MSCs在缺氧狀態(tài)下的基因差異性表達(dá)

徐梁　白珊珊　段惠川　余東

MSCs在缺氧狀態(tài)下的基因差異性表達(dá)

徐梁白珊珊段惠川余東

【摘要】目的探討MSCs在缺氧環(huán)境中細(xì)胞生物學(xué)特性及相關(guān)生長(zhǎng)因子的變化，為修復(fù)組織損傷提供臨床應(yīng)用依據(jù)。方法體外進(jìn)行MSCs缺氧處理，免疫熒光染色觀察細(xì)胞特性，RT-PCR檢測(cè)VEGF、bFGF、TGF-β和IL-1α基因，從細(xì)胞分化、生長(zhǎng)因子和細(xì)胞信號(hào)通路等方面，來(lái)探討MSCs在缺氧環(huán)境下發(fā)生的轉(zhuǎn)變。結(jié)果MSCs經(jīng)1%O2缺氧培養(yǎng)24 h后，鏡下觀察示細(xì)胞成活良好，未見(jiàn)形態(tài)、生長(zhǎng)方式等發(fā)生明顯變化。免疫熒光及雙熒光染色觀察缺氧處理24 h的MSCs有向內(nèi)皮細(xì)胞，特別是血管內(nèi)皮轉(zhuǎn)化的趨勢(shì)。VEGF、bFGF、TGF-β和IL-1α在缺氧處理后的MSCs中表達(dá)均增強(qiáng)，而未經(jīng)缺氧處理的MSCs相關(guān)因子表達(dá)微弱。結(jié)論在缺氧的環(huán)境下，MSCs可向血管內(nèi)皮細(xì)胞方向分化，并且與促進(jìn)血管形成和生長(zhǎng)相關(guān)的VEGF、bFGF、TGF-β和IL-1α基因表達(dá)均增強(qiáng)，可直接或間接促進(jìn)損傷組織的血管化。

【關(guān)鍵詞】間充質(zhì)干細(xì)胞基因表達(dá)血管化缺氧培養(yǎng)

間充質(zhì)干細(xì)胞 （Mesenchymal stem cells，MSCs）是具有自我更新與多向分化潛能的成體干細(xì)胞，可分化為骨、軟骨、肌肉、脂肪、真皮、神經(jīng)等多種組織，干細(xì)胞移植可廣泛應(yīng)用于各種組織損傷，包括心肌缺血及缺血再灌注損傷[1]、急性腎衰竭[2]、肺損傷[3]、皮瓣修復(fù)[4]等。早期研究發(fā)現(xiàn)，組織損傷所造成的缺

1　材料與方法

1.1材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：4周齡的Wistar雄性大鼠，體質(zhì)量約200 g（中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）。

試劑：DMEM-LG培養(yǎng)液（Gibco，美國(guó)）；PBS、FBS （HYCLONE，美國(guó)）；胰酶、FITC-UEA-1（Sigma，美國(guó)）；青霉素，鏈霉素（Gibco，美國(guó)）；RT-PCR試劑盒（Takara，日本）；引物合成（上海博邁生物技術(shù)公司）；FITC、PE、CD45，CD90（eBioscience，美國(guó)）；Ⅷ因子（Abcam，美國(guó)）；DiI-ac-LDL（Molecular Probes，美國(guó)）。

儀器：低氧培養(yǎng)箱（Binder，德國(guó)）；定量PCR擴(kuò)增儀（Stratagene，美國(guó)）；熒光顯微鏡（Nikon，日本）。1.2方法

1.2.1MSCs的分離、培養(yǎng)與傳代

4周齡Wistar雄性大鼠處死后，75%乙醇浸泡30 min；移至超凈臺(tái)中，無(wú)菌條件下獲取兩側(cè)股骨和脛骨，剔除軟組織。用2 mL注射器抽取DMEM-LG培養(yǎng)液，反復(fù)沖洗骨髓腔，沖出骨髓，所得懸液以200目鋼網(wǎng)過(guò)濾，置于50 mL離心管中，1 500 r/min離心5 min后棄上清，PBS（含2%FBS）5 mL重懸，充分吹打，將懸液緩慢地疊加到預(yù)先裝有5 mL Percoll細(xì)胞分離液（密度為1.077 g/mL）的15 mL離心管上層，2 200 r/min離心30 min，小心吸取分離介質(zhì)之間白色混濁帶，將其移入新的50 mL離心管中，加入PBS，震蕩混合均勻后，離心去上清，如此反復(fù)洗滌2遍。以DMEM-LG全培養(yǎng)基（含10%FBS，100 U/mL青霉素，100 U/mL鏈霉素）重懸，定容至10 mL，吸取30 μL細(xì)胞懸液與臺(tái)酚藍(lán)染液對(duì)比稀釋后，在計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù)并檢查細(xì)胞活力。

