SD大鼠顱縫細胞不同時期GPC3基因表達變化的研究

張策　沈映勛　曹德君

·論著·

SD大鼠顱縫細胞不同時期GPC3基因表達變化的研究

張策沈映勛曹德君

【摘要】目的探索GPC3基因在顱縫組織和細胞中不同時期的表達情況，為后續(xù)的疾病模型研究提供參照。方法研究并觀察1 d、3 d、7 d的SD大鼠顱縫細胞組織，應(yīng)用組織切片免疫熒光染色、RT-qPCR、Western Blot等方法，檢測其在不同年齡SD大鼠中的表達水平，判斷其與顱骨成骨及顱縫閉合的關(guān)系。結(jié)果免疫熒光顯示，GPC3在大鼠未閉合顱縫組織不同階段胞內(nèi)、細胞表面及胞外均有表達；RT-qPCR、Western Blotting結(jié)果顯示，GPC3基因表達隨著大鼠年齡增長呈現(xiàn)下降趨勢。結(jié)論SD大鼠中，GPC3與顱縫閉合密切相關(guān)。

【關(guān)鍵詞】顱縫細胞SD大鼠磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3

約1/2 500的新生嬰幼兒中會出現(xiàn)一條或者多條顱縫提早閉合的現(xiàn)象，稱為顱縫早閉癥[1]，其發(fā)病率僅次于唇腭裂畸形。因為顱縫提前發(fā)生骨性閉合，會產(chǎn)生一系列臨床表現(xiàn)，如顱腔狹小、顱面骨畸形、顱內(nèi)壓增高等，以及一些復(fù)雜的顱頜面畸形綜合征，如Crounzon綜合征、Apert綜合征等。嚴重者可引起腦發(fā)育受阻及智力發(fā)育障礙，嚴重影響患兒的正常發(fā)育、生理功能，甚至危及生命。目前，針對顱縫早閉癥的治療僅有手術(shù)一種方法，但風(fēng)險高、費用高，且效果不理想。因此，亟需開展顱縫發(fā)育過程中調(diào)控機制與機理的研究，為探尋更好的治療方法奠定基礎(chǔ)。

顱縫早閉癥是一類由相關(guān)基因突變導(dǎo)致的疾病，其中約有20%已經(jīng)確認了相關(guān)發(fā)病基因：FGFR2突變 （Apert、Crouzon和Pfeiffer綜合征），F(xiàn)GFR3突變 （Muenke綜合征），MSX2（Boston型綜合征），TWIST1（Saethre-Chotzen綜合征）等。Coussens等[2]發(fā)現(xiàn)，除 FGFR1～3等，還包括一系列與顱骨發(fā)育、顱縫閉合（成骨分化、轉(zhuǎn)錄、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、骨塑形、細胞周期、細胞凋亡）相關(guān)的新基因。研究表明，受累顱縫與正常顱縫相比，視黃醇結(jié)合蛋白-4（RBP4）、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3（GPC3）、C1Q腫瘤壞死因子相關(guān)蛋白-3（C1QTNF3）均表達下調(diào)，其中GPC3下調(diào)7倍，提示GPC3基因在顱骨發(fā)育、顱縫閉合中可能存在調(diào)控作用。

GPC3，為蛋白聚糖（PGs）家族成員之一。蛋白聚糖作為細胞外基質(zhì)主要成分之一，是一種大分子物質(zhì)，可以結(jié)構(gòu)性及功能性調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化及基因表達。PGs由核心蛋白及一個或者多個葡糖氨基葡聚糖側(cè)鏈組成，可以分為硫酸肝素PGs（HSPGs）、硫酸皮膚素或軟骨素PGs（CSPGs）及硫酸角蛋白PGs。其中CSPGs大部分定位在細胞外基質(zhì)中，而HSPGs常為膜性蛋白聚糖。HSPGs可以和許多配體發(fā)生直接作用，包括一些生長因子和成形素，如Wnts、BMPs、VEGFs等，以及相應(yīng)的受體。HSPGs還可與細胞外結(jié)構(gòu)及黏附性分子，如膠原蛋白、纖維蛋白及層黏連蛋白等發(fā)生作用。GPCs還可通過成對堿性氨基酸蛋白酶剪切位點的剪切，或GPI錨定作用的去除，進入到細胞外基質(zhì)中，并發(fā)揮作用。GPC3就是一種膜性硫酸肝素蛋白聚糖，包含核心蛋白、硫酸乙酰肝素鏈 （HS）和糖基化磷脂酰肌醇（GPI），GPC蛋白通過GPI錨定于細胞外膜上。GPC3在哺乳動物的胚胎期，可通過影響多個信號通路而對組織器官的發(fā)生和生長發(fā)揮重要調(diào)控作用，目前的研究主要集中在基因與肝細胞癌的相關(guān)性[3]。

