利用CAPS初步定位甜瓜MR—1白粉病抗性基因

艾子凌++高鵬++杜黎黎++欒非時

摘要：從國際生理小種鑒別寄主中選取甜瓜抗病自交系MR-1為母本，感病自交系Topmark為父本，構建F2代群體。對354株F2代群體進行田間甜瓜白粉病抗病性調查并分析其遺傳規(guī)律，發(fā)現甜瓜白粉病的抗性基因為單顯性基因；根據兩親本基因組重測序數據，自行開發(fā)設計CAPS分子標記，將具有多態(tài)性的標記應用于F2代基因分型以構建遺傳連鎖圖譜。圖譜內含142個CAPS標記，分布于12個連鎖群上。圖譜總長度2 065.47 cM，平均距離14.55 cM；標記最多的為第四連鎖群，分布22個標記，標記間平均距離為11.61 cM；最長的為第五連鎖群，總長277.98 cM；最短的為第三連鎖群，總長65.6 cM。得到1個甜瓜白粉病抗性相關基因位點，該位點在第七連鎖群上，位于CAPS標記7-4E和7-1H之間。

關鍵詞：甜瓜；白粉??；生理小種；CAPS；遺傳圖譜

中圖分類號： S436.5文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）06-0066-05

收稿日期：2015-03-11

基金項目：國家自然科學基金（編號：31301791）；農業(yè)部“948”項目（編號：2014-S15）。

作者簡介：艾子凌（1988—），女，黑龍江齊齊哈爾人，碩士研究生，主要從事甜瓜分子育種。 E-mail：linglingfighting@126.com。

通信作者：欒非時，教授，博士生導師，主要從事西甜瓜分子遺傳育種。 E-mail：luanfeishi@sina.com。甜瓜白粉病別稱白毛病、粉霉病，常在坐果期發(fā)生，是一種世界性病害，嚴重威脅葫蘆科作物生長[1]。病菌侵染到葉片表面，起初葉片上只是有水滴大小的白色圓形粉狀霉點，在高溫潮濕的環(huán)境里迅速布滿葉片，蔓延至葉柄、莖蔓，濃厚的白粉菌不僅降低感病植株的光合效能，還能增加植株的蒸騰效能，長時間呼吸作用強于光合作用導致植株萎黃干枯，提早衰亡，嚴重影響甜瓜產量和品質[2]。甜瓜白粉病致病菌有3個屬，6個種，瓜單囊殼白粉菌分化出生理小種0、1、2（2U.S、2France）、3、4、5[3]、6、7、N3和N4[4]；二孢白粉菌衍生出生理小種0和生理小種1[5]。諸多病原菌僅僅依靠化學制劑已不能根除白粉病，且隨著時間增長病原菌已產生耐藥性，即使加大用藥劑量也難以獲得好的效果，這對甜瓜白粉病防治工作造成了極大的困難[6]。面對白粉病對甜瓜造成的重大危害，外界施藥又困難重重，培育抗病新品種成為杜絕白粉病的不二方法。然而傳統(tǒng)的育種方法極易受環(huán)境因素、基因表達、基因顯隱性、目標基因與不利基因的連鎖等影響，使得育種周期長，選擇目標性狀困難，很難培育出優(yōu)良品種[7-8]。分子標記輔助育種可以有針對性的培育出所含目標性狀的新品種，首先要明確致病菌類型研究抗病規(guī)律進而獲得抗病基因 [9]。本試驗以甜瓜高抗白粉病品系MR-1（P1）和甜瓜高感白粉病品系Topmark（P2）為親本配制雜交組合，探索抗源MR-1對瓜單囊殼白粉菌生理小種1的抗性遺傳規(guī)律。以F2群體為作圖群體，利用CAPS技術，定位抗性基因，為甜瓜抗白粉病基因的精細定位和分子克隆奠定基礎。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1供試甜瓜品種試驗所用母本為抗性材料MR-1，對白粉病菌不同的生理小種普遍具有抗性，父本Topmark為感病材料，不含抗病基因。采用國際通用13個生理小種的鑒別寄主，分別是PMR45、Topmark、PI124111、IranH、PI24112、MR-1、Nantais Oblong、Edisto47、PI414723、WMR29、PMR5、PMR6、Vedrantais。