加入DMEM-LG全培養(yǎng)基，以5×106cells/mL密度接種于10 cm培養(yǎng)皿中，在37℃、5%CO2正常氧分壓的飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)原代培養(yǎng)，4 d后首次換液，去除非貼壁細(xì)胞，以后每2～3天換液1次。

細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到80%～90%融合時(shí)，進(jìn)行傳代，吸除培養(yǎng)液，PBS洗滌2遍，吸盡后加入約1 mL 0.05%胰酶消化液，鏡下觀察細(xì)胞出現(xiàn)收縮后，一般約在10 sec左右，加入含10%FBS的DMEM-LG培養(yǎng)液3 mL終止消化，以頭部裝有細(xì)膠管的細(xì)胞刮子輕輕地將培養(yǎng)皿底部的細(xì)胞刮下，收集在50 mL離心管中，1 500 r/min離心 5 min后棄上清，以DMEM-LG培養(yǎng)基重懸，定容至10 mL，吸取30 μL細(xì)胞懸液與臺(tái)酚藍(lán)染液對(duì)比稀釋后，在計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù)并檢查細(xì)胞活力。加入適量的DMEM-LG培養(yǎng)液，按1∶4的比例接種，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

在倒置相差顯微鏡下連續(xù)觀察MSCs的原代和傳代培養(yǎng)的貼壁時(shí)間、生長(zhǎng)特點(diǎn)、細(xì)胞形態(tài)、基質(zhì)分泌和融合程度。

1.2.2MSCs的鑒定

收獲第3代的MSCs，消化后過(guò)濾制成單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液中分別依次加入CD45、CD90。4℃環(huán)境下，避光，培育30 min，PBS沖洗后移入冰盒，進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.3細(xì)胞缺氧培養(yǎng)

取傳代24 h后的第3代的MSCs，置于37℃、5%CO2、1%O2、飽和濕度的缺氧培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。

1.2.4免疫學(xué)方法

進(jìn)行細(xì)胞的Ⅷ因子免疫組化，激光共聚焦熒光顯微鏡觀察細(xì)胞的Flk-1免疫熒光。

1.2.5雙熒光染色測(cè)定

分別取缺氧處理和正常培養(yǎng)的第3代MSCs消化傳代至24孔板中，24 h后進(jìn)行Dil-ac-LDL和FITC-UEA-1雙熒光染色。細(xì)胞在含10 μg/mL Dilac-LDL的培養(yǎng)液中避光孵育10 h，4%中性甲醛固定10 min，PBS漂洗，加10 μg/mL FITC-UEA-1避光孵育1 h。PBS再次漂洗，熒光顯微鏡觀察，顯示紅色熒光的為ac-LDL陽(yáng)性細(xì)胞，綠色熒光的為UEA-1陽(yáng)性細(xì)胞，雙熒光陽(yáng)性的細(xì)胞則為黃色。最后，為觀察細(xì)胞陽(yáng)性數(shù)，將細(xì)胞核染成藍(lán)色。

1.2.6RT-PCR檢測(cè)方法

分別抽提缺氧培養(yǎng)和正常培養(yǎng)的MSCs的總RNA。根據(jù)研究需要，確定需檢測(cè)的基因?yàn)椋篤EGF、bFGF、TGF-β和IL-1α。在GENEBANK查出其gi號(hào)和mRNA全序列。在Primer軟件上設(shè)計(jì)引物，引物設(shè)計(jì)完畢后，進(jìn)行BLAST驗(yàn)證，得出最佳引物（內(nèi)參為β-actin，長(zhǎng)度為592 bp）。PCR反應(yīng)后應(yīng)用Gel-Pro Imager Kit凝膠圖像處理系統(tǒng)在紫外光下觀察VEGF、bFGF、TGF-β、IL-1α的表達(dá)（表1）。

2　結(jié)果

2.1倒置顯微鏡觀察

MSCs經(jīng)1%O2的缺氧培養(yǎng)24 h，鏡下觀察細(xì)胞成活良好，未見(jiàn)形態(tài)、生長(zhǎng)方式等的明顯變化（圖1）。