為明確GPC3在顱骨發(fā)育調(diào)控中的作用，以及突變后發(fā)生顱縫早閉癥的機制，本實驗以SD大鼠為模型，研究GPC3基因在顱縫組織和細胞中不同時期的表達情況，為后續(xù)的疾病模型研究提供參照。

1　材料與方法

1.1實驗動物及材料

出生1 d、3 d和7 d的SD大鼠，低糖DMEM （Hyclone，美國），胎牛血清（Biowest，法國），Ⅳ型膠原蛋白酶（SERVA，德國），胰蛋白酶-EDTA、Trizol液（Invitrogen，美國），M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶及相關(guān)試劑（Promega，美國），大鼠 GPC3抗體（abcam，英國），EDTA（pH8.0）抗原修復(fù)液（武漢谷歌生物公司），氯仿，異丙醇等。

1.2主要儀器及設(shè)備

倒置相差顯微鏡（Leica公司，德國），光學(xué)顯微鏡（Olympus，日本），PCR儀（Eppendorf，德國），高速離心機 （Eppendorf，德國），凝膠成像分析儀（Syngene，英國），倒置熒光顯微鏡（NIKON ECLIPSE TISR，日本），成像系統(tǒng)（NIKON DS-U，日本）。

1.3方法

1.3.1免疫熒光

分別取出生1 d、3 d和7 d的SD大鼠，處死后置于75%乙醇溶液中浸泡10 min，無菌條件下切取顱蓋骨，剝離硬腦膜，取顱骨矢狀縫及冠狀縫周圍1.5 mm組織，盡量去除骨性組織后，加入4%多聚甲醛固定，脫水、透蠟、包埋、切片、脫蠟，制作石蠟切片。切片置于盛滿EDTA抗原修復(fù)緩沖液（pH 8.0）的修復(fù)盒中，于微波爐內(nèi)進行抗原修復(fù)。切片稍甩干后用3%BSA均勻覆蓋組織，室溫封閉30 min。輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加一抗，濕盒內(nèi)4℃孵育過夜。PBS洗滌3次，每次5 min。切片稍甩干后，滴加二抗覆蓋組織，避光室溫孵育50 min。PBS洗滌3次，每次5 min。甩干，滴加DAPI染液，避光室溫孵育10 min。PBS洗滌3次，每次5 min。甩干后用抗熒光淬滅，封片劑封片。倒置熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.3.2原代細胞獲取及培養(yǎng)

以上述相同方法，取顱骨矢狀縫及冠狀縫周圍1.5 mm組織，盡量去除骨性組織后剪碎，放入約10倍體積的0.2%Ⅳ型膠原蛋白酶中，37℃，5 h；100目濾網(wǎng)過濾，獲得細胞懸液，1 500 r/min離心3 min，棄上清液。10 mL完全培養(yǎng)液（DMEM+10FBS+ 1%雙抗）重懸細胞，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每3天換液一次，1周后胰蛋白酶消化，按1×104cells/cm2傳代接種。

1.3.3RT-qPCR

取傳種后第1代細胞，使用Trizol裂解，實驗操作參照Invitrogen Trizol使用說明，用紫外分光光度計檢測RNA濃度及純度。將所得RNA逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA模板，使用qPCR法定量分析，每個反應(yīng)重復(fù)3次（表1）。

表1　引物序列Table 1　Primer Sequence

1.3.4Western-Blot

取部分原代細胞1 500 r/min離心后去上清液，加入細胞裂解液，4℃、12 000 g離心3 min，留取上清液后用Lowry法定量蛋白，完成電泳后，依次加入封閉液、抗rat GPC3抗體、二抗稀釋液，然后用化學(xué)發(fā)光劑反應(yīng)后顯影定影。