1.1.2供試菌株2013年7月采集于東北農業(yè)大學實驗基地感白粉病嚴重的葫蘆科病葉，隔離保存菌株并對病原菌進行顯微鏡鏡檢，確定病原菌類型。將菌株接種到感病植株上進行純化后接種到13個鑒別寄主上鑒定生理小種。

1.2田間試驗

1.2.1田間試驗設計2013年3月將6世代群體浸種，催芽，單粒播種于缽中。5月將20株長勢良好的MR-1（P1）、Topmark（P2）、F1，100株BC1P1（F1與P1回交），100株BC1P2（F1與P2回交）及354株F2代定植于東北農業(yè)大學香坊農場5號溫室中，株行距50 cm×80 cm，待植株長到3葉1心時去掉生長點，采取雙蔓綁枝法將植株吊起，施肥、殺蟲、灌溉等進行日常田間管理。2013年夏季將鑒別寄主播種在 8 cm×8 cm 的營養(yǎng)缽中，采用對角線種植。收集充分發(fā)病的葫蘆科蔬菜病葉，輕輕抖下白粉病菌進行純化配制菌液，噴霧接種到13個鑒別寄主上，設 3次重復，1次重復10株。

1.2.2田間接種試驗采用風媒接種法，即模仿田間自然發(fā)病條件，在高溫高濕下白粉病病原菌最易侵染甜瓜，將其他溫室成株期充分發(fā)病的甜瓜品種移植到試驗溫室中，白粉病菌的分生孢子隨著空氣從發(fā)病植株落到需要進行抗病調查6世代群體上，達到接種目的。為確保高溫高濕條件，白天在溫室地面上多次澆水，適時封閉溫室[10]。

1.2.3田間調查試驗白粉病調查方法依照《中國蔬菜病蟲預測預報》，根據感染程度即葉面菌落多少進行分級，共分6級。6世代群體每株由下而上調查10張葉片記錄病級。按病情指數（DI）=∑ [（病級的代表值該病發(fā)病葉片數）/（調查單株總葉片數×最高病級的代表值）]×100計算病情指數。根據病指（DI）確定父本、母本、F1、F2、BC1P1、BC1P2的抗感表現型。將病情指數小于等于11.11定義為抗病，病情指數大于11.11定義為感?。ū?）。

參照上述方法記錄鑒別寄主5張葉片的病級，計算病情指數，對照表2的抗感反應，確定試驗地的優(yōu)勢生理小種。

1.3CAPS分子標記

1.3.1CAPS引物開發(fā)CAPS標記的開發(fā)以2個親本材料的基因組重測序數據為依據，以已經發(fā)布的甜瓜基因組數據為參考，自編perl語言腳本提取位于SNP 位點前后約500 bp的片段序列作為候選SNP位點序列。通過SNP2CAPS軟件分析酶切位點信息，在候選SNP序列中篩選存在CAPS突變的位點，用4種不同的限制性內切酶（EcoRⅠ、HindⅢ、 PstⅠ和BamHⅠ）設計引物進行酶切驗證。在甜瓜基因組的每條染色體上平均選取30～40個存在CAPS 位點的序列，用Primer 5軟件設計引物[11]，控制退火溫度55～58 ℃，G+C比例在40%～60%，得到長度為19～25 bp的引物。（M/A）酶切位點所在連鎖群號+引物編號+酶簡寫進行引物命名。

1.3.2CAPS引物篩選CAPS標記 PCR反應體系（20μL）：2.0 μL模版DNA，2.0 μL引物，0.3 μL dNTPs，0.2 μL Taq酶，13.5 μL ddH2O，2.0 μL 10×Buffer。

采用梯度PCR反應程序，即94 ℃預變性7 min；94 ℃變性 20 s，60 ℃退火 20 s，72 ℃延伸 30 s；30 個循環(huán)，每個循環(huán)降 0.5 ℃；94 ℃變性 20 s，45 ℃退火20 s，72 ℃延伸 30 s，10個循環(huán)；72 ℃延伸 7 min，4 ℃保存[12]。酶切體系是1 μL 限制性內切酶緩沖液，0.5 μL 限制性內切酶（10 U/μL，THERMO），9 μL 超純水，PCR 擴增產物5 μL，37 ℃水浴 2 h。酶切產物用1%瓊脂糖凝膠在250 V高壓下電泳，25～35 min后紫外照射凝膠拍照。