2.2MSCs的流式細(xì)胞學(xué)鑒定

流式細(xì)胞鑒定所培養(yǎng)貼壁細(xì)胞為 CD45－、CD90＋，符合MSCs特點(diǎn)，細(xì)胞純度80%以上（圖2）。

2.3免疫組化及免疫熒光觀察

缺氧處理24 h的MSCs，其Ⅷ因子及Flk-1表達(dá)為陽(yáng)性，而正常培養(yǎng)的MSCs則未見(jiàn)表達(dá)，表明MSCs在缺氧的狀態(tài)下有向內(nèi)皮細(xì)胞，特別是血管內(nèi)皮轉(zhuǎn)化的趨勢(shì)（圖3，4）。

2.4雙熒光染色

Dil-ac-LDL和FITC-UEA-1雙熒光染色發(fā)現(xiàn)，缺氧處理的MSCs很多表現(xiàn)為雙熒光染色陽(yáng)性，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)紅加綠合成的黃色（圖5），而正常培養(yǎng)的第3代MSCs很少出現(xiàn)雙熒光陽(yáng)性表現(xiàn)。針對(duì)ac-LDL的吞噬功能是內(nèi)皮細(xì)胞的特點(diǎn)，雙熒光染色陽(yáng)性往往作為血管內(nèi)皮祖細(xì)胞的一個(gè)特性，結(jié)果提示MSCs在缺氧的環(huán)境下可能向血管內(nèi)皮祖細(xì)胞或血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行了分化。

2.5RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

選取VEGF、bFGF、TGF-β、IL-1α作為檢測(cè)指標(biāo)，以592 bp β-actin為內(nèi)參，進(jìn)行缺氧處理和正常培養(yǎng)MSCs的上述目的基因檢測(cè)。結(jié)果表明，VEGF、bFGF、TGF-β、IL-1α在缺氧處理的MSCs中有程度不同的表達(dá)，其中 IL-1α和 TGF-β表達(dá)較強(qiáng)，VEGF、bFGF表達(dá)增強(qiáng)；而正常培養(yǎng)的MSCs中，IL-1α未表達(dá)，VEGF、bFGF、TGF-β表達(dá)微弱（圖6，7）。

表1　引物序列Table 1　Primer sequence

圖1　倒置相差顯微鏡下原代接種24 h的MSCs（100×）Fig.1　P0 MSCs after 24 hours under inverted microscope(100×)

圖2　MSCs流式細(xì)胞學(xué)鑒定Fig.2　Identification of MSCs by flow cytometry

圖3?、蜃用庖呓M化染色（100×）Fig.3　Immunohistochemical staining of Ⅷfactor(100×)

圖4　Flk-1免疫熒光（100×）Fig.4　Immunofluorescence staining of Flk-1(100×)

圖5　雙熒光染色（100×）Fig.5　Double immunofluorescence staining(100×)

A：IL-1α；B：β-actin圖6　IL-1α在缺氧和未缺氧MSCs的表達(dá)Fig.6　Expression of IL-1α in MSCs under hypoxia and normaxia

圖7　TGF-β、VEGF和bFGF在缺氧和未缺氧MSCs的表達(dá)Fig.7　TGF-β,VEGF and bFGF in MSCs under hypoxia and normaxia

3　討論

目前，組織修復(fù)方法有很多，包括干細(xì)胞移植、生長(zhǎng)因子修復(fù)、基因治療、激光物理治療和生物材料修復(fù)等多種方法。近年來(lái)，MSCs因其來(lái)源廣泛、獲取便利、擴(kuò)增迅速、高可塑性等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于各種損傷組織的修復(fù)。Ichioka等[6]將BMSCs于術(shù)后即刻皮下注射至小鼠背部任意皮瓣，隨后制造缺血再灌注模型，7 d后皮瓣的成活面積明顯增加，皮下、肌肉層下的肉芽組織厚度增加，熒光顯微鏡下觀察到移植的細(xì)胞出現(xiàn)在血管壁結(jié)構(gòu)中。Kobayashi等[7]發(fā)現(xiàn)，BMSCs移植到鼠心肌缺血模型后，可分泌多種促血管生成因子并向內(nèi)皮細(xì)胞分化，表明MSCs移植后可有效抑制損傷組織細(xì)胞凋亡、刺激細(xì)胞增殖和促進(jìn)微血管再生。

