特勒）、YX-208B滅菌鍋（上海三申醫(yī)療器械有限公司）、SW-CJ-1FD超凈工作臺(tái)（杭州錢江儀器設(shè)備有限公司）、SHZ-82恒溫振蕩器（常州澳華儀器有限公司）、RE-52A型旋轉(zhuǎn)濃縮蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）、 CH20生物顯微鏡[奧林巴斯（中國）有限公司]、BIC-300人工氣候培養(yǎng)箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司）。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1土壤微生物區(qū)系的動(dòng)態(tài)響應(yīng)試驗(yàn)分別稱取500 g根際、非根際土樣置于1 000 mL燒杯中，加入含精異丙甲草胺的甲醇溶液，使除草劑濃度均為6 mg/kg，待甲醇揮發(fā)后攪拌均勻，用蒸餾水調(diào)節(jié)濕度至土壤最大持水量的60%。土樣于25 ℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)60 d，每個(gè)處理均設(shè)置3次重復(fù)，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照（CK），試驗(yàn)期間定時(shí)稱質(zhì)量補(bǔ)足水分含量。于1、3、7、14、21、30、45、60 d定時(shí)取樣測定，微生物計(jì)數(shù)采用固體平板梯度稀釋涂布培養(yǎng)計(jì)數(shù)法，細(xì)菌用牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)，真菌用馬丁氏培養(yǎng)基培養(yǎng)，放線菌用改良高氏1號(hào)培養(yǎng)基培養(yǎng)[12]。

1.2.2土壤呼吸作用測定采用直接吸收法測定[13]。稱取50 g土樣、1 g葡萄糖于100 mL燒杯中，加入少量水濕潤土壤后于25 ℃恒溫箱中避光培養(yǎng)7 d，然后添加含精異丙甲草胺的甲醇溶液并使其濃度分別為1、3、6、9、12 mg/kg。待甲醇揮發(fā)后攪拌均勻，用蒸餾水調(diào)節(jié)濕度至土壤最大持水量的60%，將裝有土樣的燒杯與盛有40 mL 0.2 mol/L NaOH的小燒杯一起置于密閉容器中，每個(gè)處理3次重復(fù)，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照（CK），恒溫培養(yǎng)60 d，定期取出NaOH溶液用0.4 moL/L HCl溶液滴定，同時(shí)換入新鮮的NaOH溶液，繼續(xù)培養(yǎng)。根據(jù)HCl溶液的消耗量計(jì)算100 g干土的CO2釋放量。在整個(gè)試驗(yàn)階段適時(shí)補(bǔ)水，以保持土壤含水量恒定。

1.2.3在根際土壤中的降解試驗(yàn)分別稱取20 g根際、非根際土樣于100 mL錐形瓶中，加入含精異丙甲草胺的甲醇溶液，使其濃度均為6 mg/kg，待溶劑揮發(fā)后攪拌均勻，加入適量無菌蒸餾水，使含水量為田間最大持水量的60%，土樣于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)黑暗培養(yǎng)，每個(gè)處理均設(shè)3次重復(fù)，在整個(gè)試驗(yàn)階段適時(shí)稱質(zhì)量補(bǔ)水，以保持土壤含水量恒定。于0、7、14、30、60 d后取樣，采用液相色譜法測定精異丙甲草胺的殘留量[14]。

2結(jié)果與分析

2.1細(xì)菌的動(dòng)態(tài)響應(yīng)

由圖1可見，在整個(gè)試驗(yàn)期內(nèi)，根際土細(xì)菌數(shù)量均高于非根際土；與非根際土相似，經(jīng)精異丙甲草胺處理的根際土壤，細(xì)菌的生長開始被抑制，到一定時(shí)間后被促進(jìn)。在試驗(yàn)前期（1～7 d），與對(duì)照土壤相比，施用精異丙甲草胺處理后，根際與非根際土壤細(xì)菌的生長基本受到抑制，在培養(yǎng)1 d時(shí)抑制作用達(dá)到最大值。隨后，各處理的抑制作用逐漸減弱，其中精異丙甲草胺在培養(yǎng)7 d時(shí)對(duì)根際土壤細(xì)菌生長的抑制效應(yīng)消失，開始促進(jìn)細(xì)菌生長，且促進(jìn)效應(yīng)一直繼續(xù)到試驗(yàn)結(jié)束，并且細(xì)菌數(shù)量均顯著高于對(duì)照土壤（P<0.05）。經(jīng)精異丙甲草胺處理的根際、非根際土壤的細(xì)菌數(shù)量在21 d到達(dá)最大值，其中處理根際土壤細(xì)菌數(shù)量比對(duì)照根際土壤增加了2815%，而處理非根際土壤細(xì)菌數(shù)量比對(duì)照土壤增加了780%，此時(shí)處理根際土壤細(xì)菌數(shù)量是處理非根際土壤的111倍，即處理土壤的根際效應(yīng)R/S（1 g根際土壤中所含微生物數(shù)量與非根際土壤的相應(yīng)值之比）為1.11，而對(duì)照土壤的根際效應(yīng)R/S為1.06，差異均達(dá)到顯著水平（P<0.05）。

2.2真菌的動(dòng)態(tài)響應(yīng)