1.3.3F2群體分子數據記錄分析F2群體擴增的CAPS 條帶和白粉病抗性基因之間的遺傳關系，同P1帶型一致的標記記為2，同P2的帶型一致的標記記為0，同F1帶型一致的則記為1，缺失或者模糊不清楚的帶型記作-1，將所有條帶類型記錄在Microsoft Excel 2003。

1.3.4遺傳圖譜構建利用QTL IciMapping 4.0對具有多態(tài)性且應用到F2代基因分型的分子標記進行遺傳圖譜構建并分析，用“map”命令打開記錄F2代條帶類型的表格，設定LOD值為3.0，使用完備區(qū)間作圖（ICIM）構建遺傳連鎖圖譜。利用MapChart 2.2 繪制遺傳連鎖圖譜，根據CAPS標記在染色體上的位置，依次將連鎖群命名為LG1～LG12。

2結果與分析

2.1白粉病抗性調查

顯微鏡觀察白粉病病原菌無性世代，均觀察到有纖維狀體，證實致病白粉病菌是P. xanthii。對13個鑒別寄主的抗病調查發(fā)現，8種鑒別寄主在不同程度上表現為抗病，分別是PMR45、PMR5、WMR29、Edisto47、PI124111、PI124112、PMR6和MR-1。其余5個鑒別寄主均表現為感病，說明試驗地的優(yōu)勢小種是生理小種1。

F1代植株表現出與母本性狀相似的抗性性狀，對354株F2代進行田間抗病性調查，發(fā)現其中30株F2免疫、212株高抗、62株中抗、14株抗病、13株感病、5株中感和2株高感。計算統(tǒng)計得到抗病植株為268株、感病86株，抗病 ∶ 感病=3.12，符合3 ∶ 1的分離比例，F1全部抗病，BC1P1抗病，BC1P2感病 ∶ 抗病=1 ∶ 1。通過F2代群體中白粉病病情指數在群體中的頻次分布圖可以發(fā)現，F2代群體的354個單株中，表現出明顯的偏分離，大部分單株偏向于低值病情指數，病情指數11.11時可以將F2代群體明顯地分為抗病和感病2類。病情指數為31.057～40.613時，存在小峰分布，證明還存在一些微效基因與抗白粉病基因連鎖。證明甜瓜抗白粉病基因由顯性單基因控制并同時受到微效基因調控。調查分級結果為質量性狀（圖1）。用Excel繪制的病情指數頻次分布圖見圖2。

2.2CAPS標記多態(tài)性

用Primer5設計并選用316對CAPS引物，對兩親本進行擴增篩選，共篩選出在親本間有多態(tài)性的CAPS引物157對，多態(tài)率為49.80%。其中帶型清晰用于構建圖譜的標記有142個，分布在1號連鎖群上的標記14個，2號連鎖群13個，3號連鎖群8個，4號連鎖群22個，5號連鎖群15個，6號連鎖群14個，7號連鎖群10個，8號連鎖群9個，9號連鎖群8個，10號連鎖群9個，11號連鎖群10個，12號連鎖群10個。部分篩選引物見圖3。具有多態(tài)性引物對F2群體基因型檢測見圖4。

2.3連鎖圖譜構建與基因定位

運用QTL IciMapping軟件在LOD值≥3的條件下對 142個多態(tài)性標記進行連鎖分析，獲得一張包含有142個CAPS標記、覆蓋12個連鎖群的遺傳連鎖圖譜（圖5）。圖譜總長度2 065.47 cM，圖譜標記平均距離14.55 cM。含標記最多的為第四連鎖群，分布22個標記，標記間平均距離為 11.61 cM。最長的為第五連鎖群，總長277.98 cM，最短的為第三連鎖群，總長65.6 cM。甜瓜CAPS引物在連鎖群上呈均勻分布。結合田間數據分析發(fā)現，在第七連鎖群與抗白粉病緊密相關的位點，距離上端7-4E標記17.00 cM，距離下端 7-1H標記12.35 cM。

3結論與討論

3.1接種方法

試驗群體采用風媒接種法模仿自然發(fā)病，不僅大大降低了工作量，而且能真實反映植株對白粉病的抗性程度，對鑒別寄主接種采用孢子懸浮液噴霧法是為了使鑒別寄主快速感染白粉病進行鑒別，避免因枯萎病等其他病菌侵染植株成為主要病菌而不感染白粉病的發(fā)生。