1.4統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用Graphpad Prism6軟件行單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1GPC3在不同年齡SD大鼠顱縫組織中的表達結(jié)果顯示，在1 d、3 d、7 d的顱縫組織中，胞內(nèi)、

細胞表面及胞外均有GPC3表達，GPC3熒光的表達強度隨著大鼠年齡的增加逐步減弱（圖1）。2.2GPC3基因表達程度隨SD大鼠年齡的變化

圖1　不同年齡SD大鼠中GPC3的免疫熒光檢測（40×）Fig.1　Immunofluorescence of GPC3 in SD rat of different age (40×)

RT-qPCR結(jié)果顯示，隨著SD大鼠年齡增大，即隨著顱縫逐漸閉合，顱縫組織細胞中GPC3基因的表達水平明顯降低，其中1 d的SD大鼠顱縫細胞的GPC3基因表達量與3 d的SD大鼠細胞存在統(tǒng)計學(xué)差異 （P<0.05），3 d與7 d的SD大鼠細胞存在明顯差異（P<0.01）（圖2）。

圖2　RT-qPCR檢測不同年齡SD大鼠顱縫細胞GPC3的相對基因表達量Fig.2　The relative mRNA amount of GPC3 in SD rat of different age detected by RT-qPCR

Western Blot結(jié)果顯示，隨著SD大鼠年齡增大，即隨著顱縫逐漸閉合，GPC3在顱縫細胞中的表達量逐漸降低，其中3 d與7 d的SD大鼠的顱縫細胞存在統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05），但1 d與3 d的SD大鼠的顱縫細胞無統(tǒng)計學(xué)差異（圖3）。

圖3　Western Blot檢測不同年齡SD大鼠GPC3的表達Fig.3　The expression of GPC3 in SD rat of different age detected by Western Blot

3　討論

本研究中，我們首先應(yīng)用免疫熒光技術(shù)來確定GPC3基因在大鼠顱縫組織中的表達位置。通過熒光圖像發(fā)現(xiàn)，GPC3基因在1 d、3 d、7 d的SD大鼠顱縫組織中均有表達，且在胞內(nèi)、細胞表面及細胞外基質(zhì)中均檢測到GPC3，說明GPC3的生理作用可能不僅限于錨定在細胞表面，解錨定后，GPC3進入細胞外基質(zhì)中可能也會發(fā)揮相應(yīng)的作用，具體機制仍有待探索。

我們應(yīng)用RT-qPCR和Western Blot技術(shù)分別從轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平，來確定GPC3隨著SD大鼠年齡增加的表達情況。RT-qPCR結(jié)果顯示，隨著SD大鼠年齡增加，GPC3基因的表達量明顯下降，且第3天到第7天的下降程度明顯較第1天到第3天的程度大，這與SD大鼠的顱縫閉合趨勢是相符合的。Western Blot的結(jié)果也從蛋白水平上基本驗證了這個結(jié)果。因此，我們判斷，GPC3基因的表達與顱縫閉合存在非常緊密的聯(lián)系，該基因在顱縫成骨的過程中可能扮演了非常重要的角色。

GPCs（磷脂酰肌醇蛋白聚糖類）為HSPGs家族成員之一，是一種生長因子通路的調(diào)節(jié)因子，一般通過糖基化磷酯酰肌醇錨定于細胞膜。解開錨定，脫離細胞膜后，即成為游離態(tài)的GPCs，同樣也會產(chǎn)生一定的生理功能。其在細胞的主要信號通路，如BMP信號通路、FGF信號通路、HH信號通路以及WNT信號通路中，都有其特定的效應(yīng)。因此，該類蛋白在生長發(fā)育和穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)中均有重要的作用[4]。

Pilla等[5]報道了GPC3基因突變所導(dǎo)致的X連鎖遺傳?。哼^度生長和畸變綜合征（SGBS）。Cano-Gauci等[6]發(fā)現(xiàn)，敲除小鼠GPC3基因的第一個外顯子后，其體內(nèi)無法檢測到GPC3基因的mRNA的表達，并出現(xiàn)典型的SGBS的臨床表現(xiàn)，包括圍產(chǎn)期死亡、過度生長發(fā)育、多囊腎、腎發(fā)育不全及肺部異常發(fā)育等。

GPC3在細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中有著重要的作用，目前的研究對于其與BMP信號通路的關(guān)系研究比較明確。骨形成蛋白（BMPs）是促進骨形成的重要蛋白。BMPs信號通道中的效應(yīng)器轉(zhuǎn)錄因子MSX2，發(fā)生基因突變可導(dǎo)致Boston-type顱縫早閉。兔動物模型研究顯示，高濃度的BMP2可導(dǎo)致顱縫過早閉合[7]。因此，BMPs及其信號通道是明確顱縫早閉發(fā)病機制的重要研究方向之一。文獻提示，GPC3參與調(diào)節(jié)骨形成蛋白（BMPs）及其信號通道。Dwivedi等[8]發(fā)現(xiàn)，GPC3在顱縫區(qū)表達，而在顱縫過早閉合的患兒顱縫區(qū)表達是下降的。此外，GPC1和GPC3同時表達于顱縫細胞表面并釋放入細胞外基質(zhì)。同時表達的GPC1與GPC3可抑制BMP2、BMP4和BMP7的活性，消除GPC1和GPC3活性可增強BMP2活性。相反，使GPC1和GPC3過表達或者在培養(yǎng)體系中添加GPC1或GPC3，可阻止BMP2信號通道及BMP2調(diào)節(jié)的成骨分化。該結(jié)果表明，GPC3對BMPs信號通道具有負向調(diào)節(jié)作用。而Dejima等[9]的研究則表明，GPCs對BMPs信號通道具有正向調(diào)節(jié)作用。無論是體內(nèi)還是體外實驗均顯示，果蠅的GPCs可增強BMPs信號通道。這兩種矛盾的結(jié)果可能是由于物種的不同所導(dǎo)致的，但都表明了GPCs參與BMPs信號通道的調(diào)節(jié)。另外，通過對GPC3基因敲除小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，GPC3與BMP4在骨發(fā)育中具有相互作用[10]，與BMP2、BMP7在腎形態(tài)發(fā)育中具有相互作用類似[11-12]。關(guān)于GPC3在FGF、WNT信號通路中的作用，目前僅有少量研究。Midorikawa等[13]發(fā)現(xiàn)，GPC3在肝癌細胞中，與FGF2相互作用，并抑制FGF信號通路；Lai等[14]發(fā)現(xiàn)，GPC3在肝癌細胞中增強經(jīng)典WNT信號通路并促進肝癌細胞生長。但是，對于小鼠乳腺腺癌細胞的研究發(fā)現(xiàn)，GPC3抑制經(jīng)典WNT信號通路，增強非經(jīng)典WNT信號通路[15]。因此，GPC3在FGF信號通路和WNT信號通路中的作用機制仍然需要進一步的探索研究。

本實驗初步闡明了GPC3基因在SD大鼠顱縫發(fā)育過程中的表達趨勢，結(jié)合Coussens等的研究結(jié)果，我們推斷，GPC3的低表達可能與顱縫早閉的發(fā)生與發(fā)展存在密切的聯(lián)系，對于其在顱縫早閉癥中的具體作用與機制仍然需要進一步的實驗探索。

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【中圖分類號】R622

【文獻標識碼】A

【文章編號】1673－0364（2016）03－0163－04

doi:10.3969/j.issn.1673-0364.2016.03.005

作者單位：200011上海市上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院整復(fù)外科。

通訊作者：曹德君（E-mail：dejuncao@163.com）。

收稿日期：（2016年4月15日；修回日期：2016年6月8日）

Expression of GPC3 in Cranial Suture Cells of Different Stages of Rats

ZHANG Ce,Shim Yoong-hoon,CAO Dejun. Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China.Corresponding author:CAO Dejun(E-mail:dejuncao@163.com).

【Abstract】ObjectiveTo explore GPC3 expression in cranial suture tissues and cells of different stages,and to provide reference for later research in disease models.MethodsThe cranial suture tissues and cells of 1 d,3 d,7 d SD rats were observed.The expression level of GPC3 were analyzed by immune-histofluorescence staining,RT-qPCR and Western Blot to judge the relationship between GPC3 expression and calvarial osteogenesis/fusion of cranial sutures.ResultsGPC3 was expressed in all stages of unfused rat cranial suture tissues by immune-histofluorescence staining.Results of RT-qPCR and Western Blot showed a descending trend of GPC3 expression with the age increasing.ConclusionIn SD rats,GPC3 has a close relationship with fusion of cranial sutures.

【Key words】Cranial suture cells;SD rats;GPC3