從圖2可以看出，精異丙甲草胺對(duì)根際與非根際土壤真菌的生長一直表現(xiàn)為促進(jìn)作用，30～60 d內(nèi)，真菌數(shù)量均明顯高于對(duì)照土壤。精異丙甲草胺處理土壤的真菌數(shù)量在14 d時(shí)到達(dá)最大值，其中根際土壤真菌數(shù)量比對(duì)照土壤增加了39.14%，相應(yīng)的非根際土壤真菌數(shù)量比對(duì)照土壤增加了2953%，此時(shí)處理土壤的根際效應(yīng)R/S也達(dá)到峰值，為114，對(duì)照土壤的根際效應(yīng)R/S為1.08，差異均達(dá)到顯著水平（P<0.05）。在整個(gè)試驗(yàn)周期內(nèi)，無論是處理土壤還是對(duì)照土壤，根際土中的真菌數(shù)量均要高于非根際土，但在試驗(yàn)后期（45～60 d），根際與非根際土壤的真菌數(shù)量之間不存在明顯差異。

2.3放線菌的動(dòng)態(tài)響應(yīng)

由圖3可知，在培養(yǎng)期間，根際土壤放線菌數(shù)量均高于非根際土壤；精異丙甲草胺對(duì)放線菌生長的影響為抑制—恢復(fù)—刺激。處理1～14 d，與對(duì)照土壤相比，精異丙甲草胺處理下的放線菌生長受到抑制，1 d時(shí)抑制作用最大，根際土壤的最大抑制率為14.51%，非根際土壤的抑制率為1432%。精異丙甲草胺處理根際土壤的放線菌數(shù)量在14 d時(shí)達(dá)到峰值，此時(shí)，處理土壤的根際效應(yīng)R/S也達(dá)到最大值，為1.07，差異也達(dá)顯著水平（P<0.05）。14 d后抑制作用逐漸減弱，其中精異丙甲草胺處理的根際土壤放線菌數(shù)量在21 d時(shí)恢復(fù)到對(duì)照水平，30 d時(shí)開始促進(jìn)放線菌生長，且促進(jìn)作用一直繼續(xù)到試驗(yàn)結(jié)束，但差異明顯。在整個(gè)試驗(yàn)周期內(nèi)，無論是處理土壤還是對(duì)照土壤，根際土中的放線菌數(shù)量均要高于非根際土。

2.4對(duì)根際土壤呼吸作用的影響

如圖4所示，與非根際土相似，施用除草劑對(duì)根際土壤呼吸均有一定的刺激作用，在3 d時(shí)，土壤呼吸強(qiáng)度達(dá)到了最高值，精異丙甲草胺處理的根際土壤呼吸強(qiáng)度比對(duì)照土壤增加了18.82%，相應(yīng)的非根際土壤呼吸強(qiáng)度比對(duì)照土壤增加了15.41%，處理根際比處理非根際土增加了15.32%，即處理土壤的根際效應(yīng)R/S為1.15，對(duì)照土壤的根際效應(yīng)R/S為112，差異均達(dá)到顯著水平（P<0.05）。隨后精異丙甲草胺對(duì)根際土壤呼吸的刺激作用逐漸減弱。45 d時(shí)，精異丙甲草胺處理根際土壤的呼吸在7～60 d內(nèi)繼續(xù)保持刺激狀態(tài)，而非根際土壤的呼吸強(qiáng)度在45 d時(shí)基本與對(duì)照持平。在整個(gè)試驗(yàn)周期內(nèi)，根際土壤呼吸強(qiáng)度均高于非根際土壤。

2.5在根際土壤中的降解動(dòng)態(tài)

由圖5可知，在培養(yǎng)60 d，根際土壤中精異丙甲草胺的降解率為86.67%，而在非根際土壤中的降解率僅為80.33%，差異均達(dá)到顯著水平（P<0.05）。精異丙甲草胺除草劑在根際土壤中的降解也可用一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程模擬（表1），根際土壤中精異丙甲草胺的降解速率常數(shù)為0.032 3，相應(yīng)的半衰期為21.5 d；非根際土壤中精異丙甲草胺的降解速率常數(shù)為0.026 4，相應(yīng)的半衰期為26.3 d。與非根際土壤相比，根際土壤中精異丙甲草胺的降解速率常數(shù)提高了1.22倍，半衰期縮短了18.25%。綜合精異丙甲草胺脅迫下根際土壤微生物種群數(shù)量變化，根際微生物具有加快除草劑降解的潛力，表明植物種植可能是實(shí)現(xiàn)土壤農(nóng)藥污染治理的一種有效途徑。

3結(jié)論與討論

微生物是根際微域中最活躍的生物相，其在有機(jī)物根際污染生態(tài)系統(tǒng)中的作用尤為重要。本研究表明，在整個(gè)試驗(yàn)周期內(nèi)，無論是處理土壤還是對(duì)照土壤，根際土壤微生物區(qū)系數(shù)量、土壤呼吸作用均高于非根際土土壤，存在明顯的根際效應(yīng)。所研究的除草劑精異丙甲草胺在煙株根際土壤中更容易降解，與非根際土壤相比，根際土壤中精異丙甲草胺的半衰期縮短了18.77%，降解速率提高了1.23倍。同時(shí)，精異丙甲草胺對(duì)細(xì)菌、真菌和放線菌的影響不同：細(xì)菌是先抑制后促進(jìn)，真菌是持續(xù)促進(jìn)，放線菌是抑制—恢復(fù)—刺激。真菌是精異丙甲草胺脅迫下的優(yōu)勢菌群，均能夠在除草劑污染的根際土壤中旺盛生長。這說明土壤真菌在精異丙甲草胺的馴化作用下大多都具備了耐受除草劑的能力或者部分敏感菌群趨于消亡而耐受菌群能夠旺盛生長。本研究初步探討了精異丙甲草胺對(duì)煙草根際土壤微生物的影響及其降解動(dòng)態(tài)，有關(guān)精異丙甲草胺對(duì)土壤酶活性的毒性效應(yīng)方面有待進(jìn)一步研究。

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