利用MSCs移植修復(fù)成功的關(guān)鍵包含許多因素，其中損傷部位的微環(huán)境尤為重要，包括損傷部位生長(zhǎng)因子的分泌、血液循環(huán)、滲透壓和氧濃度等[8]。從生命起源、胚胎發(fā)育過(guò)程來(lái)看，MSCs均是在低氧（相對(duì)體外環(huán)境）微環(huán)境中生存的，所以細(xì)胞在體內(nèi)的氧張力是低于大氣中的氧張力的，同時(shí)機(jī)體病理狀態(tài)下組織氧張力將更低。一方面，缺血缺氧條件下，由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣的供給不足，會(huì)導(dǎo)致MSCs死亡和移植治療的失敗[9]，另一方面，近20年來(lái)，越來(lái)越多研究發(fā)現(xiàn)，低氧培養(yǎng)下的MSCs細(xì)胞增殖速率加快[10]，凋亡率降低，細(xì)胞遷移速度加快。目前，多認(rèn)為低氧環(huán)境是通過(guò)調(diào)控缺氧誘導(dǎo)因子（HIFs）來(lái)影響細(xì)胞生長(zhǎng)、生存、分化、增殖、凋亡等[11]。研究顯示，低氧處理后的MSCs用于治療損傷的腸上皮細(xì)胞時(shí)，可增加其生存及增殖能力[12]。Forte等[13]發(fā)現(xiàn)，在低氧環(huán)境下，MSCs可激活cMet蛋白，通過(guò)介導(dǎo)肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子，激活ERK1/2、p38有絲分裂原激活蛋白酶及PI3K/Akt信號(hào)通路，增強(qiáng)組織再生能力。Tawa等[14]發(fā)現(xiàn)，缺氧環(huán)境下MSCs可通過(guò)缺氧誘導(dǎo)因子（Hypoxia-inducible factor，HIF）增加血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)來(lái)促進(jìn)血管生成。這些均說(shuō)明MSCs在低氧條件下被應(yīng)用于組織修復(fù)時(shí)，不僅使得自身增殖能力增加，并可促進(jìn)血管新生。同時(shí)，低氧也是血管生成的重要誘因之一[15]，表現(xiàn)為細(xì)胞的增殖能力增強(qiáng)，同樣培養(yǎng)時(shí)間下，細(xì)胞數(shù)量較正常高一倍左右；趨化和移行能力增強(qiáng)；成血管功能增強(qiáng)等[16]。

低氧培養(yǎng)的MSCs使得損傷部位局部血管化增強(qiáng)的同時(shí)，與血管形成相關(guān)的生長(zhǎng)因子必然會(huì)有所改變。免疫組化及免疫熒光發(fā)現(xiàn)，缺氧處理24 h的 MSCs，其Ⅷ因子及Flk-1表達(dá)陽(yáng)性。Flk-1也被稱為VEGFR-2（Vascular endothelial growth factor receptor），是一種Ⅲ型跨膜蛋白激酶，屬于酪氨酸激酶受體，主要表達(dá)在血管內(nèi)皮細(xì)胞上，介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。Vladau等[17]通過(guò)抑制VEGF/VEGER作用，發(fā)現(xiàn)牙周組織血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量減少，血管密度降低，損傷加重。Shalaby等[18]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)lk-1基因敲除小鼠由于造血和血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)育的缺陷，死于胚胎發(fā)育的8.0～8.5 d，均提示Flk-1對(duì)于血管內(nèi)皮細(xì)胞的分化和增殖是必不可少的。Ⅷ因子是由內(nèi)皮細(xì)胞分泌的凝血因子，也可作為內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)志物，兩者陽(yáng)性表達(dá)說(shuō)明MSCs在缺氧的狀態(tài)下有向內(nèi)皮細(xì)胞，特別是血管內(nèi)皮轉(zhuǎn)化的趨勢(shì)。內(nèi)皮祖細(xì)胞吞噬低密度脂蛋白（ac-LDL）是其重要的生物學(xué)功能之一，既往研究常以吞噬Dil標(biāo)記乙?；兔芏戎鞍啄芰ψ鳛殍b定內(nèi)皮祖細(xì)胞的一個(gè)重要指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)中，Dilac-LDL和FITC-UEA-1雙熒光染色發(fā)現(xiàn)，缺氧處理的MSCs很多表現(xiàn)為雙熒光染色陽(yáng)性，說(shuō)明其在缺氧狀態(tài)下很可能向內(nèi)皮細(xì)胞或者內(nèi)皮祖細(xì)胞轉(zhuǎn)化。

VEGF是目前公認(rèn)的最具特異性，且作用最強(qiáng)的內(nèi)源性血管生成因子，它必須與受體結(jié)合，才能實(shí)現(xiàn)其促血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂的作用。在體外，VEGF是強(qiáng)有力的內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂原，在培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞中，VEGF可激動(dòng)磷脂酶C、誘導(dǎo)Ca2+水平上調(diào)，刺激內(nèi)皮細(xì)胞釋放von Willebrand因子，誘導(dǎo)組織對(duì)VEGF的活性表達(dá)。VEGF的分泌還影響血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖及毛細(xì)血管網(wǎng)的形成。RTPCR發(fā)現(xiàn)，VEGF表達(dá)增加，作為血管化最具有代表性的因子，說(shuō)明缺氧處理后的MSCs可使得組織血管化作用增強(qiáng)。有研究表明，MSCs移植可以上調(diào)局部VEGF的表達(dá)，VEGF水平上調(diào)可直接刺激內(nèi)皮細(xì)胞的擴(kuò)增與分化。目前已證實(shí)，VEGF主要通過(guò)VEGF受體2（即Flk-1）促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的移行能力，而低氧可增加內(nèi)皮細(xì)胞的Flk-1表達(dá)[19]。研究發(fā)現(xiàn)，利用20%胎牛血清和5%O2培養(yǎng)MSCs后，其表達(dá)的VEGF-A增加，這和我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。VEGF表達(dá)的增強(qiáng)可進(jìn)一步刺激內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)，促進(jìn)新生血管生成，有利于損傷和疾病恢復(fù)。但是，也有報(bào)道認(rèn)為，單純使用VEGF或VEGF基因治療可能引起血管通透性增加、下肢水腫或局部血管過(guò)度增生等。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在缺氧刺激下，MSCs的TGF-β的mRNA表達(dá)上調(diào)明顯。TGF-β不僅對(duì)血管新生和組織創(chuàng)傷有重大意義，還抑制T細(xì)胞活化，減輕免疫反應(yīng)。Sanchez-Elsner等[20]發(fā)現(xiàn)，低氧環(huán)境下TGF-β可協(xié)同VEGF的表達(dá)來(lái)刺激血管生成。所以缺氧很可能通過(guò)刺激TGF-β和VEGF的表達(dá)，增加兩者間的協(xié)調(diào)作用來(lái)加強(qiáng)血管化作用。將臍帶來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞在缺氧條件下培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)TGF-β表達(dá)也增強(qiáng)[21]，與我們的結(jié)果是一致的。我們認(rèn)為，經(jīng)缺氧處理后的MSCs的TGF-β表達(dá)增加可以促進(jìn)組織損傷的血液循環(huán)，治療與缺血相關(guān)的疾病。

同時(shí)，IL-1α也明顯上調(diào)。IL-1是一種強(qiáng)烈的促炎細(xì)胞因子，除調(diào)節(jié)T細(xì)胞和B細(xì)胞介導(dǎo)的免疫功能外，還作用于中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞，在炎癥反應(yīng)和炎癥損傷中起著重要作用，炎癥反應(yīng)或炎癥損傷可誘使組織自身合成IL-1，通過(guò)自分泌或旁分泌的形式，使組織損傷加重。但I(xiàn)L-1還是重要的調(diào)節(jié)因子，可同時(shí)調(diào)節(jié)其他生長(zhǎng)因子的表達(dá)。因此，IL-1在損傷中的作用可能是雙向性的。研究發(fā)現(xiàn)，IL-1α可通過(guò)刺激炎癥細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的VEGF-VEGFR-2信號(hào)通路誘發(fā)血管形成，表明其自身主要作用是增加炎癥反應(yīng)，但同時(shí)可通過(guò)調(diào)節(jié)其他因子來(lái)誘發(fā)血管形成。利用低氧培養(yǎng)的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)小鼠后肢缺血肌肉時(shí)，發(fā)現(xiàn)炎癥因子IL-1、IL-12減少，說(shuō)明IL-1的變化可能與細(xì)胞的培養(yǎng)方式，低氧處理時(shí)間長(zhǎng)短，體內(nèi)外環(huán)境的不同或者細(xì)胞來(lái)源有關(guān)。

將MSCs移植在受損皮膚中，發(fā)現(xiàn)MSCs可分化為真皮成纖維細(xì)胞，或通過(guò)其合成、分泌促進(jìn)傷口愈合的細(xì)胞因子，如TGF-β和bFGF，然后合成膠原，通過(guò)其增殖、收縮等一系列活動(dòng)，促進(jìn)傷口愈合。另外，人們應(yīng)用bFGF可以促進(jìn)缺血皮瓣的血管生長(zhǎng)，增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)缺血缺氧的耐受，減輕皮瓣的缺血再灌注損傷。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，其表達(dá)增強(qiáng)，說(shuō)明bFGF在低氧條件下的表達(dá)升高可以刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和管腔形成，Naaldijik等[22]還發(fā)現(xiàn)bFGF可促進(jìn)低氧培養(yǎng)下MSCs的細(xì)胞遷移。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)缺氧處理后的MSCs有向血管內(nèi)皮細(xì)胞或者內(nèi)皮祖細(xì)胞分化的趨勢(shì)；另外，缺氧可刺激MSCs的VEGF、bFGF、TGF-β和IL-1α的表達(dá)，表明缺氧處理后的MSCs可通過(guò)上調(diào)血管因子的表達(dá)，來(lái)促進(jìn)損傷組織血管化的形成，提高了組織對(duì)缺血的耐受能力，有利于組織損傷的修復(fù)及缺血缺氧相關(guān)疾病的治療。

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【中圖分類號(hào)】Q813.1+1

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1673－0364（2016）03－0147－05

doi:10.3969/j.issn.1673-0364.2016.03.001

作者單位：200011上海市上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院整復(fù)外科；上海市組織工程研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

通訊作者：余東（E-mail：drxuliang@126.com）。血缺氧環(huán)境并不利于MSCs的存活和修復(fù)。目前，大量研究證實(shí)，缺氧條件下培養(yǎng)的MSCs，其分化、增殖、遷移功能均可增強(qiáng)，并可促進(jìn)損傷組織血管生長(zhǎng)。所以，MSC移植后修復(fù)損傷部位的成功率與其低氧環(huán)境密切相關(guān)[5]。為明確MSCs在缺血缺氧環(huán)境中發(fā)生的改變，本實(shí)驗(yàn)將MSCs在體外進(jìn)行缺氧處理，觀察其細(xì)胞生物學(xué)特性，然后對(duì)相關(guān)生長(zhǎng)因子進(jìn)行檢測(cè)，旨在發(fā)現(xiàn)MSCs在缺血缺氧環(huán)境刺激下的細(xì)胞特性，以及分泌相關(guān)因子的改變，為臨床修復(fù)組織損傷及治療缺血缺氧性疾病提供依據(jù)。

The Gene Differential Expression of Mesenchymal Stem Cells Under Hypoxia

XU Liang,BAI Shanshan,DUAN Huichuan,YU Dong.Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai Key Laboratory of Tissue Engineering,Shanghai 200011,China.Corresponding authors:YU Dong(E-mail:drxuliang@126.com).

【Abstract】ObjectiveTo investigate the biological characteristics and related factors of mesenchymal stem cells(MSCs) under hypoxia and to extend the knowledge for repairing clinical tissue injury.MethodsMSCs were cultured and exposed to the hypoxic condition in vitro.The cell properties were observed by immunofluorescence staining,RT-PCR were performed to investigate the expression of VEGF、bFGF、TGF-β and IL-1α,in order to explore the changes of MSCs under hypoxia from the aspects of cell differentiation,related factors and cell signaling pathways.ResultsCultured under hypoxia for 24 hours,cells were observed under inverted microscope and survived well,and no significant changes of cell morphology and growth patterns were observed.Immunofluorescence and double immunofluorescence staining found out there was a tendency that MSCs cultured in hypoxia transform into endothelial cells,particularly vascular endothelial cells.The expression of VEGF,bFGF,TGF-β and IL-1α were all up-regulated in MSCs exposed to the hypoxic condition,but a weak expression in MSCs cultured in normoxia.ConclusionUnder the hypoxic condition,MSCs can differentiate into vascular endothelial cell, and expression of factors VEGF,bFGF,TGF-β and IL-1α,which can enhance the formation and growth of vascular,are all up-regulated,directly or indirectly accelerate the vascularization in tissue injury.

【Key words】Mesenchymal stem cells;Gene expression;Vascularization;Hypoxia