3.2生理小種的鑒定

甜瓜是否感染白粉病很大程度上受環(huán)境影響，地點不同、種植季節(jié)不同都會影響植株是否感病及感病程度，盛夏及秋季種植的甜瓜感病概率及程度遠遠高于春季栽培的甜瓜；覆蓋物過厚潛在地加大甜瓜周圍環(huán)境濕度，使甜瓜更易感病；菌液不純含有其他病菌使供試植株不感白粉病而感染其他病。試驗嚴格執(zhí)行采集、純化及接種步驟，依照病級分類標準對試驗中侵染的生理小種進行鑒別，結果準確可靠。在鑒定生理小種時，為防止空間差異影響植株感病試驗采用對角線位置種植，設置重復使調查結果準確。

3.3CAPS標記

目前，SRAP、AFLP、SSR作為甜瓜抗病育種常用的標記方法。CAPS為酶切擴增多態(tài)性序列技術，即在已知 DNA序列兩端設計引物進行PCR擴增，用限制性內切酶切割特異序列，得到大小不一的DNA片段，用瓊脂糖電泳分析產物片段，即可區(qū)分基因型。CAPS相對RFLP操作簡便、酶切多態(tài)性高；相對RAPD穩(wěn)定性、可靠性、重復性強；相對AFLP工作量小，統(tǒng)計條帶容易；相對SSRs引物設計容易。CAPS對DNA濃度及純度要求不高，大大減少了對F2代DNA的提取。試驗對重測序的兩親本開發(fā)CAPS標記使得引物更有針對性，設計的CAPS引物具有在基因組上的座位號，便于在基因組層面上對各個標記進行定位，遺傳圖譜中的連鎖群代號就是染色體順序。

3.4連鎖圖譜與基因定位

本試驗用CAPS分子標記構建甜瓜抗白粉病基因遺傳連鎖圖譜在世界范圍內都很罕見。在全基因組測序的基礎上，有針對性地自行開發(fā)設計引物，結合田間調查結果發(fā)現MR-1 對瓜單囊殼白粉菌生理小種1的抗性基因是單顯性基因，與Jagger等的研究結論[13-15]一致。試驗群體數量足夠大，但標記數量還有待增多。Wang等對Ano2 × Hami413 和Ano2 × Queen 2組雜交組合得到的F2代，構建出2張遺傳連鎖圖譜，包括SSR標記、GRA標記和AFLP標記，結合分離群體分組分析法（BSA）和比較基因組學（RGA），在抗病材料Ano2中定位出抗病基因Pm-AN，該基因在RPW 和 MRGH63B 2個標記中間 [16]。王建設以1A151（抗）×恒進紅瓤酥（感）構建6世代群體，運用RAPD分子標記結合抗性遺傳分析找到1個由1對不完全顯性抗病基因控制的抗病位點RAPD-S329，其遺傳距離為（6.81±l.67） cM[17]。Yuste-Lisbona等利用AFLP對抗病材料TGR-1551和感病材料 Bola de Oro配制雜交組合構建分子標記體系，構建出1張包含14個連鎖群的遺傳圖譜，發(fā)現主效QTL位點Pm-R在第五連鎖群上[18]。Teixeira等使用AFLP法找到與抗病基因Pm-1距離為4.9 cM的分子標記M75/H35_155，所用抗病材料為 AF426-R [19]。Fukino等為比較甜瓜生長在子葉和第一片真葉期，pxA、pxB 2種白粉病菌株對其是否發(fā)病產生不同影響，利用高抗AR5和高感Harukei配制重組自交系，用157個SSR標記和7 個SCARs/CAPSs標記構建遺傳圖譜，檢測QTL位點[20]。Liu等在抗性材料PI 134198中發(fā)現了1個單顯性抗性基因，并且在距離該基因3.9 cM處獲得了1個SRAP標記[21]。Ning等用抗病材料Edisto47和感病材料Queen構建BC1群體，發(fā)現抗病基因Pm-Edisto47-1在SSR標記CMGA36 和 SSR252089之間，與兩標記距離均為 2.1 cM[22]。由此可見使用抗病材料不同也會導致抗病位點不同。

研究發(fā)現試驗材料MR-1所含有的甜瓜白粉病基因為單顯性基因。通過對MR-1×Topmark所構建的F2代群體進行分析，共檢測到1個與白粉病抗性有關的位點，位于7號染色體上，距離上端7-4E標記17.00 cM，距離下端7-1H標記12.35 cM，為今后甜瓜白粉病抗性基因的精細定位及克隆奠定了基礎